Name: CRISPR/Cas9-mediated 目标集成在体内使用基于同源介导的端接连接策略 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: 了解CRISPR/Cas9介导的HMEJ策略用于体内高效靶向基因整合。该方法可精准纠正基因突变，为基因治疗和遗传修饰动物模型构建提供有力工具。

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本工作得到中国科学院战略性先导科技专项（XDB02050007，XDA01010409）和国家高技术研究发展计划&amp;国家高技术研究发展计划（863 计划；2015AA020307）、国家自然科学基金（NSFC 资助号 31522037、31500825、31571509、31522038）、中国青年千人计划（HY 收取）、中国科学院重点突破项目、上海市科学技术委员会项目（16JC1420202 至 HY）、中华人民共和国科学技术部（MOST；2016YFA0100500）。

所有涉及动物实验的操作均已获得中国科学院上海生命科学研究院生物医学研究伦理委员会的批准。
1. 供体质粒的设计
<ol>
	<li>sgRNA 的选择
	<ol>
		<li>使用在线 CRISPR 设计工具预测目标区域的 sgRNA11,12,13,14,15。针对 Cdx2 基因座，在终止密码子附近设计六个不同的 sgRNA（Cdx2-sgRNA1~Cdx2-sgRNA6），优先选择评分较高且潜在脱靶效应较低的序列（图 1A）16。</li>
		<li>用 BbsI 酶切 2 µg 的 Cas9-CMV-EGFP 表达载体和 sgRNA 载体（20 µL 体系中加入 1 µL BbsI，37 °C 反应 2 h，终浓度为 1 U/µL）。然后使用凝胶纯化试剂盒在 1% 琼脂糖凝胶（1× TAE 缓冲液）中纯化产物。</li>
		<li>将一对 sgRNA 寡核苷酸在 10 µL 的 1× T4 DNA 连接酶缓冲液中混合，终浓度为 50 µM。将寡核苷酸溶液在温度梯度下从 95 °C 降至 25 °C，降温速率为 5 °C/5 min（95 °C 5 min，90 °C 5 min，85 °C 5 min，依此类推），以实现退火。</li>
		<li>在 10 µL 的 1× T4 DNA 连接酶缓冲液中，混合 4 µL 退火产物、2 µL 线性化载体和 1 µL T4 DNA 连接酶，22 °C 连接 1–2 h（图 1B）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>sgRNA 的 T7 核酸内切酶检测 
	注意：用于敲入实验的 sgRNA 靶向效率通过 T7 核酸内切酶（T7EI）&#160;检测进行评估17。选择 DNA 切割效率高且切割位点与终止密码子距离较近的 sgRNA。
	<ol>
		<li>使用转染试剂盒（参见材料表），将 Cas9-sgRNA-EGFP 表达载体转染至培养于含 10% 胎牛血清、1% PSG 和 1% 非必需氨基酸的 DMEM 培养基中的 N2a 细胞系。将转染后的细胞在 37 °C、5% CO2 条件下孵育。</li>
		<li>孵育 48 h 后，以未转染细胞作为对照，通过荧光激活细胞分选（FACS）收集 5,000 个转染细胞（GFP+）。</li>
		<li>在 2–5 µL 裂解缓冲液（0.1% Triton X-100、0.1% Tween 20 和 100 µg/mL 蛋白酶 K）中，56 °C 消化收集的细胞 30 min，然后 95 °C 加热 10 min 以灭活蛋白酶 K。</li>
		<li>使用嵌套 PCR（表 1）扩增样本，具体操作遵循试剂说明书。PCR 产物大小设定为 300–500 bp。
		<ol>
			<li>将 1 µL 裂解产物与 DNA 聚合酶及一对识别 sgRNA 靶位点周围序列的外侧引物（终浓度 0.1 µM）混合，在 20 µL 体系中进行第一轮 PCR 扩增（表 1）。</li>
			<li>95 °C 激活 DNA 聚合酶 5 min，然后进行 30 个循环的 PCR 扩增：95 °C 30 s，60 °C 30 s，72 °C 24 s（1 min/kb），最后 72 °C 延伸 5 min。</li>
			<li>使用 1 µL 第一轮 PCR 产物和一对嵌套的内侧引物进行第二轮 PCR 扩增。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在 20 µL 的 1× T7EI 反应缓冲液（50 mM NaCl、10 mM Tris-HCl、10 mM MgCl2、1 mM DTT，pH 7.9）中，对 300–600 ng 纯化的 PCR 产物进行变性和复性处理，温度梯度从 95 °C 降至 25 °C，降温速率为 5 °C/5 min。</li>
		<li>向退火后的 PCR 产物中加入 1 µL T7EI 酶，37 °C 消化 2 h。然后在 1×TAE 缓冲液中以 120 V 电压电泳 40 min，分离片段（参见材料表）。</li>
		<li>使用 ImageJ 软件测定切割与未切割 DNA 条带的强度，并按照先前报道的方法计算插入缺失（indel）频率9（图 1C）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>供体质粒的构建 
	注意：为构建 Cdx2 基因的 HMEJ 供体质粒，需构建一个供体 DNA（800 bp HAL-p2A-mCherry-800 bp HAR），其两端各包含一段 23 nt 的 Cdx2-sgRNA 靶向序列（图 1D 和 图 1E）。靶序列的 PAM 位于同源臂末端附近。推荐使用 Gibson 组装法进行 HMEJ 供体质粒的克隆。
	<ol>
		<li>使用小鼠基因组 DNA（200 ng/µL）作为模板，以正向引物-1F（包含来自载体的 15–20 nt 重叠序列、23 nt Cdx2-sgRNA 靶向序列以及约 20 nt 的 HAL 序列）和反向引物-1R（包含来自 p2A-mCherry 的 15–20 bp 重叠序列以及约 20 nt 的 HAL 序列）在终浓度 0.1 µM 条件下扩增 800 bp 的左侧同源臂（HAL）（图 1D，表 1）。</li>
		<li>使用基因组 DNA 或含报告基因序列的质粒（浓度分别为 100 ng/µL 或 30 ng/µL）作为模板，以正向引物-2F（包含来自 HAL 的 15–20 nt 重叠序列以及约 20 nt 的插入片段序列）和反向引物-2R（包含来自 HAR 的 15–20 nt 重叠序列以及约 20 nt 的插入片段序列）在终浓度 0.1 µM 条件下扩增 p2A-mCherry 插入片段（图 1D，表 1）。</li>
		<li>使用小鼠基因组 DNA（200 ng/µL）作为模板，以正向引物-3F（包含来自载体的 15–20 nt 重叠序列、23 nt Cdx2-sgRNA 靶向序列以及约 20 nt 的 HAR 序列）和反向引物-3R（包含来自 p2A-mCherry 的 15–20 nt 重叠序列以及约 20 nt 的 HAR 序列）在终浓度 0.1 µM 条件下扩增 800 bp 的右侧同源臂（HAR）（图 1D，表 1）。</li>
		<li>在 1% 琼脂糖凝胶（1×TAE 缓冲液）中电泳检测所有 PCR 产物，并根据说明书使用凝胶回收试剂盒纯化预期大小的 PCR 产物（表 1）。</li>
		<li>用 KpnI 和 XbaI 酶切 50–100 ng 构建载体。将 2 µL 线性化载体（30–40 ng/µL）与三段 PCR 扩增产物（每种 1 µL，100–200 ng/µL）混合于 2× Gibson 混合液中，加 H2O 调整体积至 10 µL，50 °C 孵育 60 min。</li>
		<li>将全部组装产物转化至感受态 E. coli 细胞中，按照说明书使用质粒提取试剂盒提取质粒，并通过 DNA 测序验证 HMEJ 供体质粒。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 使用基于HMEJ方法的小鼠胚胎基因组编辑
<ol>
	<li>Cas9 mRNA的制备
	<ol>
		<li>为制备Cas9 mRNA，使用所列的相应引物对通过PCR扩增将T7启动子序列添加至Cas9编码区 表1加入引物 Cas9 F/R 至终浓度 0.1 µM，并加入 20 ng 表达 Cas9 的质粒至 1× 高保真 DNA 聚合酶反应体系中，用 H₂O 调整终体积至 50 µL。2O.</li>
		<li>在95 °C下激活DNA聚合酶5分钟，然后进行36个循环的PCR反应，每个循环包括：95 °C变性30秒，60 °C退火30秒，68 °C延伸4分钟（每1 kb产物延伸1分钟），最后在68 °C下终末延伸10分钟。</li>
		<li>纯化T7-Cas9 PCR产物 体外 体外转录（IVT），然后根据制造商说明书，使用mRNA转录试剂盒在37 °C下以20 µL总体积反应8小时，转录0.5–1 µg DNA（参见 材料表).</li>
		<li>加入1 µL DNase，在37 °C下孵育15分钟以去除DNA模板。在37 °C下加poly-A尾45分钟，并根据试剂盒说明书使用RNA纯化试剂盒回收Cas9 mRNA（参见 材料表).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>sgRNA 的制备
	<ol>
		<li>使用高保真DNA聚合酶，以上述方法生成由T7启动子驱动的sgRNA模板。选择含有sgRNA骨架的质粒作为模板。所用引物列于 表1.</li>
		<li>纯化T7-sgRNA PCR产物，并以0.5–1 µg DNA作为模板 体外 根据制造商说明，使用短链RNA转录试剂盒在37 °C下进行sgRNA转录，总体积为20 µL，反应6 h（参见 材料表).</li>
		<li>加入1 µL DNase至混合物中，于37 °C继续孵育15分钟，以去除DNA模板。使用RNA纯化试剂盒对sgRNA进行纯化，步骤同上（参见 材料表).</li>
		<li>将sgRNA用无RN酶的水稀释至500 ng/µL，并将样品于−80 °C保存，可保存长达3个月。 
		注意：CRISPR 核糖核蛋白（RNPs）是一种替代性替换方法，具有更高的切割效率18,19,20.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胚胎收集、显微注射及 体外 培养
	<ol>
		<li>通过孕马血清促性腺激素（PMSG）对7-8周龄雌性B6D2F1（C57BL/6 × DBA2J）小鼠进行超数排卵处理，48小时后注射人绒毛膜促性腺激素（hCG）。hCG注射后，将雌鼠与B6D2F1雄鼠同笼过夜。</li>
		<li>通过 CO 处死雌性2 麻醉，在hCG注射后24小时，用M2培养基从输卵管中收集受精胚胎（每只雌鼠30–50枚）。</li>
		<li>将受精胚胎（约300枚卵用于一天的显微注射）放入KSOM培养基（5.55 g/L NaCl，0.19 g/L KCl，0.05 g/L KH₂PO₄，0.25 g/L MgSO₄·7H₂O，0.336 g/L CaCl₂·2H₂O，3.7 g/L NaHCO₃，0.01 g/L EDTA，1.0 g/L葡萄糖，10 mL/L胎牛血清）中。2PO4，0.05 g/L MgSO₄4•7H2O₂，0.04 g/L 葡萄糖，1.12 g/L 乳酸钠，2.1 g/L NaHCO₃3，0.02 g/L 丙酮酸钠，0.25 g/L CaCl2•2H2O、0.004 g/L EDTA、0.146 g/L L-谷氨酰胺和1 g/L 牛血清白蛋白）于37 °C、5% CO₂的培养箱中培养2.</li>
		<li>混合 Cas9 mRNA（100 ng/µL）、sgRNA（50 ng/µL）和 HMEJ 供体质粒（100 ng/µL），并加入 H2O，调节终体积至10 µL。将混合物置于冰上。</li>
		<li>使用显微拉针仪（Micropipette Puller）制备毛细玻璃针（外径 1.0 mm，内径 0.78 mm，带纤维丝）（参数设置：加热值 74；拉力 60；速度 80；时间/延迟 200；气压 300。参见 材料表）。商用针头可作为显微注射的替代选择。</li>
		<li>使用设定为恒定流速的显微注射仪，将适量混合物注射到含有5 µg/mL细胞松弛素B的HEPES-CZB培养液液滴中具有清晰可见原核的受精卵细胞质内图2A）（参见 材料表)21. 
		注意：每组受精卵应在20–30分钟内完成注射。细胞松弛素B可提高小鼠受精卵注射后的存活率。 Alternatively，可采用压电系统进行显微注射，具体操作如前所述。22.</li>
		<li>将注射后的受精卵在37 °C、5% CO₂条件下，于KSOM培养基中培养2 培养至受精后3.5天的囊胚阶段，以进行荧光观察（图2B 和 2C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胚胎移植与小鼠的制备
	<ol>
		<li>同一天注射后，将处于动情期的ICR雌性小鼠与结扎的ICR雄性小鼠进行交配。</li>
		<li>将注射后的受精卵在37 °C、5% CO₂条件下培养至2细胞期2，将25-30枚2细胞期胚胎移植至交配后0.5天（dpc）的假孕ICR雌性小鼠的输卵管中。受体母鼠在19.5 dpc分娩产仔。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小鼠基因分型
	<ol>
		<li>使用DNA提取试剂盒从小鼠脚趾或尾部样本中提取基因组DNA，具体操作按照制造商说明书进行（参见 材料表).</li>
		<li>使用紫外/可见光分光光度法测定200–400 ng基因组DNA作为模板，通过PCR扩增鉴定基因敲入事件的5'和3'连接处。
		<ol>
			<li>在95 °C下激活DNA聚合酶5分钟，然后进行38个循环的PCR&#160;95 °C 30秒，60 °C 30秒，72 °C 1秒，进行若干个循环&#160;min（1 min/1 kb），最后在 72 °C 延伸 10 min。对于 5' 连接区，使用位于 HAL 上游的正向引物，以及位于敲入片段（p2A-mCherry）上的反向引物。对于 3' 连接区，使用位于敲入片段（p2A-mCherry）上的正向引物，以及位于 HAR 下游的反向引物。表1).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在1%琼脂糖凝胶中用1×TAE缓冲液电泳6 µL PCR产物，检测预期片段大小，随后通过DNA测序验证图2D).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 基于HMEJ的 在体 内 肝细胞中的基因组编辑
<ol>
	<li>将受体C57BL/6J小鼠（8周龄）放入固定装置中，并将尾巴穿过狭缝。</li>
	<li>将HMEJ供体质粒（30 µg）和spCas9表达质粒（30 µg）溶于2 mL生理盐水中。对照实验中，将HMEJ供体质粒（30 µg）悬浮于2 mL生理盐水中（图3A）。</li>
	<li>用70%乙醇清洁小鼠尾巴，将针头插入尾静脉，并在5–7秒内注射质粒DNA溶液。拔出针头，将小鼠从固定装置中取出。</li>
	<li>注射后5–9天，采用CO2麻醉法处死小鼠。使用蠕动泵经心脏灌注0.9%生理盐水，随后灌注4%多聚甲醛，肝脏于4 °C固定过夜。</li>
	<li>用30%蔗糖溶液脱水过夜，直至组织沉入管底。</li>
	<li>将冷冻组织切片至10 µm厚度，用于肝脏样本。</li>
	<li>用0.1 M磷酸盐缓冲液（PB）清洗切片三次，随后在4 °C下与一抗（Rabbit anti-mCherry，用5% NGS稀释）孵育过夜。</li>
	<li>用PB清洗切片三次，然后在室温下于旋转摇床上与二抗（Cy3-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG）孵育2小时。</li>
	<li>用DAPI复染切片20分钟，用甘油封片于载玻片上，用于后续荧光观察（图3B）。</li>
</ol>

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<li>Harms, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Genome+Editing+Using+the+CRISPR%2FCas+System%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+human+genetics%22%5BJournal%5D)">Mouse Genome Editing Using the CRISPR/Cas System.</a> Current protocols in human genetics. 83, 11-27 (2014).</li>
<li>Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+genetically+modified+mice+using+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Nature protocols. 9 (8), 1956-1968 (2014).</li>
<li>Grompe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Is+Responsible+for+the+Neonatal+Hepatic-Dysfunction+Phenotype+of+Lethal+Albino+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Loss of Fumarylacetoacetate Hydrolase Is Responsible for the Neonatal Hepatic-Dysfunction Phenotype of Lethal Albino Mice.</a> Genes & development. 7 (12), 2298-2307 (1993).</li>
<li>Paulk, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+gene+repair+corrects+a+mouse+model+of+hereditary+tyrosinemia+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus gene repair corrects a mouse model of hereditary tyrosinemia in vivo.</a> Hepatology. 51 (4), 1200-1208 (2010).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

构建HMEJ供体质粒最关键的步骤是：（1）选择具有高DNA切割效率且sgRNA切割位点与终止密码子距离较短的sgRNA，以及（2）正确构建HMEJ供体质粒。在转基因供体载体（包含sgRNA靶位点和约800 bp同源臂）和靶基因组上均需实现CRISPR/Cas9介导的切割，以实现体内高效且精确的靶向整合。in vivo。采用基于HMEJ的方法制备基因敲入小鼠最关键的步骤是：（1）制备高质量的Cas9 mRNA和sgRNA（Cas9 mRNA和sgRNA无降解），以及（2）制备高质量的HMEJ供体质粒。该质粒对胚胎发育无毒性作用。
最近，已有报道基于NHEJ的方法可实现高效的体内基因组编辑8。然而，如先前研究所述8，通常在连接处会诱导产生多种类型的插入缺失突变（indel突变），从而难以实现精确整合。本文上述基于HMEJ的策略则表现出高度精确的靶向整合，且几乎不产生插入缺失突变。因此，基于HMEJ的策略可成为将突变序列（如点突变）替换为正确序列的理想平台，...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/56844/crisprcas9-mediated-targeted-integration-vivo-using-homology-mediated">Studying TGF-β Signaling and TGF-β-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells</a>. The phrases "surveyor assay" and "Surveyor Nuclease" have been updated to "T7E1 assay"  to " T7 endonuclease I" respectively. 
Step 1.2 in the Protocol has been updated from:
<ol class="jove_content" start="2">
	<li>Surveyor nuclease assay of sgRNA 
	NOTE: The targeting efficiency of the sgRNA used for the knock-in experiment is evaluated by surveyor nuclease assay (also known as T7 endonuclease I (T7EI) assay)17. Select the sgRNA with high DNA cleavage efficiency and a low distance between the sgRNA cutting site and the stop codon.</li>
</ol>
to:
<ol class="jove_content" start="2">
	<li>T7 endonuclease assay of sgRNA 
	NOTE: The targeting efficiency of the sgRNA used for the knock-in experiment is evaluated by T7 endonuclease (T7EI) assay17. Select the sgRNA with high DNA cleavage efficiency and a low distance between the sgRNA cutting site and the stop codon.</li>
</ol>
Figure 1 in the Representative Results has been updated from:
<img alt="CRISPR-Cas9 gene editing; sgRNA design, transfection, surveyor assay results; molecular diagram." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56844/56844fig1.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 1"> 
Figure 1: HMEJ-mediated targeted integration in vitro. 
(A) Experimental scheme for selection of sgRNAs: Six different sgRNAs (Cdx2-sgRNA1~Cdx2-sgRNA6) around the stop codon of the Cdx2 locus with a higher rank and off-target potential were chosen based on online CRISPR design tool. The protospacer adjacent motif (PAM) sequence is in red. (B) Experimental design: The Cas9-CMV-GFP expression plasmids expressing sgRNA, Cas9, and GFP were introduced into N2a cells. GFP+ cells were sorted at day 3 for surveyor assay. (C) Surveyor assay for Cdx2 targeting: 6 different sgRNAs were designed for surveyor assay. Normal N2a cell genomic DNA serves as control. *, the sgRNA used for Cdx2-2A-mCherry knock-in experiment. (D) Schematic overview of construction of HMEJ donors using Gibson assembly. (E) Schematic overview of HMEJ-mediated gene targeting strategy at Cdx2 locus. HAL/HAR, left/right homology arm; triangles, sgRNA target sites; OF/OR, outer forward/reverse primer; IF/IR, inner forward/reverse primer. Figure modified from previous report10. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56844/56844fig1large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Gene editing workflow with CRISPR, sgRNA, Cdx2 locus; includes T7E1 assay result and vector diagram." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56844/56844fig1v3.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 1"> 
Figure 1: HMEJ-mediated targeted integration in vitro. 
(A) Experimental scheme for selection of sgRNAs: Six different sgRNAs (Cdx2-sgRNA1~Cdx2-sgRNA6) around the stop codon of the Cdx2 locus with a higher rank and off-target potential were chosen based on online CRISPR design tool. The protospacer adjacent motif (PAM) sequence is in red. (B) Experimental design: The Cas9-CMV-GFP expression plasmids expressing sgRNA, Cas9, and GFP were introduced into N2a cells. GFP+ cells were sorted at day 3 for T7EI assay. (C) T7EI assay for Cdx2 targeting: 6 different sgRNAs were designed for T7EI assay. Normal N2a cell genomic DNA serves as control. *, the sgRNA used for Cdx2-2A-mCherry knock-in experiment. (D) Schematic overview of construction of HMEJ donors using Gibson assembly. (E) Schematic overview of HMEJ-mediated gene targeting strategy at Cdx2 locus. HAL/HAR, left/right homology arm; triangles, sgRNA target sites; OF/OR, outer forward/reverse primer; IF/IR, inner forward/reverse primer. Figure modified from previous report10. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56844/56844fig1v3large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/56844/crisprcas9-mediated-targeted-integration-vivo-using-homology-mediated">Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells</a>. The phrases&#160;&#34;surveyor assay&#34;&#160;and&#160;&#34;Surveyor&#160;Nuclease&#34; have&#160;been updated to &#34;T7E1 assay&#34;&#160; to &#34; T7&#160;endonuclease I&#34; respectively.&#160;

Erratum: CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

精确的靶向基因组编辑在构建基因修饰动物模型和临床治疗中常常是必需的。为了实现高效的靶向基因组编辑，人们已开发出多种策略，如锌指核酸酶（ZFN）、转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）以及CRISPR/Cas9系统。这些策略可在基因组中产生特异性的DNA双链断裂（DSB），并利用细胞内在的DNA修复机制，如同源重组（HR）1,2微同源介导的末端连接（MMEJ）3,4,5，以及非同源末端连接（NHEJ）6,7,8 诱导外源基因的靶向整合1,9基于同源重组（HR）的策略是目前最常用的基因组编辑方法，在细胞系中效率很高，但由于其仅在S期晚期/G2期发生，因此难以应用于非分裂细胞。因此，基于同源重组的策略不适用于 体内 基因组编辑。最近，基于NHEJ的策略被开发用于在小鼠组织中实现高效的基因敲入8然而，基于NHEJ的方法通常在连接处引入插入或缺失（indels），使得精确的基因组编辑难以实现，尤其是在尝试构建同框融合基因时更为困难8基于MMEJ的靶向整合能够实现精确的基因组编辑。然而，据此前报道，其仅能适度提高靶向整合效率5因此，提高精确靶向整合的效率 体内 迫切需要用于广泛的治疗应用3.
在最近发表的一项研究中，我们展示了一种基于同源介导的末端连接（HMEJ）的策略，该策略在所有已报道的方法中均表现出最高的靶向整合效率 体外 和 体内10. 本文中，我们描述了一种建立HMEJ系统的方法，以及针对目的基因的单导向RNA（sgRNA）载体的构建方法，同时描述了包含sgRNA靶位点及约800 bp同源臂的供体载体的构建方法图1）。在本方案中，我们还详细描述了DNA敲入小鼠的制备步骤，以及组织中靶向整合的简要步骤。 体内此外，基于HMEJ策略的概念验证研究证明了其具有纠正能力 法 突变与挽救 Fah-/- 肝衰竭小鼠，进一步揭示了其治疗潜力。

<table><tbody><tr><td>pX330</td><td>Addgene</td><td>42230</td><td></td></tr><tr><td>pAAV 载体</td><td>Addgene</td><td>37083</td><td></td></tr><tr><td>pX260</td><td>Addgene</td><td>42229</td><td></td></tr><tr><td>AAV_Efs_hSpCas9_NLS_FLAG-SV40</td><td>Addgene</td><td>97307</td><td>由EFs启动子驱动的编码人源密码子优化SpCas9的AAV载体</td></tr><tr><td>AAV_Actb HMEJ 供体质粒_U6_sgRNA_EF1a_GFP_polyA</td><td>Addgene</td><td>97308</td><td>用于将 p2A-mCherry 报告基因融合至小鼠 Actb 基因的 HMEJ 供体质粒。该质粒包含由 EF1a 启动子驱动的 EGFP 以及由 U6 启动子驱动的靶向 Actb 的 sgRNA。AAV 载体骨架。</td></tr><tr><td>AAV_Cdx2 HMEJ 供体质粒</td><td>Addgene</td><td>97319</td><td>用于将 p2A-mCherry 报告基因融合至小鼠 Cdx2 的 HMEJ 供体质粒。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 转染试剂</td><td>Life Technology</td><td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>Life Technologies</td><td>AM9930</td><td></td></tr><tr><td>Bbs I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0539S</td><td></td></tr><tr><td>NEB缓冲液2</td><td>New England Biolabs</td><td>B7002S</td><td></td></tr><tr><td>T7 内切酶 I</td><td>New England Biolabs</td><td>M0302L</td><td></td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi DNA 组装预混液</td><td>New England Biolabs</td><td>E2621L</td><td></td></tr><tr><td>质粒EndoFree-Midi试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td></td></tr><tr><td>MMESSAGE MMACHINE T7 ULTRA</td><td>Life Technologies</td><td>AM1345</td><td></td></tr><tr><td>MEGACLEAR 试剂盒 20 次反应</td><td>Life Technologies</td><td>AM1908</td><td></td></tr><tr><td>MEGASHORTSCRIPT T7 试剂盒 25 次反应</td><td>Life Technologies</td><td>AM1354</td><td></td></tr><tr><td>弗拉明/布朗微量移液器拉制仪</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td>&amp;nbsp;微量移液器拉制仪（参数：加热，74；拉力，60；速度，80；时间/延迟，200；压力，300）</td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃</td><td>Sutter Instrument</td><td>B100-78-10</td><td>毛细管类型（外径 1.0 mm，内径 0.78 mm，带纤维丝）&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>FemtoJet 微注射仪</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>Leica</td><td>CM1950-冷冻切片机</td><td>厚度&amp;nbsp;的&amp;nbsp;40&amp;nbsp;&amp;mu;m&amp;nbsp;用于&amp;nbsp;脑&amp;nbsp;10 &amp;mu;m&amp;nbsp;用于&amp;nbsp;肝脏</td></tr><tr><td>兔抗mCherry</td><td>GeneTex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cy3-AffiniPure 山羊抗兔 IgG</td><td>杰克逊免疫研究实验室</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>青霉素, 链霉素, 谷氨酰胺</td><td>Gibco</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>凝胶回收试剂盒</td><td>Omega</td><td>D2500-02</td><td></td></tr><tr><td>FACS</td><td>BD AriaII</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMSG</td><td>宁波三生药业</td><td>S141004</td><td></td></tr><tr><td>HCG</td><td>宁波三生医药</td><td>B141002</td><td></td></tr><tr><td>细胞松弛素B</td><td>Sigma</td><td>货号 C6762</td><td></td></tr><tr><td>含D-葡萄糖和酚红的KSOM+AA</td><td>Millipore</td><td>CAT#MR-106-D</td><td></td></tr><tr><td>含酚红的M2培养基</td><td>Millipore</td><td>货号：MR-015-D</td><td></td></tr><tr><td>矿物油</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

crispr/cas9介导的靶向整合 体内 使用基于同源介导末端连接的策略

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

作为一种有前景的基因组编辑平台，CRISPR/Cas9 系统在高效遗传操作方面具有巨大潜力，尤其适用于外源基因的靶向整合。然而，由于同源重组（HR）效率较低，以及在非分裂细胞中基于非同源末端连接（NHEJ）策略会产生多种插入缺失突变， 体内 基因组编辑仍然是一项巨大的挑战。在此，我们描述了一种基于同源介导的末端连接（HMEJ）的CRISPR/Cas9系统，用于高效 体内 精确的靶向整合。在该系统中，靶向基因组和包含同源臂（约800 bp）的供体载体在单导向RNA（sgRNA）靶序列的两侧被CRISPR/Cas9切割。这种基于HMEJ的策略可在小鼠受精卵以及肝细胞中实现高效的转基因整合 体内此外，基于HMEJ的策略为富马酰乙酰乙酸水解酶（fumarylacetoacetate hydrolase,法）突变对肝细胞的影响并实现挽救 Fah由缺陷诱导的肝衰竭小鼠。综上所述，该基于HMEJ的策略通过靶向整合，为多种应用提供了有前景的工具，包括基因修饰动物模型的构建和靶向基因治疗。

基于HMEJ的基因组编辑在小鼠胚胎中的应用：为了确定基于HMEJ方法在小鼠受精卵中的敲入效率，我们将Cas9 mRNA、靶向Cdx2基因的sgRNA以及HMEJ供体递送至小鼠受精卵中，该供体设计用于将p2A-mCherry报告基因融合至Cdx2基因的最后一个密码子（图2A）。注射后的受精卵在体外培养中发育为囊胚。为评估敲入效率，我们使用荧光显微镜检测mCherry荧光信号，发现接受HMEJ供体的囊胚中有12.9%呈mCherry阳性，且mCherry严格表达于滋养外胚层（图2B，2C）。通过对PCR阳性样本进行测序，我们还发现所有检测到的整合事件在5'和3'连接处均为精确的同框整合（图2D）。
<p class="jove_content" fo:keep-together.w...

成簇规律间隔短回文重复序列/CRISPR 相关蛋白 9（CRISPR/Cas9）系统为基因工程提供了有力工具，并实现了外源基因的靶向整合。本文描述了一种基于同源介导的末端连接（HMEJ）的高效DNA靶向整合策略 体内 以及利用CRISPR/Cas9的靶向基因治疗。

CRISPR/Cas9介导的靶向整合 体内 使用基于同源介导末端连接的策略

作为一种有前景的基因组编辑平台，CRISPR/Cas9系统在高效遗传操作方面具有巨大潜力，尤其适用于靶向整合……

该HMEJ策略的总体目标是为多种应用提供一种有前景的遗传学工具，包括构建基因修饰动物模型和靶向基因治疗。该HMEJ已通过检测标准。在遗传学和神经科学领域也可能具有关键性问题。例如如何提高外源基因在体内的精确靶向整合效率。这种基于HMEJ的策略主要优势在于能够高效地在体内纠正基因突变，因而具有潜在的治疗意义。本实验操作将由我实验室的研究生 Xing Wang 演示。开始实验前，通过荧光激活细胞分选（FACS）收集5000个已转染Cas9 sgRNA EGFP表达载体的N2a细胞，以未转染细胞作为对照。将收集的细胞在2至5微升裂解缓冲液中于56摄氏度消化30分钟。然后在95摄氏度加热并激活蛋白酶K，持续10分钟。按照制造商的说明书，通过巢式PCR扩增样品。取1微升裂解产物，与DNA聚合酶及一对识别sgRNA靶位点周围序列的外侧引物混合，在总体积为20微升的反应体系中进行首轮PCR扩增。接下来，在 95 摄氏度下激活 DNA 聚合酶 5 分钟，然后进行主 PCR 扩增，并在 72 摄氏度下进行最后延伸 5 分钟。使用 1 微升主 PCR 产物和一对嵌套内引物进行第二轮 PCR。将 300–600 纳克纯化的 PCR 产物在 20 微升 1× TC7EI 反应缓冲液中变性并重新退火。向退火后的 PCR 产物中加入一微升 T7EI 酶，在 37 摄氏度条件下消化两小时。然后将消化产物在 120 伏电压下于含 1x TAE 缓冲液的 2% 琼脂糖凝胶中电泳 40 分钟，直至片段完全分离。使用 ImageJ 分析切割与未切割 DNA 条带的强度，并计算插入缺失（indel）频率。制备Cas9 mRNA时，通过PCR扩增将T7启动子序列添加至Cas9编码区。随后，在1倍高保真DNA聚合酶反应体系中加入终浓度为0.1微摩尔的Cas9 FR引物和20纳克表达Cas9的载体。用无核酸酶水将终体积调至50微升。在95摄氏度下激活DNA聚合酶5分钟，并进行PCR反应。对T7 Cas9和PCR产物进行纯化，用于体外转录（IVT）。然后，在20微升的总体积中，使用mRNA转录试剂盒在37摄氏度下转录0.5至1微克的DNA，持续8小时。向混合物中加入1 µL DNase，在37°C下孵育15分钟以去除DNA模板。在37°C下添加poly(A)尾45分钟后，使用RNA纯化试剂盒回收Cas9 mRNA。使用高保真DNA聚合酶扩增由T7启动子驱动的sgRNA模板（操作同前一章节），并选择含有sgRNA支架序列的质粒作为模板。纯化T7 sgRNA PCR产物后，使用0.5至1微克DNA作为模板，加入短RNA转录试剂盒，在37摄氏度下进行体外转录6小时，总体积为20微升。孵育6小时后，向混合物中加入1微升DNase，在37摄氏度下继续孵育15分钟，以去除DNA模板。再次使用RNA纯化试剂盒纯化sgRNA。将sgRNA用无RNase的水稀释至500纳克/微升，并将样品置于-80摄氏度保存，最长可保存三个月。高质量的Cas9 mRNA和sgRNA无降解，以及正确的HMEJ供体质粒参数，是制备基因敲入小鼠过程中最关键的步骤。将受精胚胎放入KSOM培养基中，在37摄氏度、含5%二氧化碳的培养箱中培养。将100 纳克/微升的Cas9 mRNA、50 纳克/微升的sgRNA和100 纳克/微升的HMEJ供体质粒混合，并加入水调节终体积至10 微升。用移液器将混合液吹打混匀，置于冰上。接下来，使用微量移液器拉制仪拉制毛细玻璃针。使用具有恒定流速设置的显微注射仪，将适量的混合物注射到含有5微克/毫升细胞松弛素B的HEPES-CZB培养液液滴中具有清晰可见原核的受精卵细胞质内。最后，将注射后的受精卵在KSOM培养基中于37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养至受精后3.5天的囊胚阶段，以进行荧光观察。注射后3天，接受HMEJ供体质粒的囊胚中有12.9%呈mCherry阳性，且mCherry严格表达于滋养外胚层。通过对PCR阳性小鼠进行测序，所有检测到的整合事件在5'端和3'端连接处均为精确的同框整合。注射7天后，免疫荧光图像显示，转染的肝细胞中近一半在肝组织切片中表达mCherry。在停用NTBC后，接受Fah HMEJ和Cas9构建体的Fah阴性小鼠中，经免疫组化肝染色显示Fah校正肝细胞的增殖效果优于基于MMEJ的方法。基于HMEJ的策略可能是替换突变序列（例如将部分突变替换为正确序列）的理想平台，而基于HHEJ的方法则不适用于此类操作。本实验之后，该疗法为研究人员在精确靶向整合领域探索广泛的治疗应用开辟了道路。

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科研

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Genetics

遗传学

CRISPR/Cas9-mediated 目标集成在体内使用基于同源介导的端接连接策略

在本视频中，我们展示了在培养细胞中使用一体化 CRISPR-Cas9 系统进行基因组编辑的方法，其中 Cas9 和 sgRNA 以单一质粒构建体的形式递送至细胞。通过电穿孔技术将 CRISPR-Cas9...

一体化CRISPR基因组编辑：利用CRISPR-Cas9系统在培养细胞中基于同源定向修复的基因敲入方法

关键词：CRISPR-Cas9，基因敲入，同源定向修复，培养细胞，基因组编辑

近年来，在体细胞系中进行基因操作的能力取得了显著进展，为基础研究和应用研究带来了巨大潜力。本文介绍了两种在哺乳动物细胞系中利用CRISPR/Cas9技术生成基因敲除并进行筛选的方法，一种使用可选择标记，另一种则不使用可选择标记。...

基于选择依赖性与非依赖性的CRISPR/Cas9介导的哺乳动物细胞基因敲除生成方法

关键词：CRISPR/Cas9，基因敲除，哺乳动物细胞，选择标记，非选择性筛选，基因编辑

本方案概述了一种基于CRISPR/Cas9的基因编辑系统，用于修复哺乳动物细胞中的点突变。在此，我们采用组合式基因编辑方法，并结合详细的后续实验策略，以检测靶位点处的插入缺失（indel）形成情况——实质上是对靶位点的诱变效应进行分析。...

一种检测人细胞中CRISPR/Cas9与单链寡脱氧核苷酸介导的定点突变修复所致原位诱变性的标准方法

高效构建与鉴定模式生物Danio rerio中CRISPR/Cas9介导的基因敲除

利用预先组装的Cas9核糖核蛋白复合物（RNP）是一种实现精确、高效基因组编辑的有力方法。本文重点介绍该方法在多种细胞和生物体中的应用，包括原代人源细胞以及经典和新兴的模式生物。...

利用Cas9核糖核蛋白在多种细胞和生物体中实现增强的基因组编辑

本文介绍了一种利用CRISPR-Cas9核糖核蛋白和同源依赖性修复模板对秀丽隐杆线虫（C.

使用 CRISPR/Cas9 核糖核蛋白在 C. elegans 中快速简便地生成基因组点突变的流程

本文介绍了一种利用CRISPR/Cas9技术在人诱导性多能干细胞中对内源性表达的蛋白质进行荧光标记的实验方案。通过荧光激活细胞分选富集可能经过编辑的细胞，并建立单克隆细胞系。...

利用CRISPR/Cas9在人类诱导多能干细胞中进行内源性蛋白标记

该方案描述了如何在基因组中实现定点修饰 按蚊属 疟疾蚊子使用 φC31 系统。所描述的修饰包括基因组中转基因盒的整合与置换...

定点 φC31介导的整合与盒式交换 按蚊属 疟疾的传播媒介

本研究提供了一种基于CRISPR/Cas9核糖核酸酶的蝗虫纯合突变体构建的系统优化流程，以及蝗虫卵的冷冻保存与复苏的详细方法。...

利用CRISPR/Cas9技术构建飞蝗纯合突变体

CRISPR等技术面临的一个重大障碍是脱靶效应，其可能破坏重要基因。“环化用于 体外...

使用CIRCLE-Seq检测基因编辑脱靶效应

提供了一种详细的方案，用于利用CRISPR/Cas9技术在原代人T细胞中实现大片段、多顺反子结构的高效靶向敲入。 通过...

非病毒法改造人原代T细胞 通过 同源介导的末端连接靶向整合大型DNA模板

了解CRISPR/Cas9介导的HMEJ策略用于体内高效靶向基因整合。该方法可精准纠正基因突变，为基因治疗和遗传修饰动物模型构建提供有力工具。

CRISPR/Cas9介导的靶向整合体内使用基于同源介导末端连接的策略

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