Name: 定量实时反转录 PCR 技术对猕猴猴血浆 MicroRNA 水平的绝对量化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: 学习使用定量实时反转录PCR技术对猕猴血浆MicroRNA进行绝对定量分析。该方法可检测低表达水平的microRNA，支持跨研究数据比较，为转化医学中的安全性生物标志物研究提供可靠工具。

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本研究未从公共、商业或非营利性资助机构获得任何专项资助。

所有实验均经第一三共株式会社机构动物护理和使用委员会批准。
1. 样品制备
<ol>
	<li>使用含EDTA 2K的采血管，从食蟹猴的股静脉采集血液（至少0.5 mL）。 
	注意：柠檬酸盐和肝素不可使用，因为这些抗凝剂会抑制后续的PCR14,15。</li>
	<li>采集后的样本立即置于冰上，并在采集后2小时内进行血浆分离处理。</li>
	<li>在4 °C条件下，以10,000 × g离心5分钟。</li>
	<li>将上清液转移至2 mL微量离心管中，随后在4 °C条件下以16,000 × g离心5分钟，以去除细胞碎片和残留血小板。 
	注意：血小板污染会显著影响miRNA的定量结果16。</li>
	<li>取200 µL上清液分装至新的2 mL微量离心管中，保存于-80 °C直至使用。 
	注意：每个样本用于RNA提取的体积是固定的，因此分装体积必须准确。</li>
</ol>
2. RNA 提取
<ol>
	<li>将冷冻样品（来自步骤1.5）置于冰上解冻。
	<ol>
		<li>在RNA提取过程中保持样品置于冰上并保持低温。使用前将裂解试剂和氯仿预冷于冰上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向样品（200 µL）中加入5倍体积（1000 µL）含有苯酚和异硫氰酸胍单相溶液的裂解试剂，涡旋振荡1分钟，充分混匀。</li>
	<li>加入5 µL浓度为5 nM的合成物 秀丽隐杆线虫 miRNA（Syn-cel-miR-238-3p）</li>
	<li>加入1体积（200 µL）氯仿，涡旋振荡1分钟，充分混匀。</li>
	<li>置于冰上孵育2至3分钟，然后在4 °C条件下以12,000 x g离心15分钟。</li>
	<li>将水相小心转移至新的微量离心管中。 
	注意：不要转移任何有机相（红色）或中间相（白色）。收集的水相体积应保持一致，以避免操作不一致导致技术误差增加。本方案中通常转移的水相体积为 650 µL。</li>
	<li>加入1.5倍体积（975 µL）的乙醇，用移液器上下吹打充分混匀。</li>
	<li>将样品转移至相应的层析柱和接头中，随后使用真空 manifold 装置真空干燥 3 分钟。若样品体积超过 700 µL，重复此步骤以处理剩余溶液。 
	注意：基于柱的RNA分离方法适用于真空和离心法。</li>
	<li>向柱中加入 200 µL 乙醇，随后真空干燥 1 分钟。</li>
	<li>向柱中加入 800 µL RWT 缓冲液，随后真空干燥 2 分钟。</li>
	<li>向柱中加入 800 µL RPE 缓冲液，随后真空干燥 2 分钟。</li>
	<li>重复步骤 2.11。</li>
	<li>向柱中加入 300 µL 乙醇，随后真空干燥 1 分钟。</li>
	<li>将柱子置于新的微量离心管上，在室温（15 至 25 °C）下以 12,000 × g 离心 1 分钟。</li>
	<li>将柱子转移至新的微量离心管中，加入 50 µL 无核酸酶水。</li>
	<li>室温（15 至 25 °C）静置 3 分钟，然后在室温（15 至 25 °C）下以 8,000 × g 离心 1 分钟。</li>
	<li>将洗脱液重新加回到柱子中。</li>
	<li>重复步骤 2.16，并将洗脱液保存于 -80 °C 直至使用。</li>
</ol>
3. cDNA 合成
<ol>
	<li>解冻冻存的样品（来自步骤 2.18）。</li>
	<li>制备与目标 miRNA 对应的已知浓度的合成 RNA 寡核苷酸。
	<ol>
		<li>使用合成 RNA 寡核苷酸用于在 qPCR 中生成标准曲线。为储存目的，制备浓度为 1 × 108 拷贝/µL 的储备液。</li>
		<li>将储备液稀释 10 倍，得到 1 × 107 拷贝/µL（未预扩增样品）或 1 × 105 拷贝/µL（预扩增样品）的工作液，作为构建标准曲线的最高浓度。通常建议的标准曲线浓度范围为 1 × 107 至 1 × 102 拷贝/µL（未预扩增样品）或 1 × 105 至 1 × 100 拷贝/µL（预扩增样品）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过混合等体积的各目标 miRNA 的 20x RT 引物，制备多重 RT 引物混合液。 
	注：如图 2所示，可通过混合池中每种 miRNA 的 20x RT 引物，制备最多包含 4 种目标 miRNA 的引物混合液。每个反应管中必须包含 Cel-miR-238（外源性对照）作为目标 miRNA 之一。若目标 miRNA 少于 4 种，则用等体积的 1/10 TE 缓冲液替代缺失的 20x RT 引物。</li>
	<li>制备 RT 反应体系：3 µL RT 引物混合液（来自步骤 3.3）、0.15 µL 100 mM 含 dTTP 的 dNTPs、1 µL 逆转录酶（50 U/µL）、1.5 µL 10x RT 缓冲液、0.19 µL RNase 抑制剂（20 U/µL）以及 4.16 µL 无核酸酶水。</li>
	<li>用移液器将 10 µL RT 反应体系与 5 µL RNA 样品（来自步骤 3.1）或寡核苷酸（来自步骤 3.2）混合，在冰上孵育 5 分钟。</li>
	<li>在热循环仪上进行逆转录反应：16 °C 反应 30 分钟，42 °C 反应 30 分钟，最后在 85 °C 灭活逆转录酶 5 分钟。将逆转录后的样品储存于 -80 °C，待后续使用。</li>
</ol>
4. 预扩增（可选）
注意：在后续 qPCR 中 Cq 值高于或等于 35 的 miRNA 需进行预扩增。
<ol>
	<li>解冻冻存样品（来自步骤 3.6）。</li>
	<li>对合成 RNA 寡核苷酸的反转录产物进行 10 倍梯度稀释，浓度范围为 1 × 105 至 1 × 100 拷贝/µL，用于生成标准曲线。</li>
	<li>通过将靶向目标 miRNA 的 20x 检测引物等体积（各 5 µL）混合，配制多重检测引物混合液，最终总体积为 1,000 µL，各检测引物在 TE 缓冲液中被稀释 200 倍。 
	注意：靶向在后续 qPCR 中无需预扩增即可检测到的 miRNA 的引物，以及靶向 cel-miR-238（外源性对照）的引物，不包含在该引物混合液中。</li>
	<li>配制预扩增反应体系：12.5 µL 的 2x 即用型预扩增试剂、3.75 µL 的引物混合液（来自步骤 4.3）和 6.25 µL 的无核酸酶水。</li>
	<li>将 22.5 µL 预扩增反应体系与 2.5 µL 反转录样品（来自步骤 4.1）或寡核苷酸（来自步骤 4.2）通过移液充分混匀，并在冰上孵育 5 分钟。</li>
	<li>在热循环仪中运行反应程序：95 °C 预变性 10 分钟；随后进行 12 个循环，每个循环为 95 °C 变性 15 秒，60 °C 退火延伸 4 分钟。预扩增后的样品储存于 -80 °C，待后续使用。</li>
</ol>
5. 定量实时聚合酶链式反应（qPCR）
<ol>
	<li>解冻冻存的样品（来自步骤 3.6 或步骤 4.6）。</li>
	<li>用无菌水将样品稀释 5 倍。</li>
	<li>制备来源于合成 RNA 寡核苷酸的 RT 产物的 10 倍系列稀释液：1 × 107 至 1 × 102 拷贝/µL（未预扩增样品）或 1 × 105 至 1 × 100 拷贝/µL（预扩增样品），用于生成标准曲线。</li>
	<li>配制 qPCR 反应体系：10 µL 的 2× 即用型扩增试剂，1 µL 的 20× 检测试剂（包含针对目标 miRNA 的正向/反向 PCR 引物和探针），以及 7 µL 无核酸酶水。</li>
	<li>将 18 µL qPCR 反应体系转移至快速光学 96 孔反应板中，每孔加入 2 µL 稀释后的样品（来自步骤 5.2 或步骤 5.3）。 
	注意：qPCR 的样品和标准品均设复孔。</li>
	<li>用粘性封板膜密封反应板，并短暂离心。</li>
	<li>在实时荧光定量热循环仪上运行反应程序：95 °C 预变性 20 秒，随后进行 45 个循环，每个循环包括 95 °C 变性 1 秒和 60 °C 退火/延伸 20 秒。</li>
</ol>
6. 数据分析
<ol>
	<li>使用与相应实时荧光定量PCR仪配套的数据分析软件，计算每个样本的原始拷贝数。 
	注意：本研究中所有反应板的阈值线均手动设置为&#34;1.0&#34;，以便通过与Cq值的比较验证实验的可重复性。设定Cq值大于&#62;40个循环为截断值。</li>
	<li>根据每个样本的重复测定结果，计算其原始拷贝数的平均值。</li>
	<li>通过将每个样本中cel-miR-238的拷贝数除以相应管中所有样本cel-miR-238拷贝数的平均值，计算校正因子。 
	注意：如图2所示，每管最多包含4种目标miRNA，其中包括cel-miR-238（外源性对照）。因此，需根据相应管中的cel-miR-238值为每管单独计算校正因子。</li>
	<li>将每个样本的平均原始拷贝数（来自步骤6.2）除以其对应的校正因子（来自步骤6.3），计算校正后的拷贝数。</li>
	<li>将每个样本的校正后拷贝数（来自步骤6.4）乘以该样本的稀释倍数，计算其绝对拷贝数。 
	注意：本实验方案中稀释倍数为&#34;5&#34;，来源于步骤5.2。</li>
	<li>根据各梯度稀释样本的Cq值对cDNA浓度对数值作图，利用所得曲线的斜率计算PCR扩增效率。 
	注意：扩增效率的计算公式为：E = (10(-1/slope) -1) × 100%。</li>
	<li>利用所有样本中cel-miR-238的Cq值，按公式E = (2 × 扩增效率)ΔCt(Max(Cq)-Min(Cq))计算技术变异。 
	注意：步骤6.5和6.7用于实验流程的质量评估。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

我们的综合评估对动态范围的程度进行了更为严格的统计分析，结果明确表明，在所检测的miRNA中，不同个体样本之间的变异幅度存在极大差异。尽管这些变异可能归因于miRNA在体液中的含量较低，但需要注意的是，这些数据反映的不仅是生物学变异，还包括技术性变异。大部分技术性变异可通过外源性对照（cel-miR-238）的Cq值进行评估，该对照已被用于其他检测平台18。由于目前miRNA分析尚无标准化的内参对照，因此在分析中应纳入技术性变异信息，以评估检测方法的质量19。本报告所述方法的技术性变异估计小于3倍。尽管由于缺乏其他研究中可比较的技术数据，尚无法确定该实验流程的质量标准，但提供此类信息有助于提高结果的可靠性，并确保不同研究之间的可比性。
近期多项研究报道，样本处理、储存条件和处理前的储存时间等各种分析前变量可能影响循环miRNA检测结果的可靠性和可重复性20,21。尽管本研...

越来越多的研究正在探索微小RNA（miRNA）作为癌症诊断和预后的生物标志物，或在非临床和临床研究中用于监测和检测其他疾病1,2,3。定量实时逆转录PCR（RT-qPCR）是用于检测特定目标miRNA的最常用方法之一，因为该技术比微阵列4和基于RNA测序的平台5更敏感。通常，采用ΔCq法将miRNA的表达水平相对于参考样本进行相对定量6。该方法适用于研究目标基因表达水平的生理变化。然而，由于循环miRNA含量极低，其相对定量的应用受到限制。此外，由于不同实验室对RT-qPCR实验方案的定制方式不同，技术变异使得不同研究之间的结果难以比较，导致不同研究得出的结果不一致甚至相互矛盾7。
鉴于上述问题，绝对定量可能更适合于评估体液中微量的miRNA。绝对定量方法采用标准曲线，该曲线由已知浓度的合成RNA寡核苷酸构建而成，这些寡核苷酸的序列与相应的目标miRNA完全相同8。健康与环境科学研究所（HESI）基因组学技术委员会最近开展了一项全面研究，比较了多个测试单位对血浆miRNA进行绝对定量测量的结果。结果显示，采用统一的miRNA绝对定量标准操作流程，可在不同测试单位之间获得可比的结果9。本研究中描述的RT-qPCR检测方法与HESI的标准操作流程几乎完全相同，包括对多个miRNA靶标进行多重分析，以及对低表达水平的miRNA进行预扩增以增强检测灵敏度。
本研究使用了从清醒的食蟹猴（n = 50）股静脉采集的血液制备的EDTA血浆，每次使用固定体积（200 µL）10。以下方案描述了血浆样本制备、miRNA提取以及包括预扩增在内的RT-qPCR操作流程。更重要的是，本方案中还补充了额外的技术信息，以便通过严格验证的流程，对样本中靶向miRNA的含量进行确认。首先，在对生物样本中的miRNA进行定量之前，需分别验证每种miRNA标准曲线的检测范围。其次，通过外部对照（cel-miR-238）的Cq值，全面评估当前方法学的质量。因此，该平台能够提供更具信息量且可靠的数据，便于比较不同研究或实验室之间的结果。
本报告包含了8种miRNA的表达谱，作为此处所述检测方法的代表性结果。这些miRNA已被提出作为与肝脏（miR-122和miR-192）、心脏（miR-1、miR-208a、miR-208b和miR-499a）以及骨骼肌（miR-133a和miR-206）组织损伤相关的潜在安全性生物标志物，在啮齿类动物和人类中均有研究支持3,11,12,13。

<table><tbody><tr><td>BD Microtainer 管（K2EDTA）</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>365974</td><td>用于血液采集</td></tr><tr><td>Eppendorf PCR管，0.2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030124359</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock 微量离心管&amp;nbsp; 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030120086</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock 微量离心管&amp;nbsp; 2.0 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030120094</td><td></td></tr><tr><td>合成寡核苷酸</td><td>北海道系统科学</td><td>-</td><td>单个miRNA（0.2 &amp;mu;摩尔，HPLC 级</td></tr><tr><td>Tris-EDTA缓冲液&amp;nbsp; （pH 8.0）</td><td>Nippon Gene</td><td>314-90021</td><td>TE缓冲液</td></tr><tr><td>Buffer RPE</td><td>QIAGEN</td><td>-</td><td>miRNeasy mini 试剂盒中的成分&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Buffer RWT</td><td>QIAGEN</td><td>-</td><td>miRNeasy mini 试剂盒中的成分&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶水&amp;nbsp;</td><td>QIAGEN</td><td>129114</td><td></td></tr><tr><td>QIAzol 裂解试剂</td><td>QIAGEN</td><td>-</td><td>miRNeasy mini 试剂盒中的成分&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>合成 cel-miR-238-3p miScript miRNA 模拟物&amp;nbsp;</td><td>QIAGEN</td><td>219600</td><td>ID：MSY0000293，5 nmol</td></tr><tr><td>SC接头</td><td>TAIGEN Bioscience Corporation</td><td>S0120</td><td>用于RNA提取</td></tr><tr><td>VacEZor 36 完整系统</td><td>TAIGEN Bioscience Corporation</td><td>M3610</td><td>用于RNA提取</td></tr><tr><td>7900HT 快速实时荧光定量 PCR 系统</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>4351405</td><td>快速96孔板</td></tr><tr><td>GeneAmp PCR System 9700</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>9700</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Fast 光学 96 孔反应板</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>4346907</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp 光学粘性膜</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>4311971</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>4444557</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan microRNA 检测试剂盒（cel-miR-238-3p）</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>4427975</td><td>检测 ID：000248</td></tr><tr><td>TaqMan microRNA 检测试剂盒（hsa-miR-122-5p）</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>4427975</td><td>检测 ID：002245</td></tr><tr><td>TaqMan microRNA 检测试剂盒（hsa-miR-133a-3p）</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>4427975</td><td>检测 ID：002246</td></tr><tr><td>TaqMan microRNA 检测试剂盒（hsa-miR-1-3p）</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>4427975</td><td>检测 ID：002222</td></tr><tr><td>TaqMan microRNA 检测试剂盒（hsa-miR-192-5p）</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>4427975</td><td>检测 ID：000491</td></tr><tr><td>TaqMan microRNA 检测试剂盒（hsa-miR-206）</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>4427975</td><td>检测编号：000510</td></tr><tr><td>TaqMan microRNA 检测试剂盒（hsa-miR-208a-3p）</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>4427975</td><td>检测 ID：000511</td></tr><tr><td>TaqMan microRNA 检测试剂盒（hsa-miR-208b-3p）</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>4427975</td><td>检测 ID：002290</td></tr><tr><td>TaqMan microRNA 检测试剂盒（hsa-miR-499a-5p）</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>4427975</td><td>检测 ID：001352</td></tr><tr><td>TaqMan microRNA 逆转录&lt;br/&gt; 逆转录试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>4366597</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan PreAmp 主混合液（2&amp;times;)</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>4391128</td><td></td></tr><tr><td>氯仿&amp;nbsp;</td><td>和光纯药工业</td><td>035-02616</td><td></td></tr><tr><td>乙醇（99.5）</td><td>和光纯药工业</td><td>057-00456</td><td></td></tr></tbody></table>

使用定量实时逆转录pcr对中国猕猴血浆中微小rna水平进行绝对定量

Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR

RT-qPCR 是评估特定 miRNA 的最常用方法之一。miRNA 水平通常相对于参考样本进行测量。该方法适用于检测靶基因表达水平的生理变化。然而，对于基因表达水平的全面评估，采用更优统计分析的绝对定量更为理想。目前，绝对定量尚未被广泛使用。本报告描述了一种利用 RT-qPCR（可选是否进行预扩增）测定血浆 miRNA 绝对水平的实验方案。
从清醒的食蟹猴（n = 50）股静脉采集的血液中制备出固定体积（200 µL）的EDTA血浆。使用市售系统提取总RNA。采用基于探针的RT-qPCR检测法对血浆miRNA进行定量，该检测法包含miRNA特异性的正向/反向PCR引物和探针。绝对定量的标准曲线使用市售的合成RNA寡核苷酸生成。合成的cel-miR-238被用作归一化和质量评估的外参对照。对于定量循环（Cq）值高于35的miRNA，在进行qPCR步骤前进行预扩增。
在检测的8种miRNA中，miR-122、miR-133a和miR-192无需预扩增即可检测到，而miR-1、miR-206和miR-499a由于表达水平较低，需要进行预扩增。miR-208a和miR-208b即使经过预扩增也无法检测到。通过添加的cel-miR-238的Cq值评估样本处理效率。在该检测方法中，技术变异估计小于3倍，大多数被检测miRNA的定量下限（LLOQ）为102 拷贝/µL。
该方案可更准确地估算血浆miRNA的含量，并允许对不同研究产生的相应数据进行质量评估。鉴于体液中miRNA的数量较少，预扩增有助于增强低表达miRNA的检测。

miRNA 通过 RT-qPCR 检测的工作流程及质量评估t 
图1 显示使用qPCR从血液样本中进行miRNA检测的工作流程10通过加入cel-miR-238作为外部对照，可验证实验的质量。这将揭示RNA提取及后续RT-qPCR过程中的技术变异。本研究中，基于50个样本计算得到的Cq值平均值±标准差为21.0 ± 0.4表1）。如果由于预扩增步骤导致cel-miR-238被稀释，则其Cq值为24.2 ± 0.4（表1）。在本实验方法中，基于Cq值的差异，技术变异程度估计小于3倍。即使增加了额外的预扩增步骤，变异程度仍保持一致。这些数值与本实验室对其他不同动物物种（如小鼠、大鼠和人类）样本所得结果相符合（数据未显示）。
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本报告描述了一种利用定量实时逆转录PCR（可选是否进行预扩增）测定血浆miRNA绝对水平的实验方案。该方案有助于更准确地理解血浆miRNA的数量，并允许对来自不同研究或实验室的相应数据进行定性评估。

使用定量实时逆转录PCR对中国猕猴血浆中微小RNA水平进行绝对定量

RT-qPCR 是评估特定靶标 miRNA 的最常用方法之一。miRNA 水平通常相对于参考样本进行测量。这……

本实验的总体目标是利用定量实时逆转录PCR技术测定血浆微小RNA的绝对表达水平。该方法有助于评估血浆微小RNA的含量，即使其表达水平较低亦可检测。该技术的主要优势在于，所获得的测量数据可与其他不同研究或实验室的结果进行比较。该技术的影响可延伸至其他物种的样本，因为可以使用合成 RNA 或核苷酸生成标准曲线。该方法可为转化研究提供见解，以探索有前景的安全性生物标志物。首先，将从食蟹猴股静脉获取的冷冻血浆样本在冰上解冻。在RNA提取前，将含有氯仿的裂解试剂置于冰上冷却。然后，向200微升样品中加入1,000微升裂解试剂，并涡旋震荡1分钟，以确保充分混匀。然后向样品中加入5 µL的5 nM合成秀丽隐杆线虫microRNA和200 µL氯仿。涡旋振荡样品1分钟以充分混匀。随后将样品置于冰上2至3分钟。接下来，在 4°C 条件下以 12,000 G 离心 15 分钟。然后，小心地将 650 微升水相转移至新的微量离心管中。随后，向水相中加入 975 微升乙醇，并用移液器反复吹打数次以确保充分混匀。将样品转移至相应的层析柱和适配器中，然后使用真空 manifold 装置真空干燥 3 分钟。随后向层析柱中加入 200 µL 乙醇，并再次真空干燥 1 分钟。真空干燥后，向层析柱中加入 800 µL RWT 缓冲液，再次真空干燥 2 分钟。然后向柱中加入 800 微升 RPE 缓冲液，真空干燥 2 分钟。加入 RPE 缓冲液两次，每次均进行真空干燥。接着，向柱中加入 300 微升乙醇。加入乙醇后，真空干燥一分钟。然后将柱子转移至新的微量离心管中，在室温下以12,000 G离心一分钟。离心后，将柱子转移至另一新的微量离心管中，并加入50 µL无核酸酶水。 将层析柱在室温下静置三分钟，然后在室温下以8,000 G离心一分钟。最后，将洗脱液储存于-80摄氏度，直至使用。为制备与目标microRNA相对应的合成RNA寡核苷酸浓度，将储备液稀释10倍，得到最高浓度的工作液，用于绘制标准曲线。接下来，为构建逆转录引物的多重混合体系，将针对目标 microRNA 的20倍浓度引物等体积混合。然后，配制逆转录反应体系。再向5微升RNA样本中加入10微升逆转录反应体系。用移液器反复吹打混合两者。然后将混合物置于冰上孵育5分钟。将样品放入PCR仪后，开始运行程序循环。程序结束后，将反转录样品置于负80摄氏度保存。为配制多重检测引物混合液，取等体积的5微升对应靶向微小RNA（microRNA）的检测引物，加入含有Tris-EDTA缓冲液的离心管中，终体积为1,000微升。接下来，配制预扩增反应体系。反应混合液制备完成后，将22.5 µL预扩增反应混合液加入2.5 µL逆转录样品中。然后用移液器充分混匀样品与预扩增主混合液，冰上孵育5分钟，随后将PCR管放入PCR仪中并启动程序。程序结束后，将所有样品转移至-80 °C保存。解冻预扩增或未预扩增的样品后，用无菌水将其稀释五倍。为生成标准曲线，对来源于合成RNA寡核苷酸的样品进行10倍倍比连续稀释。然后，在置于冰上的离心管中配制定量PCR反应体系。然后将定量 PCR 反应混合液中的 18 微升加入到快速光学 96 孔反应板中。接着将 2 微升稀释后的样品加入孔中。用粘性封板膜密封反应板后，在 500 ×g 条件下短暂离心 15 秒。然后启动实时定量PCR仪程序。使用与相应实时定量PCR仪配套的SDS软件Version 2.4，计算每个样本的原始拷贝数。随后利用Excel软件，根据原始拷贝数计算绝对拷贝数。通过绘制标准曲线分析miR-122、miR-192和miR-133a的扩增效率，该曲线描述了未预扩增样品的对数浓度与定量循环数之间的关系。miR-122、miR-192和miR-133a的标准曲线显示定量循环数与样品对数浓度之间呈线性关系。接着，通过绘制预扩增样品的标准曲线，分析miR-1、miR-499a和miR-206的扩增效率。为分析扩增效率，采用线性回归计算斜率。标准曲线A中的斜率显示，在每微升1,000拷贝浓度下，miR-499a和miR-206未产生特异性扩增子。然而，在每微升1,000拷贝浓度下，miR-1出现了非特异性扩增子。此处使用了非预扩增和预扩增的miR-206样本，每个样本设两个重复，以生成扩增曲线。非预扩增和预扩增miR-206的定量循环值（Cq值）分别为39.9 ± 1.9和27.0 ± 2.2，如图中所示，两个重复之间的数值几乎相同。接下来，对来自食蟹猴的血浆microRNA进行谱型分析，以计算其绝对定量值。点图显示了 microRNA 表达谱分析所获得的表达水平，表明 miR-122、miR-133a 和 miR-192 无需预扩增即可检测到。而由于表达水平较低，miR-1、miR-206 和 miR-499a 需要进行预扩增。观看本视频后，您应能够充分理解如何使用 RT-qPCR 测定血浆 microRNA 的绝对表达水平。以及预扩增；在微量 microRNA 的检测中，该步骤有助于提高检测灵敏度。

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