一种的开发 体外 斑马鱼胚胎发育过程中造血干细胞和祖细胞（HSPCs）定量检测方法

本实验的总体目标是对发育中的斑马鱼胚胎中的造血祖细胞进行计数并分析其分化情况。该方法有助于回答造血研究领域中一些非常重要的问题，例如，发育中的斑马鱼胚胎中究竟含有多少干细胞和祖细胞。该技术的主要优势在于操作快速、相对经济且易于实施。

尽管该方法可帮助了解发育中斑马鱼体内造血祖细胞的数量，但它还使研究人员能够测量药物或基因突变对造血祖细胞形成所产生的功能影响。当我们敲低那些我们假设对血液发育至关重要的基因时，便萌生了该方法的想法。我们预测，通过该检测方法能够量化正常发育胚胎与该基因敲低胚胎之间的差异。

为了对斑马鱼胚胎进行漂白处理，使用塑料容器配制三个清洗站：第一个清洗站中加入每升E3培养基含1毫升5%的漂白剂，其余两个清洗站中均加入无菌E3培养基。用移液管将胚胎转移至茶筛中，浸入第一个清洗站，孵育5分钟。随后将装有胚胎的茶筛转移至第二个清洗站，继续孵育5分钟。最后将茶筛转移至第三个清洗站，再孵育5分钟。

最后一次洗涤后，将茶漏倒扣在干净的10厘米培养皿上，取出胚胎，并用移液管吸取无菌E3培养基，轻轻将胚胎从茶漏上冲洗下来。为了去除胚胎的卵膜，先用移液管尽可能吸除培养皿中的E3培养基并弃去。然后向胚胎中加入500 µL去卵膜蛋白酶溶液，在室温下孵育5分钟。

接下来，轻轻敲击培养皿的侧壁，以彻底去除卵膜。然后，用移液管加入 20 毫升无菌 E3 培养基以稀释消化液。让胚胎沉降后，用移液管吸出 E3 培养基。重复此洗涤步骤三次，以完全清除去膜过程中残留的消化液。

为制备胚胎样品，使用移液器将10个胚胎放入一个无菌的1.5毫升微量离心管中。然后小心吸出E3培养基并弃去。将样品转移至超净工作台，加入1毫升无菌E3培养基洗涤胚胎，静置使胚胎沉降至管底。

然后使用 P1000 移液器吸走上清液。重复此步骤，共洗涤三次。最后一次洗涤后，吸出 E3 并弃去。

然后加入1毫升含10毫摩尔DTT的E3溶液，以去除包裹在胚胎周围的黏液层以及可能被困在其中的孢子、酵母或细菌。现在将微量离心管水平放置，并在室温下孵育25分钟。为使胚胎分散，用1毫升无菌DPBS洗涤样本三次。

最后一次洗涤后，加入500 µL含钙和镁的DPBS以及5 µL浓度为5 mg/mL的消化蛋白酶。将样品置于37°C、180 rpm的水平摇床上孵育60分钟。随后，将样品转移至超净台中，使用P1000移液器反复吹打胚胎，直至样品完全解离。

操作时需谨慎，并定期检查胚胎，以确定其解离程度。应保留部分组织存在，过度消化可能导致祖细胞被破坏。

用移液器将10个已解离的胚胎转移至一个5毫升聚苯乙烯圆底管的上层储液区，该管顶部装有35微米细胞筛网帽。使用移液器和无菌PBS冲洗胚胎管，并将冲洗液转移至含有过滤后细胞的5毫升聚苯乙烯管中。重复冲洗，直至管内液体体积达到4毫升。

将离心管在300 × g、4 °C条件下离心5分钟，使匀浆化的细胞样品沉淀。用移液器小心吸除并弃去圆底管中的上清液，注意不要扰动底部的细胞沉淀。然后加入100 µL PBS重悬细胞。

配制一份X完全甲基纤维素储备液，使用3毫升注射器和16号针头，向每个无菌圆底14毫升管中加入2.5毫升。每种实验条件使用一个试管。进行髓系分化时，向甲基纤维素培养基中加入1% 鲤鱼血清和0.3毫克/毫升重组斑马鱼粒细胞集落刺激因子（GCSF）。

进行红系分化时，在甲基纤维素培养基中加入1%的鲤鱼血清和0.1毫克/毫升的重组斑马鱼促红细胞生成素（EPO）。为检测多谱系祖细胞，需添加EPO和粒细胞集落刺激因子（GCSF）。使用移液器将10个已解离的胚胎中的100微升液体加至含有重组细胞因子和鲤鱼血清的预置甲基纤维素培养基表面。

盖上管盖，轻轻涡旋以充分混匀样品。每管现在应含有10个胚胎解离后的组织。使用3毫升注射器和16号针头，将1毫升样品分装至两个独立的35毫米培养皿中。

确保样品在培养皿中充分分散。每个样品均需重复此操作。将含有细胞和甲基纤维素的35毫米培养皿放入15厘米培养皿中。

向每个大培养皿中加入一个含有5毫升无菌水的35毫米培养皿，以湿润样本。将培养皿在32摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育7至10天。最后，根据文本方案观察菌落形成单位。

在含有造血支持因子的培养条件下培养七天后，对来自48小时受精龄（HPF）斑马鱼胚胎的祖细胞进行了计数和成像。重要的是，所使用的培养皿数量（CF）与铺板的胚胎数量直接成正比。实验开始时，每毫升分别铺板四个或八个胚胎，相当于起始使用10个或20个胚胎，可分别获得约1200或2400个集落形成单位（CFUs）。

一旦掌握，若操作得当，该技术可在两个半小时内完成。在进行此操作时，需注意切勿过度消化胚胎，以免破坏前体细胞。通过该方法，可比较不同时间点存在的前体细胞数量。

可以将突变型动物与野生型动物进行比较，并检测药物对血液发育的影响。观看本视频后，您应能够充分理解如何开展甲基纤维素实验，以计数斑马鱼造血祖细胞。您可以根据特定的实验需求调整该实验流程，例如检测特定的细胞因子。

请注意，操作脊椎动物血液和针头具有极高的危险性，进行本实验时务必始终小心谨慎。