Name: 慢性刺激在收缩活动性大鼠骨骼肌表型适应性研究中的应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: 了解慢性收缩活动模型用于研究大鼠骨骼肌表型适应性。该方法通过电刺激腓总神经，在七天内观察线粒体生物发生和自噬等细胞适应性变化，为肌肉生理学研究提供快速有效的实验手段。

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我们感谢 Liam Tyron 对手稿的专家级审阅。本研究得到了加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）向 D. A. Hood 提供的资金支持。D. A. Hood 还担任加拿大细胞生理学研究讲席教授。

所有与动物相关的操作均经约克大学动物护理委员会审查并批准。大鼠抵达约克大学动物设施后，在手术前至少给予五天时间适应环境，并自由摄取食物。ad libitum。尽管该方案此前已应用于其他物种15,17,22，但本文特别基于Pette及其同事的开创性工作23，聚焦于大鼠模型。
1. 慢性收缩活性装置的制备
<ol>
	<li>使用电压表检测纽扣式锂电池的电压。 
	注意：每节电池的电压应为 3.0 ± 0.10 V。</li>
	<li>将两节或三节电池插入设备插槽中，使总电压达到 6 - 9 V。 
	注意：研究人员可根据实验需求自行决定在整个实验过程中维持 6 V 或 9 V 的电压。根据实验设计和所需刺激强度，可选择使用两节或三节电池。</li>
	<li>通过脉冲指示器验证设备是否正常工作，方法是将设备暴露于便携式红外闪光灯发出的 1 个脉冲下。</li>
</ol>
2. 慢性收缩活动的手术操作
注意：手术前应对所有手术器械进行灭菌处理。手术过程中及手术结束后，均需使用加热垫维持大鼠的体温。&#160;建议在手术铺巾上进行手术操作。术者应佩戴无菌外科手套和洁净的实验服。必要时，建议佩戴一次性呼吸防护口罩。
<ol>
	<li>使用气体挥发器系统，通过氧气携带1 - 3%异氟烷吸入麻醉大鼠。通过夹捏后肢脚趾以及观察呼吸深度和频率，确认动物已完全镇静。在眼睛上涂抹眼用润滑剂，防止角膜干燥。&#160;皮下注射美洛昔康（0.5 mg/mL），剂量为2 mg/kg。 
	注意：建议采用多模式镇痛方案（例如美洛昔康联合利多卡因），以最大程度减轻术中及术后可能产生的疼痛。</li>
	<li>轻柔地剃除左侧后肢的毛发，以及从颈背部沿前肢后方至前胸部的一条躯干区域。用碘伏和乙醇轻轻擦拭剃毛区域，进行消毒。</li>
	<li>将动物俯卧放置，在颈背部剃毛区域中央（肩胛骨之间可触及的部位）使用手术刀（10号刀片）做一个小切口（约0.5 cm）。</li>
	<li>定位腓总神经。
	<ol>
		<li>将动物翻转至右侧卧位，在左侧后肢皮肤上做一个长约2 - 3 cm的切口。切口位置应位于膝关节凹陷处与尾部起始处后方之间的股部上方肌群区域。 
		注意：改变动物体位时，注意避免污染第一个切口区域。</li>
		<li>使用钝头弯剪，在皮下组织广泛分离约3.5 - 4 cm，将皮肤与下方肌肉分开，形成一个位于切开皮肤与深层肌肉之间的皮下腔隙。围绕整个切口周缘（约1.5 cm2）将皮肤与下方组织完全分离。</li>
		<li>用手术剪在股二头肌上做一个小切口（小于0.5 cm），确保剪刀尖端垂直向下切割肌肉。</li>
		<li>轻柔地扩大切口区域，直至内部肌群和腓总神经清晰可见（浅层肌肉组织（即股二头肌）深度约为0.5 cm）。使用镊子轻触或轻夹可见的神经，观察目标肌群（例如胫前肌）及脚趾是否出现明显的背屈反应，以确认腓总神经已被成功分离。 
		注意：此步骤需极为谨慎，避免切割或损伤神经。</li>
		<li>使用金属牵开器将切口充分拉开固定，使窗口大小约为1.5 cm2，并将腓总神经置于窗口中央。使用连接在绑带和/或橡皮筋上的小型金属钩，将其固定于手术台面（或手术板）上（图2A）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将导线连接至神经两侧。
	<ol>
		<li>准备约50 - 60 cm长的聚四氟乙烯（PTFE）涂层细不锈钢导线，并将其对折。&#160; 
		注意：术前在紫外光下暴露PTFE涂层导线可能有助于操作。</li>
		<li>将导线对折端钩入一根30 cm长的不锈钢杆的狭缝中。将该杆连同导线以L形路径从后肢的皮下腔隙穿行至颈背部的小切口处，即沿腿部向上并沿背部中线前行。</li>
		<li>在后肢端找到导线的两个末端。由于所有导线均为PTFE绝缘，需进行剥线处理。使用手术刀小心剥除导线末端约1.5 cm的绝缘层。若导线出现散丝，应剪除后重新剥线。将裸露的导线末端缠绕在一根钝化的21号针头上（缠绕5圈），形成线圈。线圈制作完成后，将针头从中取出。</li>
		<li>使用6-0号外科缝线，将每个线圈固定于腓总神经的两侧（图2A）。
		<ol>
			<li>在线圈末端打结，并将其缝合在神经左侧，确保线圈与神经的距离保持在1.5 - 2.5 mm。</li>
			<li>为固定线圈，沿其长度方向再施加两到三针缝线加固。</li>
			<li>在神经右侧重复上述步骤。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>滴加2 - 3滴抗生素溶液（含氨苄青霉素的生理盐水；132 mg/mL），然后使用5-0号丝线仔细缝合窗口（即股二头肌组织）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将剩余的导线松弛部分 loosely 缠绕成约食指直径大小的线圈，推入股二头肌缝合切口上方的皮下腔隙内（大致位于髋部上方）。</li>
	<li>再次滴加2 - 3滴抗生素溶液（含氨苄青霉素的生理盐水；132 mg/mL），然后使用皮肤缝合钉闭合皮肤切口。</li>
	<li>将从颈部切口引出的导线连接至CCA刺激器。
	<ol>
		<li>将插针插座与导线连接。
		<ol>
			<li>剪断从颈部顶端切口引出的导线环，形成两个导线末端（分别连接至缝合在腓总神经两侧的线圈）。</li>
			<li>使用手术刀剥除导线末端约0.5 cm的绝缘层。如有散丝，应剪除。</li>
			<li>缓慢将裸露的导线端插入插针插座孔中，并使用电烙铁将导线焊接到插针插座上。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>可选：检查导线连接是否可靠。
		<ol>
			<li>通过鳄鱼夹将插针连接至大型台式刺激器。</li>
			<li>施加一个单脉冲（9 V，0.1 ms，10 Hz），确认胫前肌收缩且左足出现背屈。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将连接插针的导线穿过一块约4 cm × 4 cm的无菌纱布垫。</li>
		<li>将插针连接至CCA刺激器单元。
		<ol>
			<li>将导线穿过刺激器盒底部的孔洞。 
			注意：该盒子为自制的CCA刺激器腔室，尺寸为3.5 cm × 3.5 cm × 2.5 cm13。</li>
			<li>将插针插入CCA单元上的连接插座中。轻柔地将CCA单元放入腔室内，并使用黏性橡皮泥将其固定在腔室底部。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用运动胶带或透气手术胶带，将腔室固定于已剃毛的躯干周围。用三层胶带封闭腔室顶部，最后再用胶带缠绕刺激器盒侧面，确保装置牢固（图2B）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过便携式红外频闪灯发射单脉冲红外光（波长范围&#62;770 nm）照射装置，检查CCA是否正常工作。 
	注意：若CCA正常工作，研究人员应能观察到后肢肌肉（即胫前肌）对红外光产生收缩反应。</li>
	<li>观察大鼠并监测其体温，直至完全恢复意识。将其单独饲养于单只笼具中，防止其他动物造成伤害；在整个研究期间，笼内不得放置任何隧道或塑料物件，以降低刺激器损坏或动物受伤的风险。提供含阿莫西林的饮水瓶（0.5 mg/mL）。</li>
	<li>术后每24小时皮下注射一次美洛昔康，剂量为1 mg/kg，持续给药至少72小时。</li>
</ol>
3. 慢性收缩活动
<ol>
	<li>手术后，应至少留出5至7天时间，以确保骨骼肌内/周围的切口和缝合部位完全恢复。 
	注意：在CCA手术过程中及术后，需通过观察动物行为来全面检查每只动物的状况（例如， 进食、饮水和/或活动）。此外，通过检测CCA手术前后体重变化，评估任何严重应激或不良反应。</li>
	<li>在CCA刺激当天，通过向刺激器单元暴露一次红外光脉冲（波长范围 &#62;770 nm）的便携式红外频闪灯。</li>
	<li>施加 3 或 6 小时的 10 Hz CCA 刺激。 
	注意：刺激时间的长短由研究人员自行决定。在这些实验中，刺激频率从未改变，根据我们的经验，仅将每日刺激时间从3小时延长至6小时，线粒体适应性的改善也十分有限。如有可能，应每隔30至60分钟检查一次刺激情况和动物状态。</li>
	<li>在完成所需的CCA处理时间后，通过红外光照射关闭CCA仪（操作步骤与开启仪器相同）。</li>
	<li>若需连续多天处理，重复步骤 3.2 至 3.4。</li>
	<li>确定组织采集的时间。例如，在最后一次CCA发作开始后24小时采集组织即在最后一次CCA刺激（持续6小时）后18小时，在麻醉状态下按照CCA手术过程进行操作。采集全部组织后，立即在动物仍处于麻醉状态时通过切除心脏实施安乐死。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

通过低频肌肉刺激的运动慢性收缩活动（CCA）模型 体内是研究肌肉对运动产生表型适应的理想模型13,24,25,26如先前研究所示20,27，CCA 是一种有效的工具，研究人员可通过它来控制训练量和训练频率（即， 时间和天数），并研究在重复收缩活动过程中发生的各种生物化学和/或分子事件。该模型的最佳特性之一是使用对侧后肢的肌肉作为内部对照，有助于最小化动物之间的个体差异。此外，我们过去十年的大量实验表明，外部CCA装置不会限制动物的正常行为模式（例如， 漫游、进食和睡眠），并可结合其他实验处理，例如药物注射。因此，研究人员可在训练研究中应用CCA方案，并根据自身实验需求进行相应修改。
<p class="jo...

骨骼肌可通过其生物能量代谢和物理结构的改变来适应运动训练1。耐力训练引起的主要变化之一是线粒体生物合成，可通过线粒体组分（例如，细胞色素c氧化酶[COX]亚基）表达水平的升高以及转录共激活因子PGC-1α的表达增加来评估2。越来越多的研究表明，许多其他因素，包括线粒体更新和线粒体自噬，也在肌肉适应过程中发挥重要作用。然而，急性或慢性运动调控骨骼肌中这些过程的机制目前&#160;仍不明确。
为了阐明调控运动诱导的肌肉适应性的通路，研究人员在啮齿类动物研究中常采用多种运动模型，包括跑台运动、跑轮运动和游泳运动。然而，这些实验方案存在一定局限性，通常需要约 4 至 12 周才能观察到这些表型变化3,4,5。作为一种替代性实验方法，低频电刺激诱导的慢性收缩活动（chronic contractile activity, CCA）已被有效应用，因其可在显著更短的时间内（i.e., 最长 7 天）引发肌肉适应性改变，且其效果似乎与其他运动方案相当，甚至更强。此外，由于存在激素6、温度7和神经效应8等干扰因素，解析骨骼肌对长期运动的特异性反应可能较为困难。例如，甲状腺激素9,10和类胰岛素生长因子（insulin-like growth factor, IGF）-111已被证实可介导训练诱导的&#160;肌肉适应性改变，这些因子还可能调节骨骼肌中的其他信号通路。值得注意的是，CCA 所引发的效应极少受到全身性因素的调控，因而可更集中地研究骨骼肌对收缩活动的直接反应。
CCA 的外部装置最初由 Tyler 和 Wright12 提出，并经过若干改进而发展完善12。简而言之，该装置由三个主要部分组成：一个可由红外光照射开启和关闭的红外探测器、一个脉冲发生器以及一个脉冲指示器（图 1）。刺激器单元的详细电路设计此前已有描述13。关于 CCA 的详细而具体的特点，可在多篇综述文章中找到更深入的阐述14,15,16,17。简要地说，该刺激方案旨在以低频（i.e., 10 Hz）激活腓总神经，使所支配的肌肉（胫前肌 [TA] 和趾长伸肌 [EDL]）强制收缩一段预定的时间（例如 3 - 6 小时）。随着时间推移，这种刺激促使上述肌肉向更偏有氧的表型转变，表现为毛细血管密度18 和线粒体含量19,20,21 均增加。因此，该方法是一种已被证实的模型，可用于模拟大鼠骨骼肌中某些主要的耐力训练适应性变化。
本文介绍了一种用于诱导颈总动脉狭窄（CCA）的电极植入手术的详细操作步骤，以便研究人员能在其运动研究中应用此模型。CCA 是研究肌肉适应时间进程的优良模型，因此为探究运动训练开始后早期和晚期多个时间点的各类分子与信号事件提供了有效的工具。

<table><tbody><tr><td>斯普拉格-多利大鼠</td><td>查尔斯河实验室</td><td>品系 400</td><td></td></tr><tr><td>慢性收缩活动装置</td><td>自制</td><td>不适用</td><td></td></tr><tr><td>CCA 装置保护盒（3.5 × 3.5 × 2.5 cm）</td><td>自制</td><td>不适用</td><td>盒子应由不透明材料制成，或用不透明胶带包裹</td></tr><tr><td>锂离子纽扣电池（3V）</td><td>松下</td><td>CR2016</td><td></td></tr><tr><td>Medwire</td><td>Leico Industries</td><td>316SS7/44T</td><td></td></tr><tr><td>焊针（插座）</td><td>Digi-Key</td><td>ED6218-ND</td><td></td></tr><tr><td>柔韧多孔胶带</td><td>强生 &amp; Johnson</td><td>5104</td><td></td></tr><tr><td>丝线缝合线（5 号）</td><td>Ethicon</td><td>640G</td><td></td></tr><tr><td>丝线缝合线（6 号）</td><td>Ethicon</td><td>706G</td><td></td></tr><tr><td>弯头钝头剪刀（11.5 cm 长）</td><td>F.S.T.</td><td>14075-11</td><td></td></tr><tr><td>弯头钝头剪刀（15 cm 长）</td><td>F.S.T.</td><td>14111-15</td><td></td></tr><tr><td>精细止血钳（16 cm 长）</td><td>Lawton</td><td>06-0230</td><td></td></tr><tr><td>手术刀</td><td>Feather</td><td>3</td><td></td></tr><tr><td>弯头镊子</td><td>F.S.T.</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢棒（30 cm；直径 7 mm）</td><td>自制</td><td>不适用</td><td>棒的一端应有 5 mm 的切口，用于固定导线以便在皮下穿行</td></tr><tr><td>施夹钳</td><td>KLS Martin</td><td>20-916-12</td><td></td></tr><tr><td>缝合钉（夹子）</td><td>Bbraun</td><td>BN507R</td><td></td></tr><tr><td>金属钩/牵开器</td><td>自制</td><td>不适用</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘（500 mL）</td><td>Rougier</td><td>#NPN00172944</td><td></td></tr><tr><td>氨苄西林钠</td><td>Novopharm</td><td>#DIN00872644</td><td></td></tr><tr><td>美达辛（Metacam）</td><td>Boehringer</td><td>#DIN02240463</td><td></td></tr><tr><td>数字万用表（电压表）</td><td>Soar Corporation</td><td>ME-501</td><td></td></tr><tr><td>LED 数字频闪仪</td><td>Lutron Electronic Enterprise</td><td>DT-2269</td><td></td></tr></tbody></table>

应用慢性刺激研究收缩活动诱导的大鼠骨骼肌表型适应

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

骨骼肌是一种高度可适应的组织，其生物化学和生理特性在长期运动刺激下会发生显著改变。为了研究引发各种肌肉适应的潜在机制，动物实验中已采用多种运动方案，如跑台运动、转轮跑动和游泳运动等。然而，这些运动模型需要较长时间才能诱导肌肉产生适应性变化，且这些变化可能受到体液或神经因素的调控，从而限制了其在研究肌肉特异性收缩诱导适应中的应用。采用间接低频刺激（10 Hz）以诱导慢性收缩性活动（CCA）已被用作一种替代性运动训练模型，因其可在不依赖全身系统因素的情况下，在7天内成功诱导肌肉线粒体的适应性改变。本文详细描述了在大鼠骨骼肌中实施CCA处理所需的手术技术，以期为今后的研究提供广泛的应用基础。

我们已证明，慢性收缩活动（CCA）是诱导骨骼肌内线粒体发生有利适应的有效手段。接受7天（每天6小时）CCA处理的大鼠，其被刺激肌肉中的线粒体生物合成较未受刺激的对侧（对照）后肢显著增强。这种线粒体生物合成的增加表现为线粒体生物合成主调控因子PGC-1α的蛋白表达升高（图3A），以及电子传递链中其他关键线粒体蛋白COX-I和COX-IV的表达上调。此外，作为线粒体含量有效指标的细胞色素c氧化酶（COX）酶活性在经过7天CCA后约升高了30%（图3B）。另外，我们采用透化肌纤维评估线粒体功能，以测定线粒体呼吸能力，发现经过7天刺激的肌肉其最大呼吸（即状态3）能力较对照肌肉有所提高（图3C）。此外，经过7天CCA后，肌膜下（SS）和肌原纤维间（IMF）两个线粒体群体均有所增加（图4A和B）；...

本方案描述了利用慢性收缩活动运动模型，观察大鼠后肢骨骼肌在刺激诱导下的适应性变化。

骨骼肌是一种高度可适应的组织，其生物化学和生理特性在长期运动刺激下会发生显著改变。为了……

慢性收缩活动运动模型可用于在体内研究骨骼肌对运动训练刺激的适应性变化。特别是，该模型可在七天内模拟六周训练方案所引发的表型适应性变化。该方法有助于回答肌肉生理学领域的关键问题，例如线粒体生物合成、自噬以及其他多种与运动相关的细胞适应性变化。该技术的主要优势在于，与需要数月时间的其他运动训练方案相比，它能够在短短七天的较短时间内观察到肌肉特异性的适应性变化。该技术的应用前景可延伸至肌肉萎缩性疾病的治疗，因为已有研究表明，慢性肌肉刺激能够改善与衰老相关的肌肉无力。通常，初次接触该方法的人员可能会遇到困难，原因在于定位腓总神经以及在两端安装电极线圈需要较高的操作精度和实践经验。使用1%至3%异氟烷与氧气混合吸入法对大鼠进行麻醉，通过检测其对后肢脚趾夹捏的反应以及观察呼吸深度和频率来确认是否达到完全镇静状态。在眼睛表面涂抹眼用润滑剂以防止干燥，并将大鼠置于低至中等温度设置的加热垫上。轻柔地剃除左侧后肢的毛发，以及从颈部后方沿前肢后侧环绕躯干至前胸部的一条带状区域的毛发。用碘伏和乙醇轻轻擦拭已剃毛的区域以消毒。将动物俯卧放置，使用带10号刀片的无菌手术刀，在颈部背面剃毛区域中央做一道约0.5厘米的小切口。然后将动物翻转至其右侧，于左侧后肢膝关节凹陷处与尾部起点之间，在皮肤上做一道2至3厘米长的切口。使用钝头弯头手术剪在皮下区域进行分离，范围约为3.5至4厘米，将皮肤与下方肌肉分开，从而在开放的皮肤与下方肌肉之间形成一个囊袋。接下来，使用手术剪在股二头肌上做一个小于0.5厘米的小切口，确保剪刀尖端垂直向下切开肌肉。然后轻轻撑开切口区域，直至内部肌群和腓总神经清晰可见。需格外小心，避免切割或损伤神经。接下来，准备 50 至 60 厘米长的聚四氟乙烯（PTFE）涂层细不锈钢丝，并将其对折。将导线的折叠部分钩入一根 30 厘米长的不锈钢棒的切口内。使用金属牵开器将窗口拉开并固定，使窗口大小约为1.5平方厘米，腓总神经位于窗口中央。用手术刀小心剥离导线末端约1.5厘米。将导线通过后肢的开放袋状区域，沿腿部向上并沿背部中线以L形路径穿行，直至到达颈部后方的小切口处。将剥去绝缘层的导线末端围绕钝化的21号针头缠绕五圈，形成线圈。线圈制作完成后，将针头从线圈中取出。在线圈末端打一个结，并将其缝合在神经的左侧，确保线圈与神经的距离为1.5至2.5毫米。为了固定线圈，需在线圈上再缝合两到三针。此步骤需要大量的练习和耐心，以避免损伤神经及下方肌肉，并确保所有动物的刺激条件一致。最好由一名技术熟练的研究人员完成研究中的所有手术操作。滴加两到三滴抗生素溶液，然后用5-0丝线仔细缝合窗口。将多余的导线松散地缠绕后，推入髋部上方缝合切口处股二头肌的皮下囊袋中。再次滴加两至三滴抗生素溶液，然后用缝合钉闭合皮肤切口。接下来，将动物移至胸卧位，剪断从颈部顶端切口处引出的导线环，形成两个导线端。使用手术刀剥离导线末端约0.5厘米的绝缘层。剪除任何散乱的导线。将导线剥除绝缘层的部分缓慢插入针座的孔中，使用电烙铁将导线焊接到针座上。将连接有针的导线末端穿过一块4.4厘米的无菌纱布垫。然后将导线穿过刺激器盒底部的孔。将插针插入 CCA 单元的连接插座中。使用粘性橡皮将 CCA 单元底部固定于腔室底部，轻柔地将 CCA 单元放入腔室内。使用运动胶带或透气性外科胶带将腔室固定在剃毛后的躯干周围。用三层胶带封闭刺激室的顶部，然后将胶带缠绕在刺激器盒的侧面，以固定盒子。通过将设备暴露于便携式红外频闪灯发出的单次红外光脉冲下，检查CCA是否正常工作。如果CCA正常工作，后肢肌肉将对红外光产生收缩反应。在开始CCA操作前，应尽快对动物进行称重，以记录基线数据，有助于通过CCA操作后体重的变化识别是否存在严重应激或不良反应。在CCA刺激当天，通过便携式红外频闪灯向刺激单元发射单次红外光脉冲来启动CCA，并施加3小时或6小时的10赫兹CCA刺激。每30至60分钟检查一次刺激装置和动物状态。达到预期的CCA干预周期后，通过红外光照射关闭CCA设备。每日接受六小时、持续七天的CCA干预的大鼠，其受刺激侧肌肉的线粒体生物合成较未受刺激的对侧后肢明显增强。线粒体生物合成的增加表现为PGC-1α蛋白表达水平升高。通过检测透化肌纤维的线粒体呼吸能力发现，与对照组肌肉相比，CCA处理导致肌肉最大呼吸能力增强。与未刺激的对照肌肉相比，连续7天CCA处理后，肌膜下和肌原纤维间线粒体群体均有所增加。CCA 也可引起自噬和溶酶体系统的适应性变化。在 CCA 后的所有时间点，均观察到溶酶体生成主要调节因子——转录因子 EB 的蛋白质丰度增加。在此操作之后，可进行其他方法，如常规皮下注射或腹腔注射，以回答更多问题，例如通过秋水仙碱处理来评估自噬流。观看本视频后，您应能够充分理解如何应用当前的慢性收缩活动模型，以研究耐力训练后肌肉表型的变化。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

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