使用定量实时逆转录PCR对中国猕猴血浆中微小RNA水平进行绝对定量

本实验的总体目标是利用定量实时逆转录PCR技术测定血浆微小RNA的绝对表达水平。该方法有助于评估血浆微小RNA的含量，即使其表达水平较低亦可检测。该技术的主要优势在于，所获得的测量数据可与其他不同研究或实验室的结果进行比较。

该技术的影响可延伸至其他物种的样本，因为可以使用合成 RNA 或核苷酸生成标准曲线。该方法可为转化研究提供见解，以探索有前景的安全性生物标志物。首先，将从食蟹猴股静脉获取的冷冻血浆样本在冰上解冻。

在RNA提取前，将含有氯仿的裂解试剂置于冰上冷却。然后，向200微升样品中加入1,000微升裂解试剂，并涡旋震荡1分钟，以确保充分混匀。

然后向样品中加入5 µL的5 nM合成秀丽隐杆线虫microRNA和200 µL氯仿。涡旋振荡样品1分钟以充分混匀。随后将样品置于冰上2至3分钟。

接下来，在 4°C 条件下以 12,000 G 离心 15 分钟。然后，小心地将 650 微升水相转移至新的微量离心管中。随后，向水相中加入 975 微升乙醇，并用移液器反复吹打数次以确保充分混匀。

将样品转移至相应的层析柱和适配器中，然后使用真空 manifold 装置真空干燥 3 分钟。随后向层析柱中加入 200 µL 乙醇，并再次真空干燥 1 分钟。真空干燥后，向层析柱中加入 800 µL RWT 缓冲液，再次真空干燥 2 分钟。

然后向柱中加入 800 微升 RPE 缓冲液，真空干燥 2 分钟。加入 RPE 缓冲液两次，每次均进行真空干燥。接着，向柱中加入 300 微升乙醇。

加入乙醇后，真空干燥一分钟。然后将柱子转移至新的微量离心管中，在室温下以12,000 G离心一分钟。离心后，将柱子转移至另一新的微量离心管中，并加入50 µL无核酸酶水。

将层析柱在室温下静置三分钟，然后在室温下以8,000 G离心一分钟。最后，将洗脱液储存于-80摄氏度，直至使用。为制备与目标microRNA相对应的合成RNA寡核苷酸浓度，将储备液稀释10倍，得到最高浓度的工作液，用于绘制标准曲线。

接下来，为构建逆转录引物的多重混合体系，将针对目标 microRNA 的20倍浓度引物等体积混合。然后，配制逆转录反应体系。再向5微升RNA样本中加入10微升逆转录反应体系。

用移液器反复吹打混合两者。然后将混合物置于冰上孵育5分钟。将样品放入PCR仪后，开始运行程序循环。

程序结束后，将反转录样品置于负80摄氏度保存。为配制多重检测引物混合液，取等体积的5微升对应靶向微小RNA（microRNA）的检测引物，加入含有Tris-EDTA缓冲液的离心管中，终体积为1,000微升。接下来，配制预扩增反应体系。

反应混合液制备完成后，将22.5 µL预扩增反应混合液加入2.5 µL逆转录样品中。然后用移液器充分混匀样品与预扩增主混合液，冰上孵育5分钟，随后将PCR管放入PCR仪中并启动程序。程序结束后，将所有样品转移至-80 °C保存。

解冻预扩增或未预扩增的样品后，用无菌水将其稀释五倍。为生成标准曲线，对来源于合成RNA寡核苷酸的样品进行10倍倍比连续稀释。然后，在置于冰上的离心管中配制定量PCR反应体系。

然后将定量 PCR 反应混合液中的 18 微升加入到快速光学 96 孔反应板中。接着将 2 微升稀释后的样品加入孔中。用粘性封板膜密封反应板后，在 500 ×g 条件下短暂离心 15 秒。

然后启动实时定量PCR仪程序。使用与相应实时定量PCR仪配套的SDS软件Version 2.4，计算每个样本的原始拷贝数。随后利用Excel软件，根据原始拷贝数计算绝对拷贝数。

通过绘制标准曲线分析miR-122、miR-192和miR-133a的扩增效率，该曲线描述了未预扩增样品的对数浓度与定量循环数之间的关系。miR-122、miR-192和miR-133a的标准曲线显示定量循环数与样品对数浓度之间呈线性关系。接着，通过绘制预扩增样品的标准曲线，分析miR-1、miR-499a和miR-206的扩增效率。

为分析扩增效率，采用线性回归计算斜率。标准曲线A中的斜率显示，在每微升1,000拷贝浓度下，miR-499a和miR-206未产生特异性扩增子。然而，在每微升1,000拷贝浓度下，miR-1出现了非特异性扩增子。

此处使用了非预扩增和预扩增的miR-206样本，每个样本设两个重复，以生成扩增曲线。非预扩增和预扩增miR-206的定量循环值（Cq值）分别为39.9 ± 1.9和27.0 ± 2.2，如图中所示，两个重复之间的数值几乎相同。接下来，对来自食蟹猴的血浆microRNA进行谱型分析，以计算其绝对定量值。

点图显示了 microRNA 表达谱分析所获得的表达水平，表明 miR-122、miR-133a 和 miR-192 无需预扩增即可检测到。而由于表达水平较低，miR-1、miR-206 和 miR-499a 需要进行预扩增。观看本视频后，您应能够充分理解如何使用 RT-qPCR 测定血浆 microRNA 的绝对表达水平。

以及预扩增；在微量 microRNA 的检测中，该步骤有助于提高检测灵敏度。