利用三维荧光显微镜对病毒转录工厂进行功能成像

将新生RNA-FISH与病毒潜伏蛋白的氨基酸染色相结合的总体目标是可视化活跃转录与病毒转录工厂形成之间的关联。该方法可用于帮助回答遗传学、细胞生物学、病毒学以及细胞生物学与病毒学交叉领域中的关键科学问题。该技术的主要优势在于利用可诱导的病毒微型染色体模型，研究基因组结构改变背后的分子机制。

在1.5毫升微量离心管中收集细胞。以200 ×g 离心2分钟。用1毫升无菌DEPC处理的PBS洗涤细胞三次。

接下来，将细胞重悬于 1.2 毫升 DEPC 处理的 PBS 中。将盖玻片放入六孔板的底部。每张盖玻片上加入 200 微升细胞与 DEPC PBS 的混合液。

细胞静置两分钟后，吸除多余的DEPC PBS，仅保留一层薄薄的细胞。小心地向每张盖玻片加入一毫升固定液，室温固定10分钟。

用DEPC PBS将盖玻片洗涤三次。洗涤后，小心向每张盖玻片加入一毫升甘氨酸DEPC PBS，使甘氨酸的终浓度为100毫摩尔/升。让细胞淬灭五分钟。

加入 1.5 毫升 DEPC PBS，置于摇床上摇动 5 分钟，并用手轻轻但充分振摇 1 分钟。吸除多余的 DEPC PBS，注意不要破坏细胞。向每个盖玻片小心加入 1 毫升透化溶液。

让细胞透化15分钟。加入1.5毫升DEPC处理的PBS。将细胞置于摇床上5分钟，并用手牢固但轻柔地振荡1分钟。

吸去多余的DEPC PBS，注意不要破坏细胞。标记载玻片，润湿一张纸巾后铺在可密封塑料容器底部。接着配制一抗溶液，并根据存在的盖玻片数量按比例放大配制体积。

在每张标记好的显微镜载玻片上加入30微升一抗溶液。通过手持盖玻片的一角并轻轻弹动，确保一抗浓度正确。此外，可使用纸巾的一角吸除多余的液体。

然后将盖玻片放置在已标记的显微镜载玻片上，注意避免产生气泡。用塑料薄膜包裹容器的外部。将容器放入设定为 37 °C 的培养箱中孵育一小时。

孵育期间，准备所需的试剂。孵育结束后，在六孔板中用DEPC处理的PBS洗涤细胞三次，每次五分钟。然后用FISH洗涤缓冲液洗涤细胞三次，每次五分钟。

在制备好作为内含子探针混合物的二抗之前，将盖玻片保留在FISH洗涤缓冲液中。接下来，用肥皂水清洗用于一抗孵育及杂交的玻片。待其干燥后，再用乙醇和实验室擦拭纸进行清洁。

将 40 微升的二抗和 FISH 内含子探针混合溶液加到每张载玻片上。将带有细胞的盖玻片盖在载玻片上，使细胞面朝下覆盖在缓冲液上。注意避免产生气泡。

将载玻片放入一个底部铺有湿润滤纸的塑料容器中。先用塑料薄膜包裹该容器，再用铝箔包裹。将装有载玻片的容器进行孵育。

孵育后，小心地从玻片边缘滑动盖玻片，并将其放回六孔板中，细胞面朝上。在六孔板中用FISH洗涤缓冲液洗涤细胞三次，每次五分钟。接着，用两倍浓度的SSC缓冲液洗涤细胞两次。

将DAPI以1:1000的浓度加入2×SSC溶液中，室温避光孵育5分钟。用2×SSC溶液洗涤细胞两次。清洗用于杂交的玻片，并在玻片上滴加10 µL封片液。

将盖玻片正面朝下放置在封片液上。用实验室纸巾轻轻吸去多余的封片液，注意不要压碎细胞。使用指甲油在盖玻片边缘均匀涂抹一圈，并让其自然干燥。

样本现已准备好进行荧光显微镜观察。对 BCBL-1 细胞进行 LANA 和 K-Rta RNA 染色，以检测处于活跃转录状态的病毒附加体的位置，以及细胞对卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）再激活刺激反应的异质性。在与病毒附加体分布高度一致的区域中出现明显的 K-Rta 荧光信号，表明在 KSHV 基因组附近正在进行活跃的转录。

在同一份样本中，可以观察到一些细胞表现出较弱且弥散的 K-Rta 荧光，与 LANA 信号无明显重叠，这说明在细胞群体中对再激活刺激的反应存在显著差异和不同程度。接下来，通过观察病毒蛋白的表达情况来检验胸苷同步化的有效性，结果明显显示，经过同步化的细胞对再激活刺激的响应强于未同步化的细胞群体。DAPI 染色具有多种功能，本例中清晰地显示出这是三个独立的细胞而非一个细胞。

结合该技术的3D显微镜观察揭示了KSHV基因组周围边缘分布的环状RNA PII结构。随着该系统的建立，微型病毒染色体将为研究人员探索基因表达的特殊时序性组织以及细胞核的动态变化提供独特的工具。