一种适用于少量造血干细胞的蛋白质印迹实验方案

本蛋白质印迹（Western blotting）方案的主要目标是对少量细胞进行蛋白质印迹分析。该方法有助于回答造血干细胞研究领域中的关键问题，例如特定蛋白质的存在与否或其表达水平，以及信号通路的激活状态。该技术的主要优势在于所需细胞数量少于20,000个，因此在分析稀有原代细胞群体时可减少实验动物的使用数量。

我们最初想到这种方法，是在尝试寻找减少用于造血干细胞分析所需小鼠数量的途径时。本次实验操作将由我实验室的博士后Xiongwei Cai进行演示。使用水平转子离心机，在4°C条件下，以500 × g离心力对含有分选后的造血干细胞和祖细胞的1.5毫升离心管离心5分钟。

离心结束后，保留100微升上清液，其余弃去，注意不要扰动细胞沉淀。如果细胞数量少于5,000个，且分选样品体积小于0.2毫升，则应在离心前先将细胞转移至低吸附性的0.2毫升PCR管中。然而，如果细胞数量少于5,000个，但分选样品体积超过0.2毫升，则在4摄氏度下以500 × g离心5分钟。

离心后，弃去上清液，仅保留200微升。然后将沉淀物与剩余的200微升上清液重新悬浮。接着，将细胞悬液转移至0.2毫升PCR管中，再次进行离心。

然后将沉淀重悬于20至30微升上清液中，并弃去其余上清液。如有需要，可向重悬的细胞中加入含2%胎牛血清或2%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液。随后取2至5微升重悬细胞，使用自动细胞计数仪测定细胞浓度。

接下来，使用20或100微升移液器吸头，将500、1,000和2,000个造血干细胞和祖细胞分别转移至新的1.5毫升离心管中。使用水平转子，在4°C条件下以500 × g离心5分钟。随后按照生产商说明书操作，用DMSO溶解磷酸酶和蛋白酶体抑制剂，配制100倍浓度的储存液。

接下来，将四倍浓度的Laemmli样品缓冲液与等体积的蒸馏水混合，配制为二倍浓度的Laemmli样品缓冲液。然后加入适量的100倍浓度磷酸酶和蛋白酶抑制剂储备液，使最终浓度为二倍浓度的抑制剂和二倍浓度的Laemmli样品缓冲液。调整离心管中残留上清液的体积，使得加入等体积的二倍Laemmli缓冲液以及磷酸酶和蛋白酶抑制剂后，最终浓度达到每微升500个细胞，并含有1倍浓度的Laemmli缓冲液。

然后重新悬浮以形成裂解液。上样前，将样品裂解液置于95°C的加热块中加热5分钟。按照标准电泳方法，取1至40微升裂解液（相当于500至20,000个细胞）在SDS-PAGE中以100伏电压进行电泳。

用甲醇处理聚偏氟乙烯膜数秒后，用蒸馏水短暂洗涤膜。然后根据转膜仪器制造商提供的说明，将蛋白质从凝胶转移至膜上。转膜后，按照标准操作规程，于4°C条件下，用2毫升含0.1%吐温的2%牛血清白蛋白磷酸盐缓冲液封闭过夜。

封闭膜后，在4摄氏度下用稀释的抗体溶液孵育过夜。然后在室温下用含0.1%吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤膜三次，每次五分钟。接着在室温下用两毫升增强型化学发光缓冲液孵育膜一分钟。

使用成像系统检测信号。为了比较β-肌动蛋白信号，从尿液中分离的造血干细胞和祖细胞制备裂解液，并进行蛋白质印迹分析。氨基酸印迹结果清楚显示，将2,000至500个造血祖细胞和干细胞加载到12% SDS-PAGE凝胶的1.5毫米孔中所制备的裂解液，其β-肌动蛋白信号呈下降趋势。

此外，为了比较在凝胶上不同孔径大小的加样孔中获得的β-actin信号，将裂解液分别上样于1.5毫米和3毫米的加样孔中，随后进行Western印迹分析。结果表明，由500个造血祖细胞制备的裂解液在1.5毫米加样孔中所获得的β-actin信号明显强于在3毫米加样孔中的信号。

接下来，为了比较真核起始因子4G、肌动蛋白以及核糖体蛋白S6在细胞因子干细胞因子刺激下的磷酸化信号，对所获得的裂解液进行了氨基酸印迹分析。印迹结果显示，在细胞因子干细胞因子刺激下，造血祖细胞中这三种蛋白的信号强度均更强。与体外对照相比，还可以明显看出，来自不同造血干细胞体积的这三种蛋白的信号强度均呈增加趋势。

一旦掌握，若操作得当，此技术可在 48 小时内完成。进行该实验步骤时，重要的是要准确计数细胞，并使用上样缓冲液正确处理裂解后的细胞。

经过这一技术发展，从事干细胞研究领域的研究人员能够对少量细胞中的信号通路进行探索。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用少量样本进行蛋白质印迹分析。在进行SDS-PAGE时，请务必注意所使用的实验条件。

感谢观看。祝您的实验顺利。