16S rRNA扩增子测序法表征粪便微生物的标准化操作流程

本高通量16S rRNA扩增子测序的总体目标是从粪便样本出发，表征全局微生物组的组成。该方法有助于回答与多个研究领域相关的关键科学问题，例如代谢、消化以及肠道和系统性炎症相关的整体微生物组成。该技术的主要优势在于，它能够对粪便样本中存在的需氧和厌氧微生物群落进行全面普查，包括那些难以培养的细菌。

该方法得益于快速的无结肠处理泵线，可同时处理大量粪便样本，并获得稳定且可重复的16S rRNA扩增子测序结果。在本方案中，应使用大小约相当于铅笔橡皮擦的冷冻粪便样本。样本应保存在2毫升离心管中，并放入已剪去尖端的采样拭子。

设置阴性对照，包括不含粪便的拭子、内部重复对照，以及来自原始粪便样本的样本重复，作为内部对照。首先将提取液和稀释液在室温下解冻，同时将粪便样本和对照样本也一并解冻。解冻后，向每个样本管中加入 250 µL 提取液，并使用涡旋振荡器将粪便充分混入溶液中。

此时引入仅含缓冲液的阴性对照。随后，将样品置于沸水浴中加热10分钟。沸水浴孵育后，向每个样品中加入250 µL稀释液，并涡旋混匀样品。

然后将样本管保存在 4 摄氏度，直至可进行 PCR。在已清除潜在 DNA 污染物（如模板和扩增子）的 PCR 前工作站中设置 PCR 反应。根据引物的条形码进行标记，并用双蒸水稀释至 50 微摩尔的浓度。

将稀释后的引物储备液于 -20 摄氏度保存，使用前需完全解冻。每个样本准备一个 96 孔板，用于进行 32 个三复孔 PCR 反应。将引物溶液恢复至室温后，将正向引物和 32 种反向引物的等分试样分别稀释至 5 µM，用于 PCR 反应。

然后配制足够进行100次反应的PCR基础混合液。将100微升5微摩尔的正向引物与1毫升2倍浓度的PCR预混液及400微升双蒸水混合。充分涡旋混匀后，取15微升该混合液加入96孔板的每个孔中。

接下来，每三个孔为一组，每孔加入一微升浓度为五微摩尔的反向引物。以此方式，将全部32种不同的反向索引加入到微孔板中。然后向每个孔中加入四微升提取的DNA样本。

在洁净工作台上进行此操作。现在开始PCR反应，先进行3分钟的初始变性，随后进行35个循环，每个循环包括1分钟变性、在55摄氏度退火1分钟和1分钟延伸。最后进行10分钟的最终延伸。

反应完成后，在专用于扩增后操作的PCR工作台中进行后续操作。将每组三个复孔的PCR产物合并至同一离心管中，每份样本总体积为60微升。随后取各样本4微升，在含溴化乙锭染色的1%琼脂糖凝胶上电泳。

阳性扩增产物将出现在 375 至 425 个碱基对之间。阴性对照与研究中的阳性扩增产物一同进行处理并展示。根据制造商说明书对阳性反应产物的 DNA 浓度进行定量。

然后将每种产物的500纳克DNA加入同一根离心管中。充分涡旋混匀，取200微升样品在1%琼脂糖凝胶上电泳，步骤同前。随后从凝胶中切取375至425碱基对之间的条带。

接下来，准备文库用于测序。根据制造商说明书，使用高灵敏度双链DNA检测试剂盒测定浓度，随后使用高灵敏度分离与分析试剂盒进行检测。然后将文库稀释至7皮摩尔，并以4:1的比例与对照文库混合。

现在样本已准备好进行测序，将其转移至测序仪。本研究所述的从粪便样本制备文库的方法，已被用于分析疑似感染性腹泻住院患者的微生物组。同时，粪便样本也在微生物学实验室中接受了传统的培养检测。

对健康成年人的粪便样本进行了测序以进行比较。实验中包含多个阴性对照样本，包括无模板的PCR反应、在提取和稀释溶液中对洁净无菌拭子进行的PCR、以及对混合的提取和稀释溶液进行的PCR。这些阴性对照样本的总读数均少于118条，主要为支原体属（Mycoplasma）分类单元。

标准样本在质控后平均测序深度超过 10,000 条读长，且未检测到支原体。通过使用两种不同的带条形码的引物对 16 份粪便样本进行处理，从而为每份样本构建两个不同的文库，以此评估样本的一致性与变异性。在传统培养技术中，一半的样本对弯曲杆菌、沙门氏菌或志贺氏菌呈阳性。

利用16S测序结果，在系统发育水平上绘制的面积图显示，来自相同样本但不同传统培养结果的文库之间具有一致性。在这组16对配对样本中，主坐标分析表明，样本对之间高度聚集，且培养阳性样本与培养阴性样本在PC1值上存在显著差异。对样本的进一步分析显示，高水平的变形菌门（Proteobacteria）仅在住院患者中被发现。

观看本视频后，您应能够充分理解如何利用无菌肠道DNA提取和PCR技术，同时处理大量粪便样本，以生成微生物可变V4区的条形码测序文库。在进行该实验操作时，务必记住应在有序且洁净的环境中进行，尤其是在构建文库的过程中。切勿忘记，处理人类粪便样本具有潜在生物危害，因此在操作过程中必须始终佩戴个人防护装备。