Name: 基于3D 荧光显微镜的病毒转录工厂功能成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: 了解利用新生RNA-FISH与氨基染色结合3D荧光显微镜技术，可视化病毒转录工厂中的活跃转录过程。该方法采用可诱导病毒微型染色体模型，为研究病毒再激活机制提供有力工具。

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本研究得到了美国国立卫生研究院基金（R01-DE025985）和美国癌症协会研究学者奖（RSG-13-383-MPC）的支持。本工作还获得了美国农业部基金（2015-67015-23268 和 2014-67015-21787）以及加州大学戴维斯分校新研究计划基金的资助。

警告：本实验所用细胞系含有传染性病毒，操作时需格外小心，仅可在二级或更高级别的生物安全实验室（BSL）中进行。
1. 细胞准备与培养
<ol>
	<li>在添加了15%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素-谷氨酰胺溶液的RPMI1640培养基中培养TREx-K-RTA BCBL-1细胞（或其他KSHV感染的PEL细胞系）。</li>
	<li>将细胞置于37 °C、5%二氧化碳（CO2）环境中培养，确保持续生长，并每2–4天按1:4的比例传代一次。</li>
	<li>每天使用光学显微镜监测细胞培养情况，以确认细胞生长状态和形态良好；否则建议重新启动细胞培养或相应调整培养条件。</li>
</ol>
2. 胸腺嘧啶核苷同步化与裂解诱导
<ol>
	<li>在10 cm培养皿中，将TREx-K-Rta BCBL-1细胞接种于新鲜配制的培养基中（1 × 106 个细胞/2 mL培养基）</li>
	<li>向培养皿中加入200 mM胸腺嘧啶（终浓度：2 mM），混匀后孵育18小时。</li>
	<li>以500 × g离心5分钟，用无菌1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，再次离心后将细胞重悬于新鲜配制的培养基中。共洗涤3次。最后用新鲜配制的培养基重悬细胞。</li>
	<li>让细胞退出S期，孵育8小时。</li>
	<li>加入胸腺嘧啶（终浓度：2 mM），混匀后孵育16小时。</li>
	<li>以500 × g离心5分钟，用无菌1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，再次离心后将细胞重悬于新鲜配制的培养基中。共洗涤3次。最后用新鲜配制的培养基重悬细胞。</li>
	<li>为诱导病毒再激活，向细胞培养物中加入12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯（TPA，终浓度20 ng/mL）和多西环素（DOX，终浓度100 ng/mL），混匀后孵育4小时。对于不含K-Rta诱导型表达盒的细胞系，使用TPA（终浓度20 ng/mL）和丁酸钠（1 mM）刺激再激活。</li>
	<li>以500 × g离心5分钟，用无菌1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，再次离心后将细胞重悬于完全培养基中。共洗涤3次。最后用完全培养基重悬细胞。</li>
	<li>让细胞继续生长24小时。</li>
</ol>
3. 固定与通透处理
注意：在开始之前，确保已配制好固定液（含3.7%甲醛的DEPC处理PBS）、二乙基焦碳酸酯处理的磷酸盐缓冲液（DEPC-PBS）、含甘氨酸的DEPC PBS（甘氨酸终浓度：100 mM）以及通透液（50%丙酮，50%甲醇）。通常每张载玻片需要至少50万个细胞，必要时按比例放大，并额外准备备用细胞，尤其是当细胞状态不佳时。
<ol>
	<li>将细胞收集至1.5 mL微量离心管中。</li>
	<li>以200 × g离心2分钟。用1 mL无菌DEPC PBS洗涤细胞3次，最后重悬于1.2 mL DEPC PBS中。</li>
	<li>根据实验设计，将相应数量的盖玻片放入6孔板底部。</li>
	<li>每张盖玻片上加入200 µL细胞DEPC PBS混合液，确保每张盖玻片上至少有50万个细胞。静置2分钟使细胞沉降，吸除多余的DEPC PBS，仅保留一层薄液。此过程中部分细胞被移除属正常现象。 
	注意：PFA具有毒性，操作时应穿戴适当的防护装备。</li>
	<li>每张盖玻片上小心加入1 mL固定液（含3.7%甲醛的DEPC PBS），室温固定10分钟。</li>
	<li>用DEPC PBS洗涤盖玻片3次。</li>
	<li>每张盖玻片上小心加入1 mL甘氨酸DEPC PBS溶液（甘氨酸终浓度为100 mM），室温淬灭5分钟。</li>
	<li>加入1.5 mL DEPC PBS，置于摇床上振荡5分钟，或手动轻柔但充分振荡1分钟。吸除多余液体，注意避免破坏细胞。重复此步骤，共洗涤3次。</li>
	<li>每张盖玻片上小心加入1 mL透化液（50%丙酮，50%甲醇），透化15分钟。 
	注意：此时可将盖玻片置于-20 °C冰箱中保存，但不得超过一周。应避免反复冻融或长时间存放，以免图像质量迅速下降。保存时需确保细胞始终湿润并被甲醇/丙酮覆盖；取出后应使用DEPC PBS充分再水化。</li>
	<li>加入1.5 mL DEPC PBS，置于摇床上振荡5分钟，或手动轻柔但充分振荡1分钟。吸除多余DEPC PBS，注意避免破坏细胞。重复此步骤，共洗涤3次。</li>
</ol>
4. 免疫荧光染色与RNA荧光原位杂交
注意：关于RNA FISH探针的标记与制备：针对长度为959个碱基对的K-Rta内含子，设计并合成了31条不同的探针，每条探针长度为20个碱基对，GC含量约为50%。探针的工作液和储存液分别分装为100 µM和2.5 µM的浓度。
<ol>
	<li>用必要的实验信息或某种可区分的标签标记载玻片。</li>
	<li>在可密封的塑料容器底部铺上湿润的纸巾。</li>
	<li>配制一抗溶液（1.5 µL LANA 抗体、0.75 µL RNA Pol II 抗体、3 µL 酿酒酵母 tRNA，DEPC PBS 补足至 30 µL），根据存在的盖玻片数量按比例放大配制量。在每张标记好的载玻片上各加入 30 µL 一抗溶液。
	<ol>
		<li>首先对目标一抗进行滴定，并使用最佳浓度。务必使用纯化的 IgG，因为血清（腹水）可能含有大量 RNase。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将盖玻片（细胞面朝向溶液）放置在标记好的载玻片上，并将载玻片移入装有湿润纸巾的容器中。注意避免产生气泡。用塑料薄膜包裹容器外部，然后将容器放入设定为 37 °C 的培养箱中孵育 1 小时。</li>
	<li>配制 FISH 洗涤缓冲液（2x 柠檬酸钠-氯化钠缓冲液（SSC）（终浓度）、10% 甲酰胺、90% DEPC 处理的 dH2O）。</li>
	<li>配制 2x 杂交缓冲液（4x SSC，20% 硫酸葡聚糖）。</li>
	<li>配制二抗与 FISH 内含子探针混合液（20 µL 2x 杂交缓冲液（终浓度为 1x 杂交缓冲液）、4 µL 酿酒酵母 tRNA（终浓度 10%）、4 µL 甲酰胺（终浓度 10%）、内含子 K-Rta 探针（终浓度 125 nM）、0.8 µg 二抗，DEPC 处理的 dH2O 补足至 40 µL）。根据所需载玻片数量按比例放大配制量。</li>
	<li>孵育结束后，在 6 孔板中用 DEPC PBS 洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟。</li>
	<li>用 FISH 洗涤缓冲液洗涤 3 次，每次 5 分钟。保持盖玻片浸没在 FISH 洗涤缓冲液中，直至完成二抗与内含子探针混合液的配制（步骤 4.7）。</li>
	<li>清洁用于一抗孵育的玻璃载玻片，以备杂交使用。</li>
	<li>在每张玻璃载玻片上各加入 40 µL 含二抗与 FISH 内含子探针的溶液。</li>
	<li>将带有细胞的盖玻片细胞面向下放置在载玻片的缓冲液上，注意避免产生气泡。</li>
	<li>将载玻片放入底部铺有湿润纸巾的塑料容器中。先用塑料薄膜包裹容器，再用铝箔包裹。</li>
	<li>将容器连同载玻片在 37 °C 下孵育 16–24 小时。</li>
	<li>孵育结束后，小心从载玻片边缘滑动移下盖玻片，将其放回 6 孔板中细胞面向上，然后在 6 孔板中用 FISH 洗涤缓冲液洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟。</li>
	<li>用 2x SSC 洗涤细胞 2 次。</li>
	<li>向 2x SSC 中加入 DAPI（1:1,000），室温避光孵育 5 分钟。</li>
	<li>用 2x SSC 洗涤细胞 2 次。</li>
	<li>清洁用于杂交的玻璃载玻片，并在每张载玻片上加入 10 µL 封片液。</li>
	<li>将盖玻片细胞面向下放置在封片液上，注意避免产生气泡。</li>
	<li>用实验室纸巾轻轻吸除多余的封片液，注意不要压碎细胞。</li>
	<li>使用指甲油在盖玻片边缘均匀涂抹一圈，静置使其干燥。</li>
	<li>进行荧光显微镜观察。</li>
</ol>
5. 三维荧光显微镜
注意：尽管具体实验方案会因所使用的荧光显微镜系统的类型而有所不同，但以下步骤将有助于确保获得适用于定量分析的高质量图像数据。
<ol>
	<li>对固定样本进行预处理，并将其封片于抗荧光淬灭介质中，以延缓成像过程中荧光信号的光漂白。</li>
	<li>使用高质量物镜（例如60倍、数值孔径1.42的油浸物镜），以便在视场中完整捕获单个细胞（或细胞核）。</li>
	<li>利用阳性与阴性对照样本，为每种荧光颜色通道设置曝光参数（例如，激发光强度、曝光时间），并采集荧光图像。 
	注意：应使用仅含一种荧光标记的阳性对照样本，以确定不同颜色通道之间的&#34;串扰&#34;水平。对于固定细胞样本的成像，可适当降低荧光激发光强度（并略微延长曝光时间），以最小化光漂白效应。</li>
	<li>一旦成像方案确定，应在同一研究中的所有样本中保持相同的曝光参数一致，以便对图像数据进行准确分析和比较。</li>
	<li>进行图像采集后的处理及三维重建。通过RNA-FISH信号（红色）识别K-Rta转录本，通过免疫荧光（绿色）识别LANA分子，以及使用DAPI染色（蓝色）标记细胞核染色质（如适用）。 
	注意：细胞核内K-Rta与LANA共聚集的区域，被认为与病毒转录工厂及复制复合体相关。</li>
</ol>

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</ol>

本文作者无任何财务关系或利益冲突。

该实验方案中有一些步骤可根据特殊情况进行调整。固定液和通透缓冲液的选择也可根据需要进行更改。对于固定液，多聚甲醛同样有效，而乙醇可用于通透处理。
建议使用甘氨酸 PBS 淬灭甲醛，以防止在缺乏牛血清白蛋白（BSA）的情况下甲醛使抗体失活；但如果盖玻片清洗充分，则可省略甘氨酸 PBS 步骤。在实验方案中，避免使用牛血清白蛋白作为封闭液。Izumiya 实验室开展的预实验显示，RNA-FISH 信号较弱，推测是由于 RNA 降解所致。如果需要对一抗进行封闭，建议使用无 RNase 的 BSA。根据以往经验，若抗体具有特异性，则反应中无需添加 BSA。然而，建议在所有孵育步骤中始终加入过量的酵母 tRNA，以防止 RNA 降解。已有观察表明，使用 tRNA 作为封闭剂可增强特异性的 RNA-FISH 信号。
已采用细胞周期同步化方法以实现更高效且同步的KSHV再激活。在细胞周期同步化过程中，羟基脲处理或血清饥饿可能是可选的替代方案。已有研究证实，羟基脲的效果与胸苷阻断法相当，尽管单独使用羟基脲孵育仅能微弱地激活KSHV。
<...

越来越多的证据表明，细胞核内部的时空结构在调控真核生物精细基因表达中发挥着重要作用。大多数组织特异性基因分布在多条染色体上，需要在特定刺激下以协调的方式同步调控1。细胞通过构建活性染色质中心（active chromatin hubs, ACH），将基因及其顺式调控元件聚集到特定的核空间区域，以实现协同调控1。
已有多种研究表明，尽管细胞核看起来非常致密且黏稠，但生物活性分子仍能通过扩散相对快速地穿越细胞核2。由于这种短暂的特性，大多数DNA结合蛋白会在结合位点之间“跳跃”，在细胞核空间中摸索前进，从而实现细胞核的高度适应性和多功能性2。
尽管细胞核内的生物大分子具有动态行为，但仍存在无膜的核体结构，例如（但不限于）核仁、卡哈尔体以及早幼粒细胞白血病核体（PML-NB）。这些结构通过多种机制维持其完整性，如串联DNA重复序列（核仁）、rRNA（核仁）以及结构蛋白如coilin（卡哈尔体）或PML蛋白（PML-NB）3,4,5。这些结构以及其他聚集区域（如转录工厂）可作为支架，不仅提高所需组分的局部浓度，还能调控其内部蛋白质和核酸的组成，最终形成高效执行细胞功能的核心位点6。
观察细胞核结构形成的时间和位置，可为表观遗传学研究者提供大量信息。从病毒学角度来看，潜伏感染病毒（如卡波西肉瘤相关疱疹病毒，KSHV）的再激活会显著改变细胞核的结构以及核内酶的分布，使转录活动主要从细胞基因转向病毒基因，最终产生具有完全功能的病毒子代7,8。KSHV 如何操控细胞的基因表达机制以促进病毒基因的表达？这类信息也有助于揭示细胞基因调控机制的时间动态特征。
与其他所有疱疹病毒一样，KSHV 具有两种生命周期，分别为裂解复制和潜伏感染。KSHV 主要处于潜伏期，在此阶段，除潜伏相关基因外，大多数病毒基因的表达均被沉默9,10。在潜伏期，KSHV 会表达潜伏相关核抗原（LANA），该蛋白可持续结合病毒基因组，并将病毒染色质锚定在宿主染色体上11。由于 LANA 与病毒基因组关系密切，因此可以利用免疫荧光分析（IFA）和 DAPI 染色来标记并定位病毒附加体相对于宿主染色质的位置。
为在单个附加体水平上研究KSHV的再激活及其在感染细胞中与其他病毒附加体的关联，需采用一种定位正在活跃转录的病毒染色质的策略 原位 已建立相应方法。因此，结合了LANA和RNAPII免疫荧光染色（IFA）与内含子RNA-FISH技术，通过设计靶向内含子区域的RNA-FISH探针实现（确切的探针序列可参见Izumiya实验室最近发表的文献）。8KSHV K-Rta（一种对KSHV再激活至关重要且足以启动再激活的关键病毒蛋白）的转录实际发生位置得以被确定8,11,12,13,14,15该内含子RNA-FISH技术使研究人员能够直观观察mRNA在剪接前以及输出至细胞质前的转录位置。16,17.
KSHV 可通过多种化学刺激物重新激活，包括佛波酯类化合物（如 12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯，TPA）和组蛋白去乙酰化酶抑制剂（如丁酸钠）。此外，通过过表达病毒转录因子 K-Rta19也可诱导 KSHV 重新激活。研究人员已成功通过在诱导重新激活前同步细胞周期，提高 KSHV 重新激活的效率18。因此，在这些特定研究中，细胞采用双胸腺嘧啶阻断法（下文所述方案）进行同步化处理，并短暂孵育于 TPA 和强力霉素（Dox）中。使用强力霉素是因为本实验所用的细胞系携带一个强力霉素可诱导的 K-Rta 表达盒，该表达盒由 cDNA 克隆而来，不包含 K-Rta 的内含子区域。尽管仅通过诱导 K-Rta 表达即可实现 KSHV 的重新激活，但其他研究人员已证实，由于多种不同的生化因素影响，单独的 K-Rta 表达作为重新激活刺激较为微弱20。通过整合上述所有条件，并将药物孵育时间控制在较短范围内，实现了较强且不过度人为干预的 KSHV 重新激活，适用于成像分析。
在按照本文所述方法对 LANA、RNAPII、K-Rta 内含子和 DNA 进行标记后，使用宽场去卷积显微镜进行三维荧光成像。经图像软件处理后，可准确评估活性病毒附加体的空间分布。利用该技术，可深入研究关于活性染色质枢纽及其他核结构形成基本特性的核心科学问题。单个细胞内含有相同调控元件的相同病毒附加体，可能成为加深理解基因时空调控机制的独特研究工具。
利用在不同时间点固定的多个细胞样本进行成像，以表征本质上具有动态性的分子过程，其局限性在于荧光分布的细微或小尺度变化往往无法被检测到，或被视为不显著。除非在极少数情况下，所观察的每个细胞均表现出相同的细微变化，否则这一问题始终存在。因此，无法通过固定样本成像对活跃的病毒转录与其他核结构之间的完整时空关系进行严格评估。为解决这些技术难题，最佳方法是对带有标记病毒附加体的活细胞进行成像，并随时间追踪关键细胞酶的位置变化。

<table><tbody><tr><td>RPMI 1650 培养基，含 GlutaMAX</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>61870-036</td><td>需预热至 37 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Omega Scientific Inc.</td><td>FB-11</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素-谷氨酰胺混合液（100 倍浓缩）</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>胸腺嘧啶核苷&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9250</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 磷酸盐缓冲液</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>TPA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>丁酸钠&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B5887</td><td></td></tr><tr><td>甲醛溶液&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>252549</td><td>腐蚀性、有毒、健康危害</td></tr><tr><td>焦碳酸二乙酯</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D-5758</td><td>急性毒性&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>410225</td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Sigma Aldrich</td><td>179124</td><td>易燃、有毒</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Fisher Chemical&amp;nbsp;</td><td>67-56-1</td><td>易燃、有毒、健康危害</td></tr><tr><td>抗 KSHV/HHV-8 ORF73 大鼠单克隆抗体</td><td>Advanced Biotechnologies</td><td>13-210-100</td><td></td></tr><tr><td>抗 RNA 聚合酶 II 抗体，克隆株 CTD4H8</td><td>EMD Milipore</td><td>05-623</td><td></td></tr><tr><td>酵母（酿酒酵母，S. cerevisiae）来源的转移核糖核酸&amp;rsquo;s&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9014-25-9</td><td></td></tr><tr><td>20 倍 SSC 缓冲液（柠檬酸钠缓冲液）</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>15557044</td><td></td></tr><tr><td>甲酰胺&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>295876</td><td></td></tr><tr><td>Omnipur 硫酸葡聚糖，50% 溶液</td><td>EMD Milipore</td><td>1916C093</td><td></td></tr><tr><td>DAPI（4&amp;rsquo;,6-二脒基-2-苯基吲哚，盐酸盐）</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>slowFade Gold 抗荧光淬灭试剂</td><td>Life Technologies</td><td>S36936</td><td></td></tr><tr><td>22×22 微型盖玻片</td><td>Matsunami</td><td>C022221</td><td></td></tr><tr><td>VoloCITY</td><td></td><td>三维成像软件</td><td></td></tr><tr><td>DeltaVision 显微镜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superfrost/Plus 载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr></tbody></table>

利用三维荧光显微镜对病毒转录工厂进行功能成像

Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy

众所周知，基因在时空上的调控是调控基因正常表达的重要组成部分。因此，了解转录在细胞核空间内发生的位置和时间，并可视化同一细胞核内感染的附加体之间的关系，具有重要价值。本文结合了免疫荧光（IFA）和RNA-FISH技术，用于鉴定处于活跃转录状态的卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）附加体。通过标记KSHV潜伏相关核抗原（LANA），可以确定病毒附加体在细胞核内的定位。此外，通过设计靶向病毒基因内含子区域的RNA-FISH探针（该区域仅在 productive 感染期间表达），可以定位新生RNA转录本。利用这种分子探针的组合，可以可视化大型病毒转录工厂的组装过程，并分析KSHV再激活过程中病毒基因表达的空间调控。通过加入抗RNA聚合酶II抗体染色，还可以观察RNA聚合酶II（RNAPII）聚集与KSHV再激活期间病毒转录之间的关联。

采用了一种略微简化的实验方案，使用BCBL-1细胞，并仅对LANA和K-Rta RNA进行染色（图1）。该实验使我们能够观察处于活跃转录状态的病毒附加体在细胞中的位置，以及细胞群体对KSHV再激活刺激反应的异质性。在图1中箭头所指的细胞中，K-Rta荧光信号出现在与病毒附加体分布区域（以LANA标记）高度重合的区域，表明在KSHV基因组附近正在进行活跃的转录。在同一标本中，也可观察到如图1中箭头所示的细胞，其K-Rta荧光信号明显较弱且呈弥散分布，与LANA信号无明显重叠。这说明在细胞群体中，对再激活刺激的响应程度存在显著差异，是普遍存在的现象。
<img alt="LANA、K-Rta 和 DAPI 在细胞中的免疫荧光显微镜图像，显示蛋白质定位及重叠情况。" class="...

病毒转录工厂是富含细胞RNA聚合酶II的独立结构，在病毒再激活期间可增强病毒基因的转录。本文介绍一种结合免疫荧光染色与三维细胞核空间成像的方法，用于定位活跃转录的病毒染色质位点。 原位 描述了RNA杂交技术。

众所周知，基因在时空上的调控是调控基因正常表达的重要组成部分。因此，……

将新生RNA-FISH与病毒潜伏蛋白的氨基酸染色相结合的总体目标是可视化活跃转录与病毒转录工厂形成之间的关联。该方法可用于帮助回答遗传学、细胞生物学、病毒学以及细胞生物学与病毒学交叉领域中的关键科学问题。该技术的主要优势在于利用可诱导的病毒微型染色体模型，研究基因组结构改变背后的分子机制。在1.5毫升微量离心管中收集细胞。以200 ×g 离心2分钟。用1毫升无菌DEPC处理的PBS洗涤细胞三次。接下来，将细胞重悬于 1.2 毫升 DEPC 处理的 PBS 中。将盖玻片放入六孔板的底部。每张盖玻片上加入 200 微升细胞与 DEPC PBS 的混合液。细胞静置两分钟后，吸除多余的DEPC PBS，仅保留一层薄薄的细胞。小心地向每张盖玻片加入一毫升固定液，室温固定10分钟。用DEPC PBS将盖玻片洗涤三次。洗涤后，小心向每张盖玻片加入一毫升甘氨酸DEPC PBS，使甘氨酸的终浓度为100毫摩尔/升。让细胞淬灭五分钟。加入 1.5 毫升 DEPC PBS，置于摇床上摇动 5 分钟，并用手轻轻但充分振摇 1 分钟。吸除多余的 DEPC PBS，注意不要破坏细胞。向每个盖玻片小心加入 1 毫升透化溶液。让细胞透化15分钟。加入1.5毫升DEPC处理的PBS。将细胞置于摇床上5分钟，并用手牢固但轻柔地振荡1分钟。吸去多余的DEPC PBS，注意不要破坏细胞。标记载玻片，润湿一张纸巾后铺在可密封塑料容器底部。接着配制一抗溶液，并根据存在的盖玻片数量按比例放大配制体积。在每张标记好的显微镜载玻片上加入30微升一抗溶液。通过手持盖玻片的一角并轻轻弹动，确保一抗浓度正确。此外，可使用纸巾的一角吸除多余的液体。然后将盖玻片放置在已标记的显微镜载玻片上，注意避免产生气泡。用塑料薄膜包裹容器的外部。将容器放入设定为 37 °C 的培养箱中孵育一小时。孵育期间，准备所需的试剂。孵育结束后，在六孔板中用DEPC处理的PBS洗涤细胞三次，每次五分钟。然后用FISH洗涤缓冲液洗涤细胞三次，每次五分钟。在制备好作为内含子探针混合物的二抗之前，将盖玻片保留在FISH洗涤缓冲液中。接下来，用肥皂水清洗用于一抗孵育及杂交的玻片。待其干燥后，再用乙醇和实验室擦拭纸进行清洁。将 40 微升的二抗和 FISH 内含子探针混合溶液加到每张载玻片上。将带有细胞的盖玻片盖在载玻片上，使细胞面朝下覆盖在缓冲液上。注意避免产生气泡。将载玻片放入一个底部铺有湿润滤纸的塑料容器中。先用塑料薄膜包裹该容器，再用铝箔包裹。将装有载玻片的容器进行孵育。孵育后，小心地从玻片边缘滑动盖玻片，并将其放回六孔板中，细胞面朝上。在六孔板中用FISH洗涤缓冲液洗涤细胞三次，每次五分钟。接着，用两倍浓度的SSC缓冲液洗涤细胞两次。将DAPI以1:1000的浓度加入2×SSC溶液中，室温避光孵育5分钟。用2×SSC溶液洗涤细胞两次。清洗用于杂交的玻片，并在玻片上滴加10 µL封片液。将盖玻片正面朝下放置在封片液上。用实验室纸巾轻轻吸去多余的封片液，注意不要压碎细胞。使用指甲油在盖玻片边缘均匀涂抹一圈，并让其自然干燥。样本现已准备好进行荧光显微镜观察。对 BCBL-1 细胞进行 LANA 和 K-Rta RNA 染色，以检测处于活跃转录状态的病毒附加体的位置，以及细胞对卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）再激活刺激反应的异质性。在与病毒附加体分布高度一致的区域中出现明显的 K-Rta 荧光信号，表明在 KSHV 基因组附近正在进行活跃的转录。在同一份样本中，可以观察到一些细胞表现出较弱且弥散的 K-Rta 荧光，与 LANA 信号无明显重叠，这说明在细胞群体中对再激活刺激的反应存在显著差异和不同程度。接下来，通过观察病毒蛋白的表达情况来检验胸苷同步化的有效性，结果明显显示，经过同步化的细胞对再激活刺激的响应强于未同步化的细胞群体。DAPI 染色具有多种功能，本例中清晰地显示出这是三个独立的细胞而非一个细胞。结合该技术的3D显微镜观察揭示了KSHV基因组周围边缘分布的环状RNA PII结构。随着该系统的建立，微型病毒染色体将为研究人员探索基因表达的特殊时序性组织以及细胞核的动态变化提供独特的工具。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

基于3D 荧光显微镜的病毒转录工厂功能成像

本可视化实验旨在指导如何利用荧光标记的HIV分子克隆进行活细胞共聚焦成像实验。...

利用荧光标记的HIV克隆与活细胞共聚焦显微镜观察HIV的细胞间传递

在活细胞中测定特定基因的RNA聚合酶II转录动力学。通过荧光标记目的基因转录出的mRNA，并利用光漂白后荧光恢复技术（FRAP），获得体内转录延伸的动力学参数。...

单个活细胞中 mRNA 转录动力学的测量

荧光法检测病毒RNA 原位 杂交（FISH）

来源：Bratton, B. P., et al., 用于精确细胞表征与精准蛋白质定位的细菌细胞三维成像。J. Vis. Exp.

通过荧光成像实现细菌蛋白质分布的三维可视化

本视频展示了一种利用表达重组荧光素酶和荧光蛋白的双报告流感病毒A在小鼠模型中追踪病毒感染的方法。该方法可同时用于活体（in vivo）和离体（ex...

一种带有荧光素酶-荧光报告基因的流感病毒用于追踪病毒感染

活细胞成像技术可对α疱疹病毒感染过程中的定向运输和细胞间扩散等动态事件进行分析。本文介绍了利用表达荧光融合蛋白的重组病毒株，在原代神经元感染过程中实现病毒组装体可视化的方法。...

活细胞成像观察α疱疹病毒的顺向运输与传播

一种快速且模块化的方案，用于生成表达荧光蛋白的重组痘苗病毒 此处描述了使用瞬时显性选择方法同时标记蛋白质的技术。...

高效生成荧光标记的痘苗病毒蛋白的方法学

病毒颗粒附着于表面是通过超分辨率荧光成像或原子力显微镜（AFM）进行单病毒颗粒成像的前提条件。本文展示了一种用于实现病毒颗粒在玻璃表面可控黏附的样品制备方法，适用于原子力显微镜和超分辨率荧光成像。...

单病毒颗粒原子力显微镜与超分辨率荧光成像的样品制备

我们描述了一种荧光报告型痘苗病毒的使用方法，该病毒可通过光谱上可区分的报告荧光蛋白的时相特异性表达，实现对病毒感染性和基因表达的实时检测。我们详细介绍了一种基于孔板的方法，用于精确定位小分子抑制剂作用下病毒复制受干扰的具体阶段。...

用于量化基因表达各阶段病毒功能的痘苗病毒报告病毒

ICP0 在 HSV-1 感染过程中会发生从细胞核到细胞质的转位。这一事件的分子机制尚不清楚。本文介绍了使用共聚焦显微镜作为量化 HSV-1 感染中 ICP0 运动的工具，为今后在机制研究中对 ICP0...

通过免疫荧光共聚焦显微镜对单纯疱疹病毒1型蛋白的核质转位进行时间分析

本文介绍了一种荧光成像方法的实验方案，即多重免疫荧光细胞检测法检测DNA、RNA和蛋白质（MICDDRP），该方法能够同时在单细胞水平上以荧光方式可视化不同种类和链型的病毒蛋白及其核酸。该方法可广泛应用于多种研究体系。...

单细胞多重荧光成像技术用于可视化病毒核酸与蛋白质并监测HIV、HTLV、HBV、HCV、寨卡病毒和流感病毒感染

了解利用新生RNA-FISH与氨基染色结合3D荧光显微镜技术，可视化病毒转录工厂中的活跃转录过程。该方法采用可诱导病毒微型染色体模型，为研究病毒再激活机制提供有力工具。

利用三维荧光显微镜对病毒转录工厂进行功能成像

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