Name: 16S rRNA-扩增子测序法对粪便微生物特性的指导协议 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: 学习使用高通量16S rRNA扩增子测序技术对粪便样本进行微生物组分析的标准化方案。该方法可高效处理大量样本，实现需氧菌和厌氧菌的全面鉴定，为代谢、消化及炎症相关研究提供可靠数据支持。

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本工作部分由 I-CORE 项目（资助号 41/11）、以色列科学基金会（资助号 908/15）以及欧洲克罗恩病和结肠炎组织（ECCO）资助支持。

本研究已获得谢巴当地研究伦理委员会的伦理批准，所有方法均按照相关指南和规定进行。由于所使用的粪便样本已作为临床检查的一部分提交至微生物学核心实验室，且除年龄、性别和微生物检测结果外不包含任何可识别的患者信息，因此该研究方案获得了当地伦理审查委员会的患者知情同意豁免。对健康志愿者已获取书面知情同意，且本研究已获得机构审查委员会批准。其中部分样本此前已在一项分析中使用过1。
1. 样品处理
<ol>
	<li>使用无菌棉签从新鲜粪便样本中采集约 5 mm2 的样本（大小约相当于铅笔橡皮擦），置于试管中（参见材料表）。所有含粪便样本的棉签须在 24 小时内储存于 -80 °C。粪便棉签可在此温度下保存至后续处理。</li>
</ol>
2. DNA 提取
<ol>
	<li>在室温下解冻提取液和稀释液（见材料表）。</li>
	<li>将粪便采样拭子转移至一个空的2 mL收集管中（见材料表）。使用干净的剪刀剪短拭子柄，以确保管盖能够闭合，并尽量减少交叉污染。向每支含有粪便拭子的收集管中加入250 μL提取液，并涡旋混匀。</li>
	<li>将样本置于沸水浴中加热10分钟（95–100 °C）。向每个样本中加入250 μL稀释液，并涡旋混匀。</li>
	<li>将含有提取DNA和拭子的2 mL管置于4 °C保存。</li>
</ol>
3. PCR 与文库构建
在执行步骤 3.1 和 3.2 时，应在提供洁净、无模板和无扩增子污染环境的 PCR 工作站中操作。
<ol>
	<li>根据条形码标记引物（表1）。将每种引物用双蒸水（DDW）稀释至50 μM浓度，并于-20 °C保存。</li>
	<li>使用96孔板进行PCR反应。每块板可包含32个不同的样本，由32种不同的索引引物标记。将正向引物和32种反向引物在室温下解冻，并稀释至5 μM。</li>
	<li>配制100次PCR反应的混合液（每孔终体积为20 μL）：混合100 μL的5 μM正向引物、1 mL 2× PCR预混液和400 μL双蒸水。向每个孔中加入15 μL该PCR混合液（共96孔）。向3个不同的孔中各加入1 μL的5 μM带索引的反向引物（32种不同引物设三个重复，共96孔）。</li>
	<li>在专用于预PCR操作的区域（即无模板和扩增子污染的洁净工作台）中，向每个反应体系中加入4 μL提取的DNA样本（每个提取的DNA样本进行三个重复扩增——每块96孔板包含32个样本）。</li>
	<li>按以下程序运行PCR：94 °C预变性3分钟；随后进行35个循环，每个循环包括94 °C变性1分钟、55 °C退火1分钟、72 °C延伸1分钟；最后72 °C终延伸10分钟。</li>
	<li>在另一指定为后PCR操作区的工作台上，将每个样本的三个重复PCR反应产物合并至同一离心管中（每个样本共60 μL）。</li>
	<li>为评估PCR扩增产物的质量，取每份合并后的PCR反应产物4 μL，在含溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶上电泳。在260 nm紫外光下，阳性扩增产物应显示大小为375–425 bp的预期条带。仅这些产物进入后续步骤。 
	注意：每个样本进行三个重复扩增，即每个样本在三个独立的PCR反应中扩增。请勿按比例放大反应体系。</li>
</ol>
4. 文库定量与纯化
<ol>
	<li>为了获得所有PCR样本的等摩尔浓度混合物，使用双链DNA（dsDNA定量试剂）荧光核酸染料（参见材料表）对每个扩增子进行定量，该方法适用于同时定量大量样本。 
	注意：由于扩增子的大小范围不确定，实际加载等摩尔浓度时应以纳克（ng）为单位的准确质量为准。</li>
	<li>将每种样本各500 ng加入同一无菌离心管中，涡旋振荡以充分混匀。</li>
	<li>取200 μL混合文库在含溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶上电泳。根据试剂盒说明书（参见材料表），使用凝胶回收试剂盒从凝胶中切回收375–425 bp的条带，并将回收的文库洗脱于80 μL去离子水（DDW）中。 
	注意：应对混合文库进行片段大小选择，以减少宿主DNA产生的非特异性扩增产物。</li>
	<li>根据制造商说明书，使用高灵敏度dsDNA检测试剂盒测定最终文库浓度（参见材料表）。同时根据制造商说明书，使用高灵敏度DNA文库分离与分析试剂盒精确测定文库片段大小（参见材料表）。</li>
</ol>
5. 测序
<ol>
	<li>根据测序仪的操作规程，用20%的对照文库将混合文库稀释至7 pM（参见材料表）。</li>
	<li>测序时使用定制设计的读段引物，该引物与V4扩增引物互补（参见表1）。</li>
	<li>使用第三个定制设计的测序引物，在额外的一个循环中读取条形码（参见表1），并按照制造商的规格生成每端175个碱基长度的双端测序读段（paired-end reads）。</li>
	<li>运行测序仪，并按照制造商的方案获得FASTQ文件。</li>
</ol>
6. 数据处理
<ol>
	<li>使用 QIIME 2 版本 2017.7.0 实现的数据整理流程，将重叠的成对末端 FASTQ 文件拼接并进行处理17。根据样本特异性条形码对读段进行解复用。</li>
	<li>使用 DADA218 进行质量控制和序列变体（SVs）检测。从 3' 端截去 13 个碱基，从 5' 端截去 15 个碱基，丢弃预期错误数超过 2 的读段。采用共识方法识别并去除嵌合体——在每个样本中单独检测嵌合体，并去除在足够比例样本中被鉴定为嵌合体的序列。</li>
	<li>使用基于 2013 年 8 月版本 99% 相似性 Greengenes 数据库训练的朴素贝叶斯分类器，对 175 条长读段及正向/反向引物组进行 SVs 的分类学注释6。</li>
	<li>将所有样本稀疏化至 2,146 条序列的深度。</li>
	<li>在稀疏化后的样本上使用未加权 UniFrac 方法测量 β-多样性（样本间多样性19,20），以避免样本量效应。</li>
	<li>利用所得距离矩阵进行主坐标分析（PCoA）。 
	注：数据处理脚本和映射文件作为补充材料提供（补充材料 1 和 2）。</li>
</ol>

<ol><li>Braun, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fecal+microbial+characterization+of+hospitalized+patients+with+suspected+infectious+diarrhea+shows+significant+dysbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Fecal microbial characterization of hospitalized patients with suspected infectious diarrhea shows significant dysbiosis.</a> Scientific Reports. 7, 1088(2017).</li>
<li>De Filippo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+diet+in+shaping+gut+microbiota+revealed+by+a+comparative+study+in+children+from+Europe+and+rural+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Impact of diet in shaping gut microbiota revealed by a comparative study in children from Europe and rural Africa.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 14691-14696 (2010).</li>
<li>Yatsunenko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+gut+microbiome+viewed+across+age+and+geography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human gut microbiome viewed across age and geography.</a> Nature. 486, 222-227 (2012).</li>
<li>Rodriguez, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+composition+of+the+gut+microbiota+throughout+life%2C+with+an+emphasis+on+early+life%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology+in+Health+and+Disease%22%5BJournal%5D)">The composition of the gut microbiota throughout life, with an emphasis on early life.</a> Microbial Ecology in Health and Disease. 26, 26050(2015).</li>
<li>Turnbaugh, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+obesity-associated+gut+microbiome+with+increased+capacity+for+energy+harvest%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest.</a> Nature. 444, 1027-1031 (2006).</li>
<li>McDonald, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+Greengenes+taxonomy+with+explicit+ranks+for+ecological+and+evolutionary+analyses+of+bacteria+and+archaea%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">An improved Greengenes taxonomy with explicit ranks for ecological and evolutionary analyses of bacteria and archaea.</a> The ISME Journal. 6, 610-618 (2012).</li>
<li>Bakken, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treating+Clostridium+difficile+infection+with+fecal+microbiota+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Treating Clostridium difficile infection with fecal microbiota transplantation.</a> Clinical Gastroenterology and Hepatology. 9, 1044-1049 (2011).</li>
<li>Khoruts, A., Dicksved, J., Jansson, J. K., Sadowsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+composition+of+the+human+fecal+microbiome+after+bacteriotherapy+for+recurrent+Clostridium+difficile-associated+diarrhea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Changes in the composition of the human fecal microbiome after bacteriotherapy for recurrent Clostridium difficile-associated diarrhea.</a> Journal of Clinical Gastroenterology. 44, 354-360 (2010).</li>
<li>Nood, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duodenal+infusion+of+donor+feces+for+recurrent+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Duodenal infusion of donor feces for recurrent Clostridium difficile.</a> The New England Journal of Medicine. 368, 407-415 (2013).</li>
<li>Koplan, J. P., Benfari Ferraro, M. J., Fineberg, H. V., Rosenberg, M. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/6105529">Value of stool cultures.</a> The Lancet. 316, 413-416 (1980).</li>
<li>Platts-Mills, J. A., Liu, J., Houpt, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+concepts+in+diagnostics+for+infectious+diarrhea%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">New concepts in diagnostics for infectious diarrhea.</a> Mucosal Immunology. 6, 876-885 (2013).</li>
<li>Bokulich, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality-filtering+vastly+improves+diversity+estimates+from+Illumina+amplicon+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Quality-filtering vastly improves diversity estimates from Illumina amplicon sequencing.</a> Nature Methods. 10, 57-59 (2013).</li>
<li>Leek, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tackling+the+widespread+and+critical+impact+of+batch+effects+in+high-throughput+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Tackling the widespread and critical impact of batch effects in high-throughput data.</a> Nature Reviews Genetics. 11, (2010).</li>
<li>Dubilier, N., McFall-Ngai, M., Zhao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Create+a+global+microbiome+effort%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Create a global microbiome effort.</a> Nature. 526, 631-634 (2015).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+patterns+of+16S+rRNA+diversity+at+a+depth+of+millions+of+sequences+per+sample%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample.</a> PNAS. 108, 4516-4522 (2011).</li>
<li>Flores, G. E., Henley, J. B., Fierer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+direct+PCR+approach+to+accelerate+analyses+of+human-associated+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A direct PCR approach to accelerate analyses of human-associated microbial communities.</a> PloS One. 7, (2012).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QIIME+allows+analysis+of+high-throughput+community+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data.</a> Nature Methods. 7, 335-336 (2010).</li>
<li>Callahan, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DADA2%3A+High-resolution+sample+inference+from+Illumina+amplicon+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data.</a> Nature Methods. 13, 581-583 (2016).</li>
<li>Lozupone, C., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UniFrac%3A+A+new+phylogenetic+method+for+comparing+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">UniFrac: A new phylogenetic method for comparing microbial communities.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71, 8228-8235 (2005).</li>
<li>Lozupone, C., Lladser, M. E., Knights, D., Stombaugh, J., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UniFrac%3A+An+effective+distance+metric+for+microbial+community+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">UniFrac: An effective distance metric for microbial community comparison.</a> The ISME Journal. 5, 169-172 (2011).</li>
<li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+16S+rRNA+gene+for+identification+of+a+broad+range+of+clinically+relevant+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Use of 16S rRNA gene for identification of a broad range of clinically relevant bacterial pathogens.</a> PloS One. 10, e0117617(2015).</li>
<li>Hiergeist, A., Gläsner, J., Reischl, U., Gessner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyses+of+intestinal+microbiota%3A+culture+versus+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+Journal%22%5BJournal%5D)">Analyses of intestinal microbiota: culture versus sequencing.</a> ILAR Journal. 56, 228-240 (2015).</li>
<li>Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+clinical+microbiology+with+bacterial+genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing.</a> Nature Reviews Genetics. 13, 601-612 (2012).</li>
<li>Salipante, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+16S+rRNA+next-generation+sequencing+of+polymicrobial+clinical+samples+for+diagnosis+of+complex+bacterial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid 16S rRNA next-generation sequencing of polymicrobial clinical samples for diagnosis of complex bacterial infections.</a> PloS One. 8, e65226(2013).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high-throughput+microbial+community+analysis+on+the+Illumina+HiSeq+and+MiSeq+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms.</a> The ISME Journal. 6, 1621-1624 (2012).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

16S rRNA扩增子测序和宏基因组鸟枪法测序在临床微生物学应用中日益普及21,22,23。这些技术的优势在于能够更全面地捕获可培养和不可培养的分类单元，提供关于病原接种物相对丰度的数据，并能更精确地识别多微生物感染特征24。微生物组研究领域的进展产生了大量数据，但由于各种研究方法缺乏一致性，这些数据难以相互比较。近年来，多个研究联盟已尝试解决其中部分问题。本实验方案的文库构建流程与地球微生物组计划（Earth Microbiome Project, EMP）类似，但额外提供了从粪便样本中提取DNA直至分析流程的详细分步操作指南。
既往研究已采用16S rRNA测序技术分析健康非住院个体及疑似感染性腹泻住院患者的粪便样本微生物组成模式，并与传统培养结果进行比较。该分析结果显示，住院患者的变形菌门（Proteobacteria）分类群丰度显著升高<su...

人们已投入大量努力以更好地理解微生物组的多样性和丰度，这是揭示个体在健康与病理状态下差异与相似性的另一个方面。年龄2,3、地理4、生活方式5,6以及疾病5已被证明与肠道微生物组的组成相关，但许多条件和人群尚未得到充分表征。最近有报道称，微生物组可被改造用于治疗目的7,8,9。因此，进一步了解各种生理状态与微生物组成之间的关系，是优化未来潜在干预措施的第一步。
传统的微生物培养方法受限于较低的产量10,11，且通常被概念化为一种二元状态，即细菌在肠道中要么存在，要么不存在。基于DNA的高通量测序技术已彻底改变了微生物生态学研究，使得能够全面捕获微生物群落中的所有成员。然而，测序读长和质量仍然是准确进行分类学注释的重要障碍12。此外，基于高通量的实验可能受到批次效应的影响，即测量结果受到非生物或非科学变量的干扰13。近年来，已启动多个项目以研究人类微生物组，包括美国肠道项目（American Gut Project）、美国人类微生物组计划（US Human Microbiome Project）以及英国MetaHIT项目。这些计划产生了大量数据，但由于研究方法缺乏一致性，数据之间难以直接比较。一些国际项目，如国际人类微生物组联盟（International Human Microbiome Consortium）、国际人类微生物组标准项目（International Human Microbiome Standards Project）以及美国国家标准与技术研究院（National Institute of Standards and Technology, NIST），已尝试解决其中部分问题14，并制定了微生物组测量的标准，以期实现可靠且可重复的研究结果。本文描述了一种整合性实验流程，结合了多种广泛应用的方法15,16，用于从粪便样本采集到数据分析的16S rRNA高通量测序（16S-seq）。该流程采用一种无柱式PCR方法，最初设计用于植物DNA的直接提取16，可在相对较短的时间内同时处理大量粪便样本，并获得高质量的扩增DNA，用于在通用测序平台上对微生物16S rRNA基因的可变区V4进行靶向测序。本实验方案旨在为希望开展16S rRNA扩增子测序研究的科研人员提供一种稳健、可重复、易于操作且详尽的技术指导，并包含关键的实验对照。通过提供系统化、分步详述的操作流程，可最大限度地减少批次效应，从而提高不同实验室之间测序结果的可比性。

<table><tbody><tr><td>引物</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>提取液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7526</td><td></td></tr><tr><td>稀释液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5688</td><td></td></tr><tr><td>Kapa HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit</td><td>KAPABIOSYSTEMS</td><td>KK2601</td><td>PCR 预混液</td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA 检测试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>P7589</td><td>dsDNA 定量试剂</td></tr><tr><td>MinElute 凝胶回收试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28606</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Amresco</td><td>0710-250G</td><td></td></tr><tr><td>超纯无 DNase 和 RNase 水</td><td>Biological Industries</td><td>01-866-1A</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS 检测试剂盒</td><td>Molecular probes</td><td>Q32854</td><td>dsDNA 检测试剂盒</td></tr><tr><td>High Sensitivity D1000</td><td>Agilent Technologies</td><td>Screen Tape 5067-5582</td><td>分离与分析</td></tr><tr><td>Screen Tape 检测</td><td>Agilent Technologies</td><td>试剂 5067-5583</td><td>用于 DNA 文库</td></tr><tr><td>PhiX Control v3</td><td>Illumina</td><td>15017666</td><td>对照文库</td></tr><tr><td>MiSeq 试剂盒 v2（500 个循环）</td><td>Illumina</td><td>MS-102-2003</td><td></td></tr><tr><td>溴化乙锭</td><td>Amresco</td><td>E406-10mL-TAM</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 收集管</td><td>SARSTEDT</td><td>72.695.400</td><td>Safe Seal 收集管</td></tr><tr><td>聚丙烯试管中的塑料棒状拭子</td><td>STERILE INTERIOR</td><td>23117</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR 仪</td><td>Applied Biosystems</td><td>2720 Thermal Cycler</td><td></td></tr><tr><td>测序仪</td><td>Illumina</td><td>Miseq</td><td></td></tr><tr><td>PCR 工作站</td><td>Biosan</td><td>UV-cleaner</td><td></td></tr><tr><td>剪刀</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>Scientific Industries</td><td>Vortex-Genie 2</td><td></td></tr></tbody></table>

16s rrna扩增子测序法表征粪便微生物的标准化操作流程

Guided Protocol for Fecal Microbial Characterization by 16S rRNA-Amplicon Sequencing

人类肠道微生物组在保护细胞免受损伤、能量和营养物质代谢以及促进免疫功能方面发挥着核心作用。肠道菌群组成偏离健康状态（即菌群失调）可能损害重要生理功能，导致病理状况的发生。近年来持续开展的研究工作致力于表征微生物组成与人类健康及疾病之间的关联。
高通量测序技术的进步使得肠道微生物组成的表征成为可能。这些方法包括16S rRNA扩增子测序和宏基因组测序。16S rRNA扩增子测序用于分析分类学组成，而宏基因组测序则提供有关基因预测和功能注释的额外信息。采用针对16S rRNA基因可变区的靶向测序方法的一个优势是，其成本显著低于宏基因组测序。16S rRNA基因的序列差异被用作微生物指纹，以鉴定和定量单个样本中的不同分类群。
目前，多项国际性工作已制定了16S rRNA扩增子测序的标准。然而，多项研究报道，批次效应是导致结果变异的一个常见来源。为最大限度减少这一影响，必须实施统一的样本采集、处理和测序操作流程。本方案整合了从粪便样本采集到数据分析的多个广泛使用的标准流程。该方案包含一种无需离心柱的直接PCR方法，可同时处理大量粪便样本并进行DNA提取，以及对V4区进行PCR扩增。此外，本方案还描述了数据分析流程，并提供了基于最新版本QIIME（QIIME 2 2017.7.0版）和DADA2的分析脚本。这一逐步操作的实验方案旨在为希望以稳健、可重复、易于使用且详尽的方式开展16S rRNA扩增子测序的研究人员提供指导。

该实验方案的示意图如图1所示。
我们前瞻性地收集了住院的疑似感染性腹泻患者的粪便样本。这些样本于2015年2月至5月期间提交至谢巴医学中心临床微生物实验室，此前已有描述1。粪便样本同时接受了临床微生物实验室进行的传统微生物培养以及广谱高通量16S测序。此外，还对健康成年人的粪便样本进行了测序，以作比较。
本分析重点关注数据的质量控制，并展示使用 QIIME217 获得的代表性输出结果。首先，对6个阴性对照样本的测序结果进行了质量控制审查，包括：i) 无模板的PCR反应，ii) 对提取和稀释溶液中洁净无菌拭子的PCR扩增，以及 iii) 对混合提取液和稀释液的PCR扩增。<stro...

本文描述了一种高通量16S rRNA扩增子测序的详细标准化方案。该方案从粪便样本采集到数据分析，提供了一套整合性、统一性、可行且低成本的操作流程。本方案能够以严格的质控标准和多个对照，实现对大量样本的分析。

16S rRNA扩增子测序法表征粪便微生物的标准化操作流程

人类肠道微生物组在保护细胞免受损伤、能量和营养物质代谢以及促进免疫功能方面发挥着核心作用。

本高通量16S rRNA扩增子测序的总体目标是从粪便样本出发，表征全局微生物组的组成。该方法有助于回答与多个研究领域相关的关键科学问题，例如代谢、消化以及肠道和系统性炎症相关的整体微生物组成。该技术的主要优势在于，它能够对粪便样本中存在的需氧和厌氧微生物群落进行全面普查，包括那些难以培养的细菌。该方法得益于快速的无结肠处理泵线，可同时处理大量粪便样本，并获得稳定且可重复的16S rRNA扩增子测序结果。在本方案中，应使用大小约相当于铅笔橡皮擦的冷冻粪便样本。样本应保存在2毫升离心管中，并放入已剪去尖端的采样拭子。设置阴性对照，包括不含粪便的拭子、内部重复对照，以及来自原始粪便样本的样本重复，作为内部对照。首先将提取液和稀释液在室温下解冻，同时将粪便样本和对照样本也一并解冻。解冻后，向每个样本管中加入 250 µL 提取液，并使用涡旋振荡器将粪便充分混入溶液中。此时引入仅含缓冲液的阴性对照。随后，将样品置于沸水浴中加热10分钟。沸水浴孵育后，向每个样品中加入250 µL稀释液，并涡旋混匀样品。然后将样本管保存在 4 摄氏度，直至可进行 PCR。在已清除潜在 DNA 污染物（如模板和扩增子）的 PCR 前工作站中设置 PCR 反应。根据引物的条形码进行标记，并用双蒸水稀释至 50 微摩尔的浓度。将稀释后的引物储备液于 -20 摄氏度保存，使用前需完全解冻。每个样本准备一个 96 孔板，用于进行 32 个三复孔 PCR 反应。将引物溶液恢复至室温后，将正向引物和 32 种反向引物的等分试样分别稀释至 5 µM，用于 PCR 反应。然后配制足够进行100次反应的PCR基础混合液。将100微升5微摩尔的正向引物与1毫升2倍浓度的PCR预混液及400微升双蒸水混合。充分涡旋混匀后，取15微升该混合液加入96孔板的每个孔中。接下来，每三个孔为一组，每孔加入一微升浓度为五微摩尔的反向引物。以此方式，将全部32种不同的反向索引加入到微孔板中。然后向每个孔中加入四微升提取的DNA样本。在洁净工作台上进行此操作。现在开始PCR反应，先进行3分钟的初始变性，随后进行35个循环，每个循环包括1分钟变性、在55摄氏度退火1分钟和1分钟延伸。最后进行10分钟的最终延伸。反应完成后，在专用于扩增后操作的PCR工作台中进行后续操作。将每组三个复孔的PCR产物合并至同一离心管中，每份样本总体积为60微升。随后取各样本4微升，在含溴化乙锭染色的1%琼脂糖凝胶上电泳。阳性扩增产物将出现在 375 至 425 个碱基对之间。阴性对照与研究中的阳性扩增产物一同进行处理并展示。根据制造商说明书对阳性反应产物的 DNA 浓度进行定量。然后将每种产物的500纳克DNA加入同一根离心管中。充分涡旋混匀，取200微升样品在1%琼脂糖凝胶上电泳，步骤同前。随后从凝胶中切取375至425碱基对之间的条带。接下来，准备文库用于测序。根据制造商说明书，使用高灵敏度双链DNA检测试剂盒测定浓度，随后使用高灵敏度分离与分析试剂盒进行检测。然后将文库稀释至7皮摩尔，并以4:1的比例与对照文库混合。现在样本已准备好进行测序，将其转移至测序仪。本研究所述的从粪便样本制备文库的方法，已被用于分析疑似感染性腹泻住院患者的微生物组。同时，粪便样本也在微生物学实验室中接受了传统的培养检测。对健康成年人的粪便样本进行了测序以进行比较。实验中包含多个阴性对照样本，包括无模板的PCR反应、在提取和稀释溶液中对洁净无菌拭子进行的PCR、以及对混合的提取和稀释溶液进行的PCR。这些阴性对照样本的总读数均少于118条，主要为支原体属（Mycoplasma）分类单元。标准样本在质控后平均测序深度超过 10,000 条读长，且未检测到支原体。通过使用两种不同的带条形码的引物对 16 份粪便样本进行处理，从而为每份样本构建两个不同的文库，以此评估样本的一致性与变异性。在传统培养技术中，一半的样本对弯曲杆菌、沙门氏菌或志贺氏菌呈阳性。利用16S测序结果，在系统发育水平上绘制的面积图显示，来自相同样本但不同传统培养结果的文库之间具有一致性。在这组16对配对样本中，主坐标分析表明，样本对之间高度聚集，且培养阳性样本与培养阴性样本在PC1值上存在显著差异。对样本的进一步分析显示，高水平的变形菌门（Proteobacteria）仅在住院患者中被发现。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用无菌肠道DNA提取和PCR技术，同时处理大量粪便样本，以生成微生物可变V4区的条形码测序文库。在进行该实验操作时，务必记住应在有序且洁净的环境中进行，尤其是在构建文库的过程中。切勿忘记，处理人类粪便样本具有潜在生物危害，因此在操作过程中必须始终佩戴个人防护装备。

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生物学

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