代谢定位：通过定量酶细胞化学与组织化学方法测定细胞和组织中脱氢酶活性

本视频展示了如何进行代谢图谱分析，即一种用于定量特定脱氢酶活性的实验方法。细胞可附着于显微镜载玻片或冷冻组织上。

几十年前，我们开发了一系列代谢定位技术，当时称为酶组织化学技术，用于在显微镜下检测组织和细胞中的酶活性。然而，在上个世纪末的基因革命期间，代谢研究逐渐被忽视。但现在，代谢研究再次成为热点。

以癌细胞为例，其代谢现在被视为一个治疗靶点，因此细胞和组织中活性测定再次成为研究热点。反应缓冲液的一个关键组分是聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，简称 PVA）。

将该物质溶于磷酸盐缓冲液中，终浓度为18%。聚乙烯醇（PVA）在吸入时具有粉尘性和毒性，因此务必在通风橱内称量PVA。由于磷酸盐缓冲液中PVA浓度较高，需在搅拌的同时将反应缓冲液瓶置于水浴中加热。务必松松地拧上瓶盖，否则瓶子可能发生爆炸。

聚乙烯醇完全溶解于磷酸盐缓冲液中可能需要长达15分钟。此时，溶液应呈透明状，并含有因搅拌而产生的少量气泡。可使用宽口移液器将黏稠的PVA溶液转移至反应缓冲液管中。

将试管保持在至少 40 摄氏度或更高的温度，以防止聚乙烯醇（PVA）凝固。1 毫升 PVA 溶液适用于约四次细胞离心涂片，或两次组织制备。对于反应缓冲液的其他组分，黄色的氮蓝四唑氯化物（又称 nitroBT）需在乙醇和二甲基甲酰胺的混合液中溶解，同时在本生灯上加热玻璃小瓶进行溶解。

溶液不应煮沸，否则体积会减少过多。因此，不要将小瓶在火焰中放置过久，并需定期摇动。溶解后应立即置于冰上，并尽快进行下一步操作，因为溶解后的硝基BT会迅速降解。

NitroBT 是一种黄色粉末，当未完全溶解时会沉淀在含有乙醇和 DMF 的玻璃小瓶底部。您可每隔一段时间检查一次 NitroBT 是否已溶解。溶液将呈现黄色透明状态。

溶解后，可将硝基BT加入含有PVA溶液的小瓶中。使用细勺或细刮刀轻轻搅拌，以混匀硝基BT与缓冲液。请按照全文中表一列出的反应缓冲液各组分，依次对所有组分进行相同操作。

搅拌反应组分进入PVA溶液时，应尽量避免产生过多气泡。关键是持续搅拌，并且不要将勺子或刮刀从溶液中取出。电子载体甲氧基吩嗪甲基硫酸盐需避光保存，并在最后溶解到反应缓冲液中。

MPMS 的红色便于再次检查所有组分是否已正确溶解。在配制反应缓冲液并将各组分搅拌混入时，将载玻片置于盛有温水的培养箱中预热 50 分钟。孵育 chamber 内应保持较低的水位。

关闭盖子时，可保持反应环境湿润；打开盖子时，水浴可使载玻片保持温暖温度。使用玻璃移液管将反应缓冲液加至细胞或组织样本上。

不必担心小的气泡，因为它们会流向表面，不会干扰细胞或组织中的反应。在孵育期间保持孵育室盖子关闭，以确保反应在湿润环境中进行，防止PVA缓冲液干燥。

代谢定位实验中的大多数脱氢酶反应在37摄氏度下进行。将切片在反应缓冲液中孵育特定时间，具体时间可参见全文文章的表一。由于脱氢酶的活性作用，细胞或组织会变为深蓝色或紫色，由此可直观判断反应是否成功。

最终将无色不溶性的硝基BT转化为深蓝色的甲臜，后者在脱氢酶活性位点处沉淀。酶促反应通过三个步骤终止：首先，用纸巾吸去多余的孵育液。

第二，使用 pH 为 5.3 的磷酸盐缓冲液在 60 摄氏度条件下通过机械洗涤法将显微镜载玻片上的孵育液洗去。第三，将显微镜载玻片置于 pH 5.3 的新鲜磷酸盐缓冲液中，在 60 摄氏度下静置 20 分钟。第四，可用自来水冲洗，再用蒸馏水漂洗以去除磷酸盐缓冲液。

可以明显看到反应缓冲液正在脱离。终止缓冲液的低pH有助于停止细胞内的脱氢酶反应。根据一次处理的玻片数量，将玻片放入新鲜的终止缓冲液中一次或两次。

同时用自来水冲洗载玻片，最后用蒸馏水冲洗。现在可将载玻片置于载片加热器上干燥并封存。用擦布小心擦干载玻片背面，然后放置于预热至50至60°C的载片加热器上。

当载玻片干燥后，可使用甘油封片剂和盖玻片对样本进行封固和保存。将载玻片保存在冰箱中，待进行图像采集时取出。此图为本视频所示实验中处理过的一个代表性组织切片在玻璃载玻片上的彩色显微照片。

这是一张胶质母细胞瘤切片，其中研究的酶为乳酸脱氢酶。每分子脱氢酶产生一个PH实体，每个PH分子可将一分子黄色四氮唑盐（nitroBT）转化为一分子甲臜（formazol），即本图中所示的紫色沉淀物。可见肿瘤细胞内乳酸脱氢酶活性较高，表现为深紫色。

血管的活性较低，呈白色。这是该切片同一区域的黑白图像，可用于按照方案中所述方法定量酶活性。

生成的甲臜越多，像素就越深，吸光度也越高。随后可将吸光度转换为所产生的实体ph的皮摩尔数。因此，代谢成像很容易实现。

它非常快速且成本低廉，因此可在您的研究中使用。