用于化学诱导的 DNA 化和表观遗传重塑的基因工程 Split-TET2 酶

这一系列实验的总体目标是将一种名为 CiDER 的工程化分裂 TET2 酶引入哺乳动物细胞中，用于诱导型 DNA 修饰，例如羟甲基化以及表观遗传重塑。这种方法可以帮助回答表观遗传学领域的关键问题，例如该技术的主要优点是工程化分裂 TET2 酶允许对 5-甲基胞嘧啶氧化进行时间控制，并随后使用化学添加剂重塑哺乳动物细胞中的表观遗传状态。要开始此程序，请在补充有 10% 热灭活 FBS 以及每毫升 100 单位青霉素和链霉素的 DMEM 中培养贴壁细胞系。

在 37 摄氏度和 5% CO 2 下孵育细胞。如文本方案中所述，用 CiDER 质粒转染细胞。然后将细胞在 37 摄氏度下孵育过夜。

第二天，用新鲜的 DMEM 完全版替换含转染试剂的培养基。为了化学诱导细胞，将 20 微升稀释的雷帕霉素添加到维持在 2 毫升培养基中的转染细胞中，以达到 200 纳摩尔的最终浓度。要进行流式细胞术，请将转染和雷帕霉素诱导的细胞重悬于 FACS 缓冲液中。

对于对照组，使用不含雷帕霉素处理的表达 CiDER 的细胞。按照文本协议中的描述修复和透化细胞。然后向细胞中加入两个正常盐酸，使 DNA 变性 10 分钟。

按照文本方案中的说明中和和封闭细胞后，将稀释的抗 5hmC 抗体添加到细胞中。将细胞在室温下孵育 1 小时或在 4 摄氏度下孵育过夜。孵育后，用 FACS 缓冲液洗涤细胞 3 次。

彻底去除 FACS 缓冲液。加入稀释的荧光团偶联二抗进行 FACS 分析，并在室温下孵育 1 小时。然后用 FACS 缓冲液洗涤细胞 3 次。

洗涤后，样品即可用于 FACS 分析。使用市售 DNA 提取试剂盒从转染和雷帕霉素诱导的细胞中分离基因组 DNA。对于对照组，使用未经雷帕霉素处理的 CiDER 转染细胞。

将真空烤箱加热至 80 摄氏度。将硝酸纤维素膜预浸泡在双蒸水中，然后在 6X SSC 缓冲液中浸泡 10 分钟。接下来，将 60 μL 等量的 DNA 上样到 96 孔 PCR 板中。

向其余孔中加入 30 微升 TE 缓冲液。通过将第 1 行中的 30 μL 溶液转移到第 2 行的相同列位置，在 96 孔板上垂直进行两倍连续稀释。再次混合并将 30 微升溶液转移到下一行的孔中，直到达到边界。

然后从孔中取出最后 30 微升。接下来，向每个孔中加入 20 微升 1 摩尔氢氧化钠和 10 毫摩尔 EDTA。密封板并在 95 摄氏度下加热混合物 10 分钟，以使 DNA 双链体完全变性。

立即在冰上冷却样品。向每个孔中加入 50 μL 冰冷的两磨牙乙酸铵，并在冰上孵育 10 分钟。同时，将斑点印迹仪与预先浸泡的膜组装在一起。

使用全真空去除残留缓冲液。通过向斑点印迹仪的每个孔中加入 200 微升 TE 缓冲液来洗涤膜。打开真空以去除 TE 缓冲液。

接下来，将变性的 DNA 加载到斑点印迹仪的每个孔中。打开真空以去除溶液。加入 200 μL 2X SSC 洗涤膜，并使用真空完全去除残留溶液。

拆卸斑点印迹仪。然后取出膜，用 20 毫升 2X SSC 冲洗整个膜。将膜风干 20 分钟。

要进一步干燥膜，请在真空下以 80 度烘烤 2 小时。将封闭溶液添加到膜中，并在室温下孵育 1 小时。丢弃封闭溶液后，将稀释的 5-hmC 或 5-mC 抗体添加到膜上，并在 4 摄氏度下孵育过夜。

用 TBST 清洗膜 3 次，持续 10 分钟，以去除残留抗体。彻底去除 TBST 后，向膜上添加 HRP 偶联的二抗。在室温下孵育膜 1 小时。

用 TBST 清洗膜 3 次，持续 10 分钟。最后，将 ECL western 印迹底物添加到膜上，以使用化学发光检测器观察 5-hmC 信号。此处显示了通过流式细胞术产生 CiDER 介导的 5-hmC 的代表性定量结果。

只有在雷帕霉素处理的条件下表达 CiDER 的细胞才显示 5-hmC 水平显着增加。此处显示了通过斑点印迹测定在整个细胞群中 5-hmC 水平整体变化的代表性结果。通过对输入 DNA 总量的乙烯蓝染色来观察上样对照。

结果表明，雷帕霉素处理在表达 CiDER 的 HEK293T 细胞中诱导 5-hmC 的稳健产生，背景活性可以忽略不计。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在一周内完成。该技术发展后，为表观遗传学领域的研究人员在不改变遗传密码的情况下探索细胞功能以及探索各种生物系统中的表观遗传型和表型关系铺平了道路。