Name: 一种用于小数目造血干细胞的西方印迹协议 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: 学习一种优化的西方印迹协议，用于分析仅500个造血干细胞和祖细胞。该方法采用Laemmli样品缓冲液直接裂解细胞，可在少于20,000个细胞的情况下可靠检测特定蛋白质，减少动物使用并推进造血干细胞领域的信号通路研究。

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本研究工作得到了美国国立卫生研究院基金 R01 CA149976（N.A.S）的资助。

所有操作必须遵循机构的动物使用和护理指南。该方案最初用于分析小鼠造血干细胞和祖细胞（HSCs 和 HPs），但也可根据需要调整用于其他细胞群体的分析。
1. 流式细胞术分离小鼠造血干细胞和造血祖细胞
<ol>
	<li>按照文献中所述方法收获小鼠骨髓细胞6。 
	注：在图1和图2所示数据中，骨髓细胞来源于C57BL/6J小鼠。</li>
	<li>使用小鼠谱系细胞耗竭试剂盒，按照制造商说明书对骨髓细胞进行谱系耗竭处理。</li>
	<li>按照文献所述方法，用针对目标细胞表面标志物的抗体孵育细胞7。在图1和图2所示实验中，使用的抗体包括针对Sca-1、Kit、Flt3以及谱系（Lin）标志物Mac1、Gr1、CD3e、B220和Ter119的抗体。</li>
	<li>将2,000 - 20,000个Lin- Sca1+Kit+ Flt3-细胞（HSCs）或Lin-Sca1-Kit+细胞（HPs）分选至含有0.1 mL含2%胎牛血清（FBS）的磷酸盐缓冲液（PBS）的1.5 mL离心管中。 
	注：在图1和图2所示实验中，使用配备70 µM喷嘴的流式细胞仪进行细胞分选。最大收集体积为1.4 mL。</li>
</ol>
2. 样品制备
注意：此步骤至关重要。请非常小心地处理样品。去除上清液时，务必小心不要扰动细胞沉淀。
<ol>
	<li>将含有分选细胞的1.5 mL离心管置于摆桶转子中，于4 °C、500 × g条件下离心5 min。使用移液器和20 µL吸头，小心吸除上清液，仅保留约100 µL，注意不要扰动细胞沉淀。
	<ol>
		<li>如果样本细胞数少于 5,000 个，且分选后样本总体积小于 0.2 mL，应先将细胞转移至低吸附的 0.2 mL PCR 管中，再进行离心。</li>
		<li>如果样本细胞数少于 5,000 个且体积超过 0.2 mL，需在 4 °C 条件下以 500 × g 离心 5 分钟，沉淀细胞，保留 200 µL 上清液，弃去其余部分。将沉淀的细胞重悬于剩余的 200 µL 上清液中，转移至 0.2 mL PCR 管，再次离心。第二次离心后，弃去上清液，仅保留 20–30 µL，将细胞沉淀重悬。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将细胞重悬于管中剩余的上清液中。如有必要，可加入额外的含2% FBS的PBS（也可使用含2%牛血清白蛋白（BSA）的PBS或仅使用PBS）以获得5 × 10⁶ 个细胞/mL的浓度。4 至 5 × 105 cells/mL 
	注意：使用细胞计数仪获得的细胞计数来估算用于重悬细胞的体积。</li>
	<li>使用 2 - 5 µL 重悬的细胞，通过自动细胞计数仪（按照制造商说明书操作）或血细胞计数板测定准确的细胞浓度9.</li>
	<li>将含有所需数量细胞的重悬细胞液转移至新的1.5 mL离心管中。对于本实验中的 图1，转移2,000、1,000或500个HSCs或HPs。所需细胞数量取决于Western blot检测获得的信号强度，需通过实验经验确定。使用20 µL或100 µL的Eppendorf移液器吸头进行转移。</li>
	<li>在4 °C条件下，以500 × g离心力用水平转子离心机离心5分钟。</li>
	<li>为制备100倍浓缩储存液，按照生产商说明书将蛋白酶体抑制剂和磷酸酶抑制剂溶解于DMSO中。</li>
	<li>通过将厂家提供的4x Laemmli上样缓冲液与等体积的蒸馏水混合，配制2x Laemmli上样缓冲液。加入适量的100x蛋白酶体抑制剂和磷酸酶抑制剂储备液，使2x Laemmli上样缓冲液中抑制剂的终浓度为2x。 
	注意：2× Laemmli 上样缓冲液可预先配制，但在将其（含抑制剂）加入细胞沉淀以裂解细胞之前，应立即加入蛋白酶体抑制剂和磷酸酶抑制剂，具体操作如下一步所述。</li>
	<li>小心地从细胞沉淀的上清液中移除部分上清，向留有细胞沉淀的离心管中剩余的上清液加入等体积的2x Laemmli样品缓冲液，同时加入蛋白酶体抑制剂和磷酸酶抑制剂，使最终体系中细胞浓度为500个细胞/µL，并处于1x Laemmli样品缓冲液中。 
	注意：例如，在步骤 2.5 中，若将 2,000 个细胞溶于总体积为 20 µL 的溶液中转移至离心管，则在离心细胞后（步骤 2.6），应从沉淀中弃去 18 µL 上清液，并向剩余的 2 µL 上清液中加入等体积（2 µL）的 2× Laemmli 样品缓冲液，以获得最终浓度为 500 个细胞/µL 的 1× Laemmli 样品缓冲液体系。</li>
	<li>尽快重悬沉淀以制备裂解液。此时，样品可立即进行SDS-PAGE凝胶电泳，或在液氮中速冻保存。2 并于 -80 °C 保存以备后续使用。</li>
</ol>
3. 电泳
<ol>
	<li>将裂解液置于95 °C的加热块或沸水中加热5分钟。</li>
	<li>按照标准方案，取1 - 40 µL裂解液（含有500至20,000个细胞当量）在SDS-PAGE凝胶中以100 V进行电泳10。 
	注意：上样体积取决于获得理想信号所需的细胞数量，具体取决于目标蛋白的丰度以及抗体的质量。图1中的数据使用了2,000、1,000和500个细胞当量的裂解液。加样孔的宽度应在3 mm至1.5 mm范围内。可使用剪刀将市售的宽齿梳切削出1.5 mm的齿。</li>
</ol>
4. 转移与封闭
注意：按照标准方案进行蛋白质印迹实验11。步骤简述如下：
<ol>
	<li>将聚偏二氟乙烯（PVDF）膜用甲醇预处理10秒，然后用蒸馏水短暂漂洗。</li>
	<li>根据转印装置制造商提供的说明书，将蛋白质从SDS-PAGE凝胶转移至膜上。</li>
	<li>转印完成后，按照标准操作流程，用2 mL含5%牛血清白蛋白（BSA）的PBST（含0.1% Tween的PBS）在4 °C下封闭膜过夜11。</li>
</ol>
5. 抗体标记
<ol>
	<li>将膜置于摇床上，加入抗体，在 4 °C 下孵育过夜，抗体稀释比例参照供应商推荐值。 
	注意：材料表中列出了已针对造血干细胞（HSCs）和造血祖细胞（HPs）验证过的抗体及相应的抗体稀释比例。抗体标记步骤请按照标准操作流程进行8。</li>
</ol>
6. 检测
<ol>
	<li>在室温下用 PBST 洗涤膜 3 次，每次 5 分钟。</li>
	<li>在室温下用 2 mL 增强型化学发光缓冲液孵育膜 1 分钟。根据成像系统的说明书，或使用放射自显影胶片和胶片处理器检测信号。</li>
</ol>

<ol><li>Krutzik, P. O., Clutter, M. R., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinate+analysis+of+murine+immune+cell+surface+markers+and+intracellular+phosphoproteins+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Coordinate analysis of murine immune cell surface markers and intracellular phosphoproteins by flow cytometry.</a> J Immunol. 175 (4), 2357-2365 (2005).</li>
<li>Du, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+profiling+at+the+single-cell+level+identifies+a+distinct+signaling+signature+in+murine+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Signaling profiling at the single-cell level identifies a distinct signaling signature in murine hematopoietic stem cells.</a> Stem Cells. 30 (7), 1447-1454 (2012).</li>
<li>Signer, R. A., Magee, J. A., Salic, A., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+stem+cells+require+a+highly+regulated+protein+synthesis+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic stem cells require a highly regulated protein synthesis rate.</a> Nature. 509 (7498), 49-54 (2014).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+differentiation+checkpoint+limits+hematopoietic+stem+cell+self-renewal+in+response+to+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A differentiation checkpoint limits hematopoietic stem cell self-renewal in response to DNA damage.</a> Cell. 148 (5), 1001-1014 (2012).</li>
<li>Hoshii, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTORC1+is+essential+for+leukemia+propagation+but+not+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">mTORC1 is essential for leukemia propagation but not stem cell self-renewal.</a> J Clin Invest. 122 (6), 2114-2129 (2012).</li>
<li>Signer, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rate+of+protein+synthesis+in+hematopoietic+stem+cells+is+limited+partly+by+4E-BPs%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The rate of protein synthesis in hematopoietic stem cells is limited partly by 4E-BPs.</a> Genes Dev. 30 (15), 1698-1703 (2016).</li>
<li>Cai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Runx1+deficiency+decreases+ribosome+biogenesis+and+confers+stress+resistance+to+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Runx1 deficiency decreases ribosome biogenesis and confers stress resistance to hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Cell Stem Cell. , (2015).</li>
<li>Loven, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+global+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Revisiting global gene expression analysis.</a> Cell. 151 (3), 476-482 (2012).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells">Using a Hemoacytometer to Count Cells.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page">Separating Protein with SDS-PAGE.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot">The Western Blot.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).</li>
<li>Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+eukaryotic+translation+initiation+and+principles+of+its+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (2), 113-127 (2010).</li>
<li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+modern+quantitative+fluorescent+western+blotting+with+troubleshooting+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies.</a> J Vis Exp. (93), e52099(2014).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

Western印迹是一种用于检测组织或细胞中特定蛋白质及信号通路活化的常用技术。通过对一种常用实验流程进行少量调整，我们能够常规性地在15,000个造血干细胞（HSCs）中检测到15种不同的蛋白质（材料表），在某些情况下甚至可在低至500个HSCs中实现检测。本实验方案中最关键的步骤包括：1）准确计数细胞；2）尽量减少样品在不同离心管之间的转移次数；3）直接使用Laemmli上样缓冲液裂解细胞。在使用Laemmli上样缓冲液裂解细胞沉淀时，我们发现，与其将细胞沉淀中的上清液完全移除后再重悬于Laemmli上样缓冲液中，不如在离心管中保留少量上清液，并加入等体积的2x Laemmli上样缓冲液，这样可有效避免细胞损失。使用水平转子离心机对细胞进行离心也可降低细胞丢失的风险。通过修剪梳子齿以缩小加样孔宽度，可提高检测的灵敏度。
通过对实验步骤进行这些简单的调整，我们获得了可重复的结果，其效果相当于已发表论文中使用 10 - 20 倍数量细胞所得到的结果3,<sup class="xr...

造血干细胞（HSCs）是一类具有自我更新能力的细胞，能够分化为所有类型的血细胞。它们在骨髓中数量相对稀少，使得生化分析较为困难。适用于稀有细胞分析的方法，如流式细胞术，对于定量细胞表面标志物和细胞内蛋白的相对含量极为有用。然而，对细胞内蛋白的分析需要采用细胞通透化处理，以允许抗体进入细胞，但并非所有细胞表面表位都能在这些处理过程中保持完整1,2。此外，可用于流式细胞术以区分不同蛋白亚型或切割产物的抗体往往难以获得，因此研究者在某些类型的分析中仍依赖于蛋白质印迹（Western blot）。
细胞裂解物的蛋白质印迹（Western blot）分析是大多数实验室的常规操作。细胞可在保持细胞表面分子表位完整的天然条件下进行纯化，随后制备并分析细胞裂解物。然而，通过蛋白质印迹法分析稀有原代细胞群体中的蛋白质时，通常需要处死大量动物以获得足够的细胞数量。通过对多个步骤进行微小调整，一种传统的蛋白质印迹实验方案能够检测相对少量造血干细胞（HSCs）中的蛋白质（根据目标蛋白的不同，所需细胞数为500至15,000个）。这些调整包括精确计数细胞、小心处理细胞沉淀、尽量减少细胞在不同离心管之间的转移以降低细胞损失，以及使用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的浓缩上样缓冲液裂解确定数量的细胞。许多已发表的研究报告中使用的蛋白质印迹实验均需20,000个或更多的HSCs3,4,5,6,7；而该简易方法可将获得等效数据所需的细胞数量及实验动物数量减少4至40倍。本实验方案设计为以每个细胞为基础进行结果归一化，而非依赖内参对照。这种方法可以检测到蛋白质总体水平的下降，而若以内参对照进行归一化，则此类变化可能被忽略。以单个细胞为基础进行归一化的重要性此前已在基因表达数据分析中有所阐述8，该原则同样适用于蛋白质印迹法中的蛋白定量。此优化后的实验方案适用于所有需要分析少量细胞的研究人员。

<table><tbody><tr><td>十二烷基硫酸钠（SDS）</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166-500</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP150-20</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>30% 丙烯酰胺-双丙烯酰胺溶液</td><td>Bio-Rad</td><td>1610158</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>1.5M Tris-HCl pH8.8</td><td>TEKNOVA</td><td>T1588</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>1.0M Tris-HCl pH6.8</td><td>TEKNOVA</td><td>T1068</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>过硫酸铵</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP179-25</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>mini-protean 3 梳子</td><td>Bio-Rad</td><td>1653360</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra 电泳槽</td><td>Bio-Rad</td><td>1658005EDU</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>转膜系统</td><td>Bio-Rad</td><td>1704155EDU</td><td>转膜</td></tr><tr><td>PowerPac HC 电源</td><td>Bio-Rad</td><td>1645052EDU</td><td>电泳</td></tr><tr><td>成像系统</td><td>Bio-Rad</td><td>1708195</td><td>信号检测</td></tr><tr><td>4x Laemmli 上样缓冲液</td><td>Bio-Rad</td><td>1610747EDU</td><td>样品制备</td></tr><tr><td>10x Tris/甘氨酸/SDS 电泳缓冲液</td><td>Bio-Rad</td><td>1610732EDU</td><td>电泳</td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Bio-Rad</td><td>1610710EDU</td><td>样品制备</td></tr><tr><td>RTA Mini PVDF 转膜试剂盒（适用于40次印迹）</td><td>Bio-Rad</td><td>1704272</td><td>转膜</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Sigma</td><td>11697498001</td><td>样品制备</td></tr><tr><td>磷酸酶抑制剂混合物</td><td>Gold Biotechnology</td><td>GB-450-1</td><td>样品制备</td></tr><tr><td>EIF4G</td><td>Cell signaling</td><td>2469</td><td>WB 抗体，已在1000个细胞中验证&lt;br/&gt; 抗体稀释比例：1:1000&lt;br/&gt; 参考（图）：图2</td></tr><tr><td>p-Rps6</td><td>Cell signaling</td><td>4858</td><td>WB 抗体，已在1000个细胞中验证&lt;br/&gt; 抗体稀释比例：1:1000&lt;br/&gt; 参考（图）：图2</td></tr><tr><td>肌动蛋白（HRP 标记）</td><td>abcam</td><td>ab49900</td><td>WB 抗体，已在500个细胞中验证&lt;br/&gt; 抗体稀释比例：1:5000&lt;br/&gt; 参考（图）：图1、图2</td></tr><tr><td>LC-3</td><td>Abcam</td><td>ab48394</td><td>WB 抗体，已在15000个细胞中验证&lt;br/&gt; 抗体稀释比例：1:1000&lt;br/&gt; 参考（图）：参考文献5（图5）</td></tr><tr><td>S6</td><td>Cell Signaling</td><td>2317</td><td>WB 抗体，已在15000个细胞中验证&lt;br/&gt; 抗体稀释比例：1:1000&lt;br/&gt; 参考（图）：参考文献5（图4）</td></tr><tr><td>4EBP1</td><td>Cell Signaling</td><td>9644</td><td>WB 抗体，已在15000个细胞中验证&lt;br/&gt; 抗体稀释比例：1:1000&lt;br/&gt; 参考（图）：参考文献5（图4）</td></tr><tr><td>p-4EBP1</td><td>Cell Signaling</td><td>2855</td><td>WB 抗体，已在15000个细胞中验证&lt;br/&gt; 抗体稀释比例：1:1000&lt;br/&gt; 参考（图）：参考文献5（图4）</td></tr><tr><td>TSC2</td><td>Cell Signaling</td><td>4308</td><td>WB 抗体，已在15000个细胞中验证&lt;br/&gt; 抗体稀释比例：1:1000&lt;br/&gt; 参考（图）：参考文献5（图4）</td></tr><tr><td>HSP90</td><td>Cell Signaling</td><td>4877</td><td>WB 抗体，已在15000个细胞中验证&lt;br/&gt; 抗体稀释比例：1:1000&lt;br/&gt; 参考（图）：参考文献5（图5）</td></tr><tr><td>PTEN</td><td>Cell Signaling</td><td>9188</td><td>WB 抗体，已在15000个细胞中验证&lt;br/&gt; 抗体稀释比例：1:1000&lt;br/&gt; 参考（图）：参考文献5（图S1）</td></tr><tr><td>mTOR</td><td>Cell Signaling</td><td>2983</td><td>WB 抗体，已在15000个细胞中验证&lt;br/&gt; 抗体稀释比例：1:1000&lt;br/&gt; 参考（图）：参考文献5（图S1）</td></tr><tr><td>p-mTOR</td><td>Cell Signaling</td><td>5536</td><td>WB 抗体，已在15000个细胞中验证&lt;br/&gt; 抗体稀释比例：1:1000&lt;br/&gt; 参考（图）：参考文献5（图S1）</td></tr><tr><td>PP2AB</td><td>Cell Signaling</td><td>4953</td><td>WB 抗体，已在15000个细胞中验证&lt;br/&gt; 抗体稀释比例：1:1000&lt;br/&gt; 参考（图）：参考文献5（图S1）</td></tr><tr><td>p-AMPKa</td><td>Cell Signaling</td><td>2535</td><td>WB 抗体，已在15000个细胞中验证&lt;br/&gt; 抗体稀释比例：1:1000&lt;br/&gt; 参考（图）：参考文献5（图S1）</td></tr><tr><td>肌动蛋白</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-47778</td><td>WB 抗体，已在15000个细胞中验证&lt;br/&gt; 抗体稀释比例：1:3000&lt;br/&gt; 参考（图）：参考文献5（图4）</td></tr><tr><td>谱系耗竭试剂盒（小鼠）</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-858</td><td>造血干细胞和祖细胞纯化</td></tr><tr><td>LS 柱</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-305</td><td>造血干细胞和祖细胞纯化</td></tr><tr><td>SCF</td><td>PeproTech</td><td>250-03</td><td>磷酸化刺激</td></tr><tr><td>APC-Cy7 c-kit 抗体</td><td>ThermoFisher</td><td>A15423</td><td>细胞分选</td></tr><tr><td>抗-B220</td><td>ThermoFisher</td><td>48-0452-82</td><td>细胞分选</td></tr><tr><td>抗-CD3e</td><td>ThermoFisher</td><td>48-0031-82</td><td>细胞分选</td></tr><tr><td>抗-Mac1</td><td>ThermoFisher</td><td>48-0112-82</td><td>细胞分选</td></tr><tr><td>抗-Gr1</td><td>ThermoFisher</td><td>48-5931-82</td><td>细胞分选</td></tr><tr><td>抗-Ter119</td><td>ThermoFisher</td><td>48-5921-82</td><td>细胞分选</td></tr><tr><td>带1.0 mm一体式垫片的间隔板</td><td>Bio-Rad</td><td>1653311</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Research Products International</td><td>A30075</td><td>膜封闭</td></tr><tr><td>血清</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>A12450</td><td>培养基添加剂</td></tr><tr><td>细胞计数仪</td><td>Invitrogen</td><td>AMQAF1000</td><td>细胞计数</td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>ThermoFisher</td><td>&amp;nbsp;S17040</td><td>细胞计数</td></tr><tr><td>胶片</td><td>Denville Scientific</td><td>E3012</td><td>信号检测</td></tr><tr><td>医用胶片处理器</td><td>Konica</td><td>SRC-101A</td><td>信号检测</td></tr><tr><td>Supersignal West Femto 最高灵敏度底物</td><td>Therom Scientific</td><td>34096</td><td>信号检测</td></tr><tr><td>Allegra X-15R 离心机（转子 SX4750A）</td><td>Beckman Coulter</td><td>X-15R</td><td>样品制备</td></tr><tr><td>BLUEstain 蛋白质分子量标准</td><td>Gold Biotechnology</td><td>P007-500</td><td>电泳</td></tr><tr><td>细胞分选仪</td><td>BD</td><td>FACSAria II</td><td>样品制备</td></tr><tr><td>Incublock</td><td>Denville Scientific</td><td>I0510</td><td>电泳</td></tr></tbody></table>

一种适用于少量造血干细胞的蛋白质印迹实验方案

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

造血干细胞（HSCs）是一类稀有细胞，小鼠骨髓中仅含有约25,000个表型上的长期重建造血干细胞。本研究优化了一种适用于少量HSCs（500–15,000个细胞）分析的蛋白质印迹（Western blotting）实验方案。通过分离纯化表型HSCs，精确计数后直接在Laemmli样品缓冲液中裂解。将含有相同数量细胞的裂解液进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，随后按照标准的Western blotting流程进行转膜与检测。采用该方案，通常可对2,000–5,000个HSCs进行分析，在某些情况下甚至可低至500个细胞获得有效数据，远少于大多数文献报道所需的20,000至40,000个细胞。本方案可广泛适用于其他造血细胞，使得利用常规实验室技术对少量细胞进行系统分析成为可能。

来自500至2,000个纯化的HSC和HP的代表性结果如图所示 图1 和 图2β-actin 信号在 图1 可从一只小鼠骨髓中纯化的低至500个造血干细胞（HSCs）和造血祖细胞（HPs）中检测到信号。需要注意的是，将裂解液上样至1.5 mm孔径的加样孔时，500个HPs产生的信号明显强于上样至3.0 mm孔径加样孔的结果。 图2 是 EIF4G 和 Rps6 磷酸化（p-Rps6）的蛋白质印迹，两者均参与蛋白质翻译的调控12，在造血干细胞（HSCs）中，以及在有或无干细胞因子（SCF）刺激的造血祖细胞（HPs）中 体外.
<img alt="对不同细...

一种标准的蛋白质印迹（Western blotting）实验方案经过优化，可用于分析低至500个造血干细胞或祖细胞。优化过程包括对细胞样品的精细操作、尽量减少管间转移步骤，以及直接在Laemmli样品缓冲液中裂解细胞。

造血干细胞（HSCs）是一类稀有细胞，小鼠骨髓中仅含有约25,000个具有表型特征的长期重建造血干细胞。Western ...

本蛋白质印迹（Western blotting）方案的主要目标是对少量细胞进行蛋白质印迹分析。该方法有助于回答造血干细胞研究领域中的关键问题，例如特定蛋白质的存在与否或其表达水平，以及信号通路的激活状态。该技术的主要优势在于所需细胞数量少于20,000个，因此在分析稀有原代细胞群体时可减少实验动物的使用数量。我们最初想到这种方法，是在尝试寻找减少用于造血干细胞分析所需小鼠数量的途径时。本次实验操作将由我实验室的博士后Xiongwei Cai进行演示。使用水平转子离心机，在4°C条件下，以500 × g离心力对含有分选后的造血干细胞和祖细胞的1.5毫升离心管离心5分钟。离心结束后，保留100微升上清液，其余弃去，注意不要扰动细胞沉淀。如果细胞数量少于5,000个，且分选样品体积小于0.2毫升，则应在离心前先将细胞转移至低吸附性的0.2毫升PCR管中。然而，如果细胞数量少于5,000个，但分选样品体积超过0.2毫升，则在4摄氏度下以500 × g离心5分钟。离心后，弃去上清液，仅保留200微升。然后将沉淀物与剩余的200微升上清液重新悬浮。接着，将细胞悬液转移至0.2毫升PCR管中，再次进行离心。然后将沉淀重悬于20至30微升上清液中，并弃去其余上清液。如有需要，可向重悬的细胞中加入含2%胎牛血清或2%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液。随后取2至5微升重悬细胞，使用自动细胞计数仪测定细胞浓度。接下来，使用20或100微升移液器吸头，将500、1,000和2,000个造血干细胞和祖细胞分别转移至新的1.5毫升离心管中。使用水平转子，在4°C条件下以500 × g离心5分钟。随后按照生产商说明书操作，用DMSO溶解磷酸酶和蛋白酶体抑制剂，配制100倍浓度的储存液。接下来，将四倍浓度的Laemmli样品缓冲液与等体积的蒸馏水混合，配制为二倍浓度的Laemmli样品缓冲液。然后加入适量的100倍浓度磷酸酶和蛋白酶抑制剂储备液，使最终浓度为二倍浓度的抑制剂和二倍浓度的Laemmli样品缓冲液。调整离心管中残留上清液的体积，使得加入等体积的二倍Laemmli缓冲液以及磷酸酶和蛋白酶抑制剂后，最终浓度达到每微升500个细胞，并含有1倍浓度的Laemmli缓冲液。然后重新悬浮以形成裂解液。上样前，将样品裂解液置于95°C的加热块中加热5分钟。按照标准电泳方法，取1至40微升裂解液（相当于500至20,000个细胞）在SDS-PAGE中以100伏电压进行电泳。用甲醇处理聚偏氟乙烯膜数秒后，用蒸馏水短暂洗涤膜。然后根据转膜仪器制造商提供的说明，将蛋白质从凝胶转移至膜上。转膜后，按照标准操作规程，于4°C条件下，用2毫升含0.1%吐温的2%牛血清白蛋白磷酸盐缓冲液封闭过夜。封闭膜后，在4摄氏度下用稀释的抗体溶液孵育过夜。然后在室温下用含0.1%吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤膜三次，每次五分钟。接着在室温下用两毫升增强型化学发光缓冲液孵育膜一分钟。使用成像系统检测信号。为了比较β-肌动蛋白信号，从尿液中分离的造血干细胞和祖细胞制备裂解液，并进行蛋白质印迹分析。氨基酸印迹结果清楚显示，将2,000至500个造血祖细胞和干细胞加载到12% SDS-PAGE凝胶的1.5毫米孔中所制备的裂解液，其β-肌动蛋白信号呈下降趋势。此外，为了比较在凝胶上不同孔径大小的加样孔中获得的β-actin信号，将裂解液分别上样于1.5毫米和3毫米的加样孔中，随后进行Western印迹分析。结果表明，由500个造血祖细胞制备的裂解液在1.5毫米加样孔中所获得的β-actin信号明显强于在3毫米加样孔中的信号。接下来，为了比较真核起始因子4G、肌动蛋白以及核糖体蛋白S6在细胞因子干细胞因子刺激下的磷酸化信号，对所获得的裂解液进行了氨基酸印迹分析。印迹结果显示，在细胞因子干细胞因子刺激下，造血祖细胞中这三种蛋白的信号强度均更强。与体外对照相比，还可以明显看出，来自不同造血干细胞体积的这三种蛋白的信号强度均呈增加趋势。一旦掌握，若操作得当，此技术可在 48 小时内完成。进行该实验步骤时，重要的是要准确计数细胞，并使用上样缓冲液正确处理裂解后的细胞。经过这一技术发展，从事干细胞研究领域的研究人员能够对少量细胞中的信号通路进行探索。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用少量样本进行蛋白质印迹分析。在进行SDS-PAGE时，请务必注意所使用的实验条件。感谢观看。祝您的实验顺利。

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一种用于小数目造血干细胞的西方印迹协议

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一种适用于少量造血干细胞的蛋白质印迹实验方案

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