慢性刺激在收缩活动性大鼠骨骼肌表型适应性研究中的应用

本议定书描述的使用慢性收缩活动模型的运动, 观察刺激诱导骨骼肌适应在大鼠后肢。

运动的慢性收缩活动模型可用于研究骨骼肌对体内运动训练刺激的适应。特别是，该模型在 7 天内引发了为期 6 周的训练方案的表型适应。这种方法可以帮助回答肌肉生理学领域的关键问题，如线粒体生物发生、自噬和许多其他与运动相关的细胞适应。

与其他需要几个月的运动训练方案相比，这种技术的主要优点是它允许在 7 天的短时间内观察肌肉特异性适应。这项技术的影响延伸到肌肉萎缩年龄的治疗，因为慢性肌肉刺激已被证明对改善与衰老相关的肌肉无力有影响。通常，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为难以标记腓总神经并在两端连接电线圈，因为这些需要练习和精确。

首先在吸氧 1% 至 3% 异氟醚下麻醉大鼠，并通过检查对后肢脚趾捏的反应并观察呼吸深度和频率来确认完全镇静。在眼睛上涂抹眼部润滑剂以避免干燥，并将大鼠放在中低档的加热垫上。轻轻剃掉左后肢以及从脖子后部开始、前肢后面和前胸的躯干周围的一条条带。

用碘酒和乙醇轻轻擦拭剃须区域进行消毒。将动物趴在地上，使用带有 10 号刀片的无菌手术刀在剃光区域中心的脖子后部切开约 0.5 厘米的小切口。然后将动物滚动到右侧，在膝关节凹陷之间和靠近尾巴起点之间的左后肢皮肤上切开两到三厘米。

使用钝尖弯曲的手术剪刀将皮下区域解剖至 3.5 至 4 厘米左右，将皮肤与下面的肌肉分开，在开放的皮肤和下面的肌肉之间形成一个口袋。接下来，使用手术剪刀在股二头肌上切一个小于 0.5 厘米的小切口，确保剪刀的尖端直接穿过肌肉向下切割。然后轻轻打开切口区域，直到可以看到内部肌肉群和腓总神经。

请格外小心，以免割伤或损伤神经。接下来，准备 50 到 60 厘米的 PTFE 涂层细不锈钢丝并将其对折。将电线的折叠部分钩入 30 厘米不锈钢棒的狭缝中。

使用杆将金属丝穿过后肢的开放口袋，沿着腿部向上，沿着背部中心呈 L 形，到达脖子后面的小切口区域。用金属牵开器将其拉开，直到窗户的大小约为 1.5 平方厘米，腓神经位于窗户中央，从而固定窗户。使用手术刀小心地将电线的末端剥去 1.5 厘米。

将剥去的电线末端缠绕在钝的 21 号针头上五次以形成线圈。正确制作线圈后，从中松开针头。在弹簧圈的最末端打一个结，并在神经的左侧缝合，确保弹簧圈距离神经 1.5 至 2.5 毫米。

要固定线圈，请沿线圈再缝合两到三条。此步骤需要大量的练习和耐心，以避免损伤神经和底层肌肉，并在所有动物中实现所有一致的刺激条件。最好让一名熟练的研究人员完成研究期间的所有外科手术。

涂抹两到三滴抗生素溶液，然后用 5-0 号真丝小心缝合窗户。松散地缠绕剩余的松弛的金属丝，然后推入臀部上方股二头肌缝合切口上方的皮下口袋。涂抹 2 到 3 滴抗生素溶液，并通过缝合闭合开放的皮肤。

接下来，将动物移动到胸骨位置，剪断从颈部顶部切口伸出的线环，形成两个线端。使用手术刀将电线末端剥去 0.5 厘米。剪掉任何磨损的电线。

慢慢地将电线的剥皮部分推入 pin sockets 的孔中，并使用烙铁将电线焊接在 pin sockets 上。将针连接线的末端穿过 4.4 厘米的无菌纱布垫。然后将电线穿过刺激器盒底部的孔。

将针插入 CCA 单元上的连接插座中。使用粘性粘性将 CCA 装置轻轻放入腔室中，以将 CCA 单元固定在腔室底部。使用运动胶带或多孔手术胶带固定剃光躯干周围的腔室。

用三层胶带封闭腔室的顶部。最后在刺激器盒的侧面缠绕胶带以固定盒子。通过将设备暴露在便携式红外频闪灯发出的单脉冲红外光下来检查 CCA 是否正常工作。

如果 CCA 正常工作，后肢肌肉会因红外光而收缩。在开始 CCA 程序前不久对动物进行称重，以记录基线测量值，以帮助识别 CCA 程序后体重变化引起的任何严重压力或不利影响。在 CCA 刺激当天，通过便携式红外频闪灯将刺激器单元暴露在单脉冲红外光下，打开 CCA，并施加 3 或 6 小时的 10 赫兹 CCA 刺激。

每 30 到 60 分钟检查一次刺激和动物。在所需的 CCA 周期之后，通过红外光照射关闭 CCA 装置。与未刺激的对侧后肢相比，每天 6 小时的 CCA 7 天的大鼠在受刺激的肌肉中显示出增强的线粒体生物发生。

线粒体生物发生的这种增加表现为 PGC-1 α 蛋白表达增加。检查透化肌纤维以测量线粒体呼吸能力表明，CCA 导致肌肉相对于对照肌的最大呼吸能力增加。与对照组未刺激的肌肉相比，CCA 7 天后肌膜下线粒体和肌原纤维间线粒体种群均增加。

对自噬和溶酶体系统的适应也可以由 CCA 引起。在 CCA 后的所有时间点都观察到转录因子 EB 的蛋白质丰度增加，转录因子 EB 是溶酶体生物发生的主要调节因子。在此程序之后，可以进行其他方法，如一般皮下或腹膜内注射，以回答其他问题，例如秋水仙碱治疗对自噬通量的估计。

观看此视频后，您应该对如何应用当前的慢性收缩活动模型有很好的了解，以便检查耐力训练后的肌肉表型变化。