Name: 人类胰岛神经网络的高分辨率3D 成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: 学习被动光学透明化方法对人类胰腺组织进行高分辨率三维成像，结合免疫荧光染色技术揭示胰岛自主神经与感觉神经网络结构。该方法为糖尿病神经生物学研究提供重要技术支持。

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作者感谢 Ann Fu 博士和 Joseph Canzano 提供的技术支持，感谢 Jennifer Treweek 博士提供的宝贵建议，以及 Kristin Overton 博士和 Karl Deisseroth 博士在斯坦福大学 CLARITY 研讨会期间对 MCT 进行的培训。JDRF nPOD 及器官获取组织提供了组织样本。本研究由 JDRF（47-2014-1）、Helmsley 慈善信托基金（HCT 2015-PG-T1D052）和 NIDDK 1OT2 TR001773 项目资助。

所有实验均按照佛罗里达大学机构审查委员会和联邦指南的规定进行。
注意：多聚甲醛和丙烯酰胺为有毒刺激物。应在通风橱中使用适当的个人防护装备（实验服、手套、护目用具）操作试剂。
1. 甲醛固定组织的脱蜡处理（若使用新鲜组织，请跳至步骤2）
<ol>
	<li>使用新的剃须刀片或解剖刀，垂直于组织表面切开石蜡。在组织边缘处切割石蜡，以完成松解。用镊子或刮匙轻轻松动并取出待进行光学透明处理的组织。用刮匙轻轻刮去组织上多余的石蜡。图1A).</li>
	<li>用二甲苯填充玻璃容器（3 × 3 × 3 cm 组织样本约需 30 mL）&#160;3 mm 的组织切片），并在室温（RT）下将组织在此溶液中孵育 24 小时。</li>
	<li>用与1.2.1步骤相同体积的新鲜二甲苯填充另一个玻璃容器，将组织转移至该溶液中，在室温下孵育24小时。</li>
	<li>将100%乙醇加入与1.2.1步骤相同体积的锥形管中。将组织转移至该溶液，于室温孵育24小时。</li>
	<li>将95%乙醇加入与1.2.1步骤相同体积的锥形管中。转移组织至该溶液，于室温孵育24 h。</li>
	<li>将70%乙醇加入与1.2.1步骤相同体积的锥形管中。将组织转移至该溶液，室温下孵育24小时。</li>
	<li>用 0.01 M 磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗组织，然后将其置于锥形管中的 0.01 M PBS 中，在室温下平衡 24 小时。确保组织中无石蜡残留&#160;(图1B，右侧面板）。</li>
</ol>
2. 准备4%多聚甲醛（PFA）固定液
<ol>
	<li>用移液器将10 mL 16% PFA加入50 mL锥形管中，加入4 mL 0.1 M PBS，再加入26 mL去离子蒸馏水（ddH2O）。盖紧管盖并短暂混匀。</li>
	<li>可预先配制较大量4% PFA溶液，并分装冷冻保存。分装后的溶液在室温（RT）下可稳定1天，4 °C下可保存1周，-20 °C下可保存1个月。</li>
</ol>
3. 胰腺固定
<ol>
	<li>将胰腺样本（≤ 1 × 1 × 2 cm）置于新配制的4%多聚甲醛（PFA）中，4 °C固定48小时。若样本大于1 × 1 × 2 cm，使用解剖刀或剃须刀片将其切割为厚度不超过1 cm的小块。用0.01 M PBS洗涤组织样本，换液三次，每次至少15分钟，随后将样本保存于15 mL离心管中，加入含0.01% PFA/0.01 M PBS或0.5%叠氮化钠/0.01 M PBS溶液，置于4 °C备用。</li>
	<li>固定完成后，将组织切成1–2 mm厚的切片以进行后续处理。可使用振动切片机以确保切片均匀。 
	注意：最终切片数量取决于起始样本的大小。</li>
</ol>
4. 将组织包埋于水凝胶中
<ol>
	<li>按如下步骤配制 200 mL 的 4% 丙烯酰胺/1% 多聚甲醛（A4P1）水凝胶单体溶液：
	<ol>
		<li>将一个烧瓶置于磁力搅拌器上方装有冰的容器中。确保烧瓶平稳放置，并加入一个磁力搅拌子。</li>
		<li>按以下顺序依次加入：147.8 mL 冷却的（4–8 °C）ddH₂O、20 mL 0.1 M PBS、20 mL 冷却的（4–8 °C）40% 丙烯酰胺溶液、12.2 mL 16% PFA 溶液，以及 250 mg VA-044 引发剂。使用磁力搅拌子持续搅拌整个水凝胶溶液至少 10 分钟，随后将溶液置于冰上，用于下一步操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将一个 15 mL 圆底离心管置于盛有冰的容器中，放置在装有水凝胶溶液的烧瓶旁。用移液器将 14 mL 单体溶液转移至该离心管中，并加入一块厚度为 1–2 mm 的固定组织样本。随后盖紧管盖。</li>
	<li>将样本在 4 °C 条件下避光孵育 3 天。将剩余的单体溶液分装后于 -20 °C 保存，以备后续使用。</li>
</ol>
5. 脱气单体溶液并聚合水凝胶
<ol>
	<li>使用气态 N28 从水凝胶单体溶液中去除氧气。
	<ol>
		<li>准备一桶冰，将装有水凝胶单体溶液的样品置于冰上。</li>
		<li>每个样品准备 2–3 根 18 号皮下注射针头、石蜡膜和计时器。将管路连接至氮气罐&#160;，使氮气能够流通。保持样品在冰上，小心地从一侧刺穿装有样品的锥形管管盖，并将一根皮下注射针头插入至液面以下的单体溶液中。</li>
		<li>用另一根皮下注射针头刺穿管盖的对侧，但不要使其浸入液体中。 
		注意：第二根针头用于排气。</li>
		<li>将来自氮气罐的管路连接至浸没在水凝胶下方的皮下注射针头，缓慢打开氮气，使气体在液体中持续稳定地冒泡。</li>
		<li>让氮气在液体中冒泡 10 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>去除氧气后，迅速拔出两根针头，并用石蜡膜封住管盖，以防止管内与外界环境进一步发生气体交换。将脱气后的样品置于 37 °C 培养箱中孵育 3 小时，使水凝胶聚合。</li>
</ol>
6. 组织透明化
<ol>
	<li>配制500 mL透明化溶液（含4% SDS，pH 8.5）。在约300 mL去离子水（ddH2O）中，边搅拌边加入50 mL 0.1 M PBS和20 g SDS粉末。用氢氧化钠和盐酸调节溶液至pH 8.5。再加入去离子水（ddH2O），定容至500 mL。</li>
	<li>聚合完成后，倒掉多余的水凝胶并将其弃入化学废液容器中。用纸巾轻轻擦去样品表面的水凝胶，并将纸巾弃入化学废液容器中。</li>
	<li>用0.01 M PBS洗涤样品，每次15分钟，共换液3–5次（每次洗涤液均弃入化学废液容器）。将样品转移至含有40 mL透明化缓冲液的50 mL锥形管中。</li>
	<li>将样品在透明化缓冲液中于37 °C孵育，每隔一天更换一次新鲜的透明化缓冲液。
	<ol>
		<li>根据样品大小，将样品在透明化缓冲液中孵育2–8周（例如，3 mm × 3 mm × 3 mm的样品通常需要约8周），以确保充分透明化。</li>
		<li>监测组织透明化过程，当透明化完成时停止操作。&#160;通过将样品置于光源前观察其透明度，以确认透明化效果（通常外分泌区域仍会残留一些棕黄色）。 
		注意：过度透明化的样品边缘会呈现毛糙状，用镊子夹起时质地非常柔软。样品透明化不均匀是常见现象。此外，组织在封片介质中（插入，图1C）才会完全透明。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 多重免疫荧光
<ol>
	<li>在室温下，将样品置于40 mL 0.01 M PBS中，以60 rpm在摇床上洗涤一天，期间多次更换新鲜缓冲液（共更换4–5次，每次40 mL，每隔1小时更换一次，直至最后一次洗涤）。最后一次洗涤在室温下持续过夜。</li>
	<li>配制PACT染色缓冲液：向500 mL 0.01 M PBS中加入50 mg叠氮化钠和0.5 mL TritonX-100，充分混匀。</li>
	<li>用一抗孵育样品。
	<ol>
		<li>在2 mL平底管中，向基础PACT染色缓冲液中加入2%正常血清（与二抗同源物种），每样品/管建议总体积不少于1 mL。</li>
		<li>将一抗加入含2%血清的PACT染色缓冲液中。PACT染色所需一抗用量约为标准免疫组织化学用量的5倍（例如，若某抗体在标准免疫组化中稀释比例为1:500，则在PACT染色中使用1:100）。</li>
		<li>用刮勺将样品从洗涤缓冲液中取出，用纸巾轻轻吸去多余液体，然后放入含一抗溶液的管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在室温下以60 rpm于摇床上孵育2–4天。随后在室温下以60 rpm于0.01 M PBS中彻底洗涤样品，更换新鲜缓冲液4–5次，最后一次洗涤过夜，操作同步骤7.1。</li>
	<li>用二抗孵育样品。
	<ol>
		<li>在2 mL平底管中，向基础PACT染色缓冲液中加入2%正常血清（与二抗同源物种），每样品/管建议总体积为1 mL。</li>
		<li>以1:200的浓度加入二抗（即每1 mL缓冲液中加入5 µL）。 
		注意：推荐使用小分子形式的抗体；若同时使用多种一抗，建议选用高度交叉吸附的二抗。</li>
		<li>用刮勺将样品从洗涤缓冲液中取出，用纸巾轻轻吸去多余液体，然后放入含二抗溶液的管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在室温下以60 rpm于摇床上孵育2天，并避免光照。</li>
	<li>参照步骤7.1的方法，在室温下以60 rpm于0.01 M PBS中彻底洗涤样品，更换新鲜缓冲液4–5次，最后一次洗涤过夜，洗涤过程中需避光。</li>
</ol>
8. 成像样品的封片
<ol>
	<li>配制折射率匹配溶液（RIMS）缓冲液。
	<ol>
		<li>称取11 g非离子型密度梯度介质（例如Histodenz），小心转移至50 mL锥形管中。</li>
		<li>使用刮勺加入约5 mL 0.02 M磷酸盐缓冲液（PB）8，以释放非离子型密度梯度介质粉末中的空气。 
		注意：溶液将非常黏稠，请充分混匀。</li>
		<li>用更多PB定容至10 mL，用刮勺搅拌，并将刮勺上多余的液体刮入管中。</li>
		<li>将RIMS在37 °C孵育至完全溶解，必要时颠倒并轻轻混匀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将样品转移至RIMS中。操作时，用移液器将1 mL RIMS加入2 mL平底管中。用刮勺将样品从洗涤缓冲液中取出，并在纸巾上轻轻吸去多余缓冲液，然后放入含有RIMS溶液的管中。
	<ol>
		<li>轻轻敲击管壁，使样品完全浸入RIMS中。将含样品的RIMS置于室温避光处静置2–4天，随后进行成像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>成像时，取少量RIMS加入8孔盖玻片底培养皿中。仅需加入足以覆盖底部的量，过多会导致样品漂浮，从而在倒置显微镜下成像困难。将样品加入孔中，盖上盖片后即可进行成像。</li>
</ol>
9. 成像
<ol>
	<li>共聚焦显微镜与成像软件
	<ol>
		<li>根据用于染色PACT样本的荧光染料的激发和发射光谱，选择合适的激光器。调整采集软件的设置，以消除各通道之间的任何重叠。如有必要，使用独立的通道（当两种荧光染料具有相似的激发光谱时）。</li>
		<li>设置图像采集
		<ol>
			<li>选择最大采集速度、16位深度、4次或更多次平均扫描，以及1024 × 1024或更高的分辨率。</li>
			<li>放大目标成像对象。 
			注意：这将缩短采集时间，减少光漂白，并减小文件大小及后续编辑负担。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>设置z轴层扫。
		<ol>
			<li>为所使用的物镜选择最佳的切片步长。如果后续需要进行去卷积处理，请使用小于最佳值的z步长，例如1 µm。</li>
			<li>使用z轴层扫校正功能。
			<ol>
				<li>从组织表面最近处开始，随着物镜在z平面内聚焦，逐步增加增益并添加校正。校正过程中不得更改激光设置！</li>
				<li>以单次平均扫描、&#160;512 × 512分辨率和最大采集速度获取测试层扫图像。在三维视图中检查图像，确保每种颜色在整个层扫范围内亮度均匀，然后再采集最终的高分辨率z轴层扫图像。</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>光片成像
	<ol>
		<li>确保样本已在RIMS中平衡至少24小时以备成像。理想情况下，将样本转移至成像腔室中的新鲜RIMS中，并在腔室内继续平衡至少一天。</li>
		<li>安装样本以进行成像
		<ol>
			<li>选择最小的（黑色）毛细管来固定样本</li>
			<li>使用橡皮泥或培养皿固定样本，同时将瞬干胶涂抹在毛细管末端。将组织粘附到毛细管上，尽可能减少与组织表面的接触面积。</li>
			<li>将样本插入成像系统。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用5X&#160;或25X&#160;物镜，结合适用于光学透明样本的枢轴扫描模式进行成像。如果出现阴影或模糊现象，可旋转样本后重试，或让样本在RIMS中继续平衡。 
		注意：根据设置不同，通常可在不到五分钟内完成1 mm的层扫成像。</li>
		<li>使用图像分析软件查看和编辑图像层扫数据。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

新型光学透明化方法的出现，使得在动物模型中对中枢和周围神经系统进行前所未有的大规模研究成为可能。由于组织密度高以及难以获取高质量的生物样本，人类胰腺的整体神经支配模式在很大程度上仍未被探索。本方案提供了一种优化的人类胰腺组织透明化方案，适用于固定或石蜡包埋的存档样本。
透明时间取决于样本大小、固定剂类型、固定时长、储存时长，可能需要1至8周，因此以下因素至关重要。如果条件允许，最好在4% PFA固定后尽快进行组织透明处理，因为长期储存会延长透明时间。为缩短透明时间，在水凝胶单体中的PFA浓度从固定步骤所用的4%降低至人胰腺样本的1%。对于其他组织，尤其是小鼠组织，为提供足够的水凝胶刚性以保存抗原，所需PFA的浓度必须通过实验经验确定。充分的透明也至关重要，因为透明不充分的组织会降低抗体渗透性，并增加二抗的表面染色。每隔一天（或甚至每天）更换一次透明溶液，有助于维持pH稳定并确保去垢剂新鲜。相反，过度透明会对细胞形态产生负面影响，并增加组织脆性。由于某些胰腺样本因固有病理（如慢性胰腺炎或其他病变导致的纤维化区域）而出现透明不均，因此必须频繁监测该过程。使用振动切片机制备厚切片也可实现均匀厚度，但并非必需。在透明过程中密切监测，一旦光线能轻松穿透样本即刻取出样本，可确保组织达到充分透明。
抗体渗透和表面染色是PACT样本处理中需要考虑的重要问题。为确保良好的抗体渗透，必须将样本与一抗孵育至少2天。不同抗体的扩散速率各异，应分别进行优化；但对于大多数抗体而言，在1 mm3的样本中，4天已足以实现完全渗透。如果存在表面染色问题，尤其是在进行光片成像时，可在染色后将样本切半或去除表面组织。在条件允许的情况下，使用小分子量抗体有望改善组织渗透性8。预偶联抗体的效果通常不如相同克隆的非偶联抗体，且即使能够发挥作用，也可能出现非特异性结合导致的背景信号升高以及组织渗透性较差的问题。为了提高预偶联抗体的使用效果，可提高染色缓冲液中血清和TritonX-100的浓度，并延长孵育时间（&#62;4天）。染色完成后，样本在RIMS溶液中孵育数天至关重要。透明化组织在PBS中会膨胀，而经RIMS孵育后可收缩回原始大小。特别是在进行光片成像时，应在成像前确保样本充分平衡。
在共聚焦显微镜上成像样品时，每次选择新的位置都必须重新设置校正参数。由于成像深度不同以及组织内染色强度存在差异，需要针对组织的每个成像区域进行相应调整，以实现最佳成像效果。同样，所使用的二抗也必须仔细选择。PACT样品中的光谱拆分具有挑战性，因此必须合理选择荧光染料，使其激发或发射光谱重叠尽可能小，以确保在共聚焦显微镜上滤光时获得明亮的信号。对于每种应用，都必须在分辨率、成像速度和降噪之间取得平衡，以便在不发生光漂白的前提下获取最高质量的图像。分辨率超过1024 × 1024时，人眼已无法分辨，但如果需要对染色进行定量分析，则可能仍需更高的分辨率。
在选择光学透明化技术以及选择光学透明化方法而非其他更传统的方法时，有许多因素需要考虑。使用PACT方法可能无法检测到丰度较低的抗原，因此在抗原检测方面存在局限性。某些抗原（如免疫相关抗原CD3、CD4、CD8、 等等。通过PACT方法，这些结构会被破坏，即使使用高质量的抗体也无法检测。该方法的另一个局限性在于供体胰腺之间固有的差异性，这种差异在透明化染色完成前难以辨别。每个供体组织在不同实验间的透明化和染色效果通常相似，但不同供体组织的透明化时间及透明化后的组织形态学质量则存在显著差异。若能充分获取大量患者胰腺样本，使用存档组织可能有助于缓解这一局限，但目前尚未对此进行充分研究。本文报道的PACT方案成本低廉，且可使用常规实验室设备便捷实施。透明化后的样本适用于传统共聚焦显微镜、双光子显微镜以及光片显微镜成像，能够提供人类胰腺大范围组织中神经和胰岛的高分辨率三维图像。该技术未来的应用包括胎儿胰腺外分泌和内分泌部分发育的研究，以及1型和2型糖尿病中的胰岛研究。

直到最近，大块组织或完整器官的三维（3D）重建仍需通过繁琐的连续切片、对多个切片进行染色以及图像重建来完成。这些方法存在若干缺点，包括依赖大量连续切片、抗体对组织的穿透性差，以及光散射阻碍组织深层成像。为了提高光和抗体的穿透能力，研究人员开发了化学方法，在去除大部分产生光散射的脂质的同时，保留蛋白质抗原。相关方法包括透明脂质交换丙烯酰胺杂交刚性成像组织水凝胶（Clear Lipid-Exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging Tissue hYdrogel, CLARITY）、被动透明技术（Passive Clarity Technique, PACT）和原位灌注辅助试剂释放（Perfusion-assisted Agent Release in situ, PARS）（综述见1,2,3,4,5,6）。CLARITY 方法基于使用甲醛、丙烯酰胺和双丙烯酰胺（bis）形成水凝胶以稳定蛋白质，随后在十二烷基硫酸钠（SDS）溶液中通过电泳去除脂质2。该方法之后被改进为被动透明化并适用于先进成像7。进一步优化去除了水凝胶中的双丙烯酰胺，并调整了多聚甲醛的浓度（1–4%），以在最短透明时间内实现最佳抗原稳定，由此发展出 PACT 技术8。早期开发光学透明化技术的尝试曾使用有机溶剂或其他难以操作的化合物，这些试剂会淬灭转基因小鼠模型中的内源性荧光蛋白。其他方法还包括 ScaleS、无阻碍脑/体组织混合液与计算分析（Unobstructed Brain/Body Cocktails and Computational analysis, CUBIC）、SWITCH 以及溶剂透明器官的维度成像（Dimensional Imaging of Solvent-Cleared Organs, DISCO）等，各有优缺点9,10,11,12。原始的 CLARITY 方法是在富含脂质的小鼠脑组织中开发的，而光学透明化方法在人类组织中的应用测试仍较为有限7,8,11,13,14。
光学透明化方法非常适合在完整的小鼠中枢神经系统中长距离追踪神经。胰腺受到自主神经系统和感觉神经系统的良好支配。胰腺内分泌部分——朗格汉斯岛（胰岛）——仅占整个器官的一小部分（1–2%），且胰岛在大小（50–250 µm）、内分泌细胞比例和密度方面已知存在异质性，尤其是在糖尿病中（详见文献15,16）。在开发实验方案过程中，测试了多种光学透明化方法用于人胰腺组织，发现PACT方法在透明所需时间（约2周）与神经和胰岛形态结构的优异保存之间达到了最佳平衡。本文所述为最终优化后的操作流程，用于描绘神经-胰岛网络，实现对多个完整胰岛的大尺度（毫米级距离）和高分辨率三维成像。该技术适用于固定后立即处理的人胰腺组织，也适用于固定后储存的样本，以及经中性缓冲甲醛固定并包埋于石蜡中的样本。样本可适用于共聚焦显微镜或光片显微镜成像。

<table><tbody><tr><td>10倍磷酸盐缓冲液 (PBS)</td><td>Fisher</td><td>BP399-1</td><td>缓冲液</td></tr><tr><td>无水磷酸氢二钠</td><td>Fisher</td><td>S375-500</td><td>PB 缓冲液 (RIMS)</td></tr><tr><td>一水合磷酸二氢钠</td><td>Sigma</td><td>71507-250</td><td>PB 缓冲液 (RIMS)</td></tr><tr><td>16% 多聚甲醛 (PFA)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15714-5</td><td>浸渍固定、水凝胶、储存溶液</td></tr><tr><td>40% 丙烯酰胺</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0140</td><td>水凝胶</td></tr><tr><td>2% 双丙烯酰胺</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0142</td><td>水凝胶</td></tr><tr><td>VA-044 引发剂</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>VA044</td><td>水凝胶</td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠 (SDS)</td><td>Fisher</td><td>BP166-5</td><td>透明缓冲液</td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Sigma</td><td>S8032</td><td>样品储存缓冲液</td></tr><tr><td>18 号针头</td><td>Fisher</td><td>14-840-91</td><td>水凝胶溶液脱气</td></tr><tr><td>氮气罐 (N2 tank)</td><td>AirGas</td><td>various</td><td>水凝胶溶液脱气</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>100 ml</td><td>缓冲液</td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>Vector</td><td>S-1000</td><td>在封闭缓冲液中使用浓度为 2%</td></tr><tr><td>Histodenz</td><td>Sigma</td><td>D2158-100G</td><td>RIMS</td></tr><tr><td>8 孔培养板</td><td>Ibidi</td><td>80827</td><td>成像</td></tr><tr><td>激光扫描共聚焦显微镜</td><td>Zeiss</td><td>710</td><td>成像</td></tr><tr><td>光片显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Z1</td><td>成像</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;一抗&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD45</td><td>Bioss</td><td>bs-4820R-A488</td><td>宿主：兔&lt;br/&gt; 稀释比例：1:100&lt;br/&gt; 备注：无效</td></tr><tr><td>CD45</td><td>DAKO</td><td>M0754</td><td>宿主：小鼠&lt;br/&gt; 稀释比例：1:200&lt;br/&gt; 备注：无效</td></tr><tr><td>GFAP</td><td>DAKO</td><td>Z0334</td><td>宿主：兔&lt;br/&gt; 稀释比例：1:50&lt;br/&gt; 备注：有效</td></tr><tr><td>胰高血糖素</td><td>BD Biosciences</td><td>565891</td><td>宿主：小鼠&lt;br/&gt; 稀释比例：1:50&lt;br/&gt; 备注：有效</td></tr><tr><td>胰高血糖素</td><td>Cell Signaling</td><td>2760S</td><td>宿主：兔&lt;br/&gt; 稀释比例：1:200&lt;br/&gt; 备注：无效</td></tr><tr><td>胰高血糖素</td><td>Abcam</td><td>ab10988</td><td>宿主：小鼠&lt;br/&gt; 稀释比例：1:200&lt;br/&gt; 备注：有效</td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>DAKO</td><td>A0564</td><td>宿主：豚鼠&lt;br/&gt; 稀释比例：1:200&lt;br/&gt; 备注：有效</td></tr><tr><td>NCAM (CD56)</td><td>DAKO</td><td>M730429-2</td><td>宿主：小鼠&lt;br/&gt; 稀释比例：1:50&lt;br/&gt; 备注：无效</td></tr><tr><td>NCAM (CD56)-FITC 偶联物</td><td>DAKO</td><td>M730429-2</td><td>宿主：小鼠&lt;br/&gt; 稀释比例：1:50&lt;br/&gt; 备注：无效</td></tr><tr><td>周围蛋白</td><td>EnCor</td><td>RPCA-Peri</td><td>宿主：兔&lt;br/&gt; 稀释比例：1:100&lt;br/&gt; 备注：有效</td></tr><tr><td>PGP9.5</td><td>DAKO</td><td>Z5116</td><td>宿主：兔&lt;br/&gt; 稀释比例：1:50&lt;br/&gt; 备注：无效</td></tr><tr><td>分泌颗粒蛋白 3</td><td>Sigma</td><td>HPA006880</td><td>宿主：兔&lt;br/&gt; 稀释比例：1:200&lt;br/&gt; 备注：有效</td></tr><tr><td>平滑肌肌动蛋白</td><td>Sigma</td><td>A5228; C6198 (Cy5)</td><td>宿主：小鼠&lt;br/&gt; 稀释比例：1:200; 1:200&lt;br/&gt; 备注：有效；偶联物效果优于未偶联物</td></tr><tr><td>P 物质</td><td>BioRad</td><td>8450-0505</td><td>宿主：大鼠&lt;br/&gt; 稀释比例：1:200&lt;br/&gt; 备注：有效</td></tr><tr><td>酪氨酸羟化酶</td><td>Millipore</td><td>AB152</td><td>宿主：兔&lt;br/&gt; 稀释比例：1:200&lt;br/&gt; 备注：有效</td></tr><tr><td>酪氨酸羟化酶</td><td>Abcam</td><td>Ab76442</td><td>宿主：鸡&lt;br/&gt; 稀释比例：1:100&lt;br/&gt; 备注：有效，但染色较弱</td></tr><tr><td>血管活性肠肽 (VIP)</td><td>Immunostar</td><td>20077</td><td>宿主：兔&lt;br/&gt; 稀释比例：1:100&lt;br/&gt; 备注：有效</td></tr><tr><td>囊泡乙酰胆碱转运体 (VAChT)</td><td>Synaptic Systems</td><td>139103</td><td>宿主：兔&lt;br/&gt; 稀释比例：1:50&lt;br/&gt; 备注：有效</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;二抗&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>豚鼠 IgG</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Various</td><td>宿主：山羊&lt;br/&gt; 稀释比例：1:200&lt;br/&gt; 备注：AlexaFluor 偶联物</td></tr><tr><td>小鼠 IgG</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Various</td><td>宿主：山羊&lt;br/&gt; 稀释比例：1:200&lt;br/&gt; 备注：AlexaFluor 偶联物</td></tr><tr><td>兔 IgG</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Various</td><td>宿主：山羊&lt;br/&gt; 稀释比例：1:200&lt;br/&gt; 备注：AlexaFluor 偶联物</td></tr><tr><td>大鼠 IgG</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Various</td><td>宿主：山羊、驴&lt;br/&gt; 稀释比例：1:200&lt;br/&gt; 备注：AlexaFluor 偶联物</td></tr><tr><td>鸡 IgG</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Various</td><td>宿主：山羊&lt;br/&gt; 稀释比例：1:200&lt;br/&gt; 备注：AlexaFluor 偶联物</td></tr></tbody></table>

人类胰腺神经-胰岛网络的高分辨率三维成像

High Resolution 3D Imaging of the Human Pancreas Neuro-insular Network

使用传统的组织学方法，研究人员在对整个组织或器官进行大规模三维成像时受到限制。组织学切片通常局限于玻璃载片上的福尔马林固定石蜡包埋切片厚度小于&#60;20 µm，或游离固定切片厚度小于&#60;500 µm。因此，若要利用传统方法重建厚度超过&#62;500 µm样本的三维结构，需要进行大量的连续切片及大规模图像重建工作。此外，光在组织内大分子（尤其是脂质）中的散射，使得大多数共聚焦显微镜无法对深度超过&#62;150 µm的区域进行有效成像。为了减少光散射，并实现仅使用简单的共聚焦显微镜即可对深层组织成像，目前已开发出多种适用于通过浸渍法固定的啮齿类动物和人类组织样本的光学透明化方法。其中一些方法相互关联，通常采用丙烯酰胺进行蛋白质交联，并使用十二烷基硫酸钠（SDS）实现组织透明化。其他光学透明化技术则使用了不同的溶剂，但每种改良方法均各有优缺点。本文描述了一种优化的被动式光学透明化方法，适用于人类胰腺神经支配的研究，特别是针对人类胰岛神经支配的分析。

这些染色程序的开发旨在对人类胰腺进行大规模检查，以观察胰岛及其相关的自主神经和感觉神经网络。测试了多种方法，包括 CLARITY7、iDISCO17 和 PACT8，其中 PACT 方法被发现最适合用于人类胰腺及共聚焦成像。
首先在固定的人胰腺样本上测试一抗，同时使用适当的阳性对照和阴性对照样本（如小鼠脑组织等）。一抗及其建议稀释比例列于材料表中，但各实验室需根据抗体批次号和组织来源优化一抗的稀释比例。不同批次的一抗可能在染色强度和特异性上存在差异，因此需要重新验证，以确保达到与之前试剂相当的染色强度。
在人胰腺中，胰岛由胰岛素、胰高血糖素和分泌颗粒蛋白3界定（图2）。利用胶质纤维酸性蛋白（GFAP）对施万细胞进行界定（图2 和 图3A）。使用针对副交感神经标志物血管活性肠肽（VIP）的抗体对神经进行染色，并在光片显微镜下成像（图3B）。通过酪氨酸羟化酶染色可观察到交感神经（未显示）。
<img alt="脱蜡过程，从组织样本中去除石蜡，载玻片制备，显微镜结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56859/56859fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1. 人胰腺组织光学透明化。 (A) 使用剃刀刀片切割并松动石蜡包埋组织的切片（上图），随后取下组织切片并刮除组织上多余的石蜡（下图）。代表性组织样本显示了在按照方案部分所述进行光学透明化处理前 (B 左，C 上) 和处理后 (B 右，C 中) 的状态。透明化后的固定组织在透明化处理后并非完全透明 (B 右，C 上)，且常可观察到组织肿胀现象 (C，中图)。组织在 RIMS 溶液中平衡后变得完全透明 (C，下图)。比例尺：500 µm。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56859/56859fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示细胞结构的荧光显微镜结果；蛋白质标志物的三维成像与分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56859/56859fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2. 人类神经-胰岛网络。 人类胰腺样本来自nPOD器官捐献者或存档的石蜡包埋组织，按所述方法进行透明化处理。(A-D) 显示施万细胞（GFAP+，白色）和内分泌细胞经胰岛素（红色）和胰高血糖素（绿色）染色的结果。(A) 共聚焦显微镜与最大强度投影（MIP）显示施万细胞（GFAP+）沿胰岛边缘血管旁走行的神经分布，并延伸至胰岛内部。插图展示了所获得的高分辨率图像，并显示GFAP+施万细胞与内分泌细胞之间的接触。(B) A图的三维图像（比例尺：x = 50 µm，y = 20 µm，z = 25 µm）。通过共聚焦显微镜对石蜡-PACT样本进行成像，并以最大强度投影 (C) 和三维形式 (D) 展示（比例尺：x, y = 50 µm，z = 25 µm）。比例尺 A, C：50 µm。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56859/56859fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="三维显微镜：神经元重建、树突（D）、生长（G）；空间定位图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56859/56859fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3. 三维可视化与拼接。 通过使用GFAP染色和共聚焦显微镜获取了三组拼接的图像序列，并利用图像分析软件中的神经突追踪插件进行追踪。 （A） 轨迹的3D填充显示（比例尺：x = 150 µm, y = 200 µm (0.2 mm)，z = 120 µm) （B） 一个PACT样本经VIP抗体染色后，使用光片显微镜成像。该图像序列是 &gt;深度为1 mm，神经纤维在高分辨率下清晰可见。可见包绕导管（D，前景）和神经节（G，背景）的纤维（大网格：x, y, z = 200 µm；刻度标记：x、y、z = 40 µm). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56859/56859fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

本文介绍了一种利用优化的被动透明化方法对人类胰腺组织切片进行三维（3D）成像的实验方案。该文详细展示了通过被动光学透明化处理，继而进行多重免疫荧光染色的操作流程，以鉴定支配人类胰岛的自主神经和感觉神经网络中的关键组分。

使用传统组织学方法，研究人员在对整个组织或器官进行大规模三维成像时受到限制。组织学……

本方案的总体目标是展示一种经过优化的被动光学透明化方法，适用于人胰腺组织。该方法有助于回答糖尿病神经生物学领域的关键问题，提供有关胰岛神经支配的详细信息。该技术的主要优势在于，透明化方法可确保人胰腺组织透明，适用于高分辨率共聚焦成像。首先，通过将胰腺样本置于新配制的4%多聚甲醛中进行固定，并在4°C下孵育48小时。接着，将一个烧瓶放入装有冰的容器中进行冷却，并将该容器放置在磁力搅拌器上。确保烧瓶平稳放置，并加入一个磁力搅拌子。将147.8毫升冰浴的蒸馏去离子水倒入烧瓶中。然后依次加入20毫升0.1摩尔的PBS、20毫升冰浴的40%丙烯酰胺溶液、12.2毫升16%多聚甲醛溶液以及250毫克VA-044引发剂。将整个水凝胶溶液混合至少10分钟。接着，将一个15毫升的锥形管放在冰上，置于盛有水凝胶溶液的烧瓶旁边。用移液器将14毫升单体溶液移入该管中。加入一块固定并切片的组织样本，然后盖紧管盖。将样本置于单体溶液中，在4°C避光条件下孵育3天。孵育结束后，将样品置于冰上。接着，通过一个旋塞阀将管路连接至氮气罐。在保持样品处于冰上的同时，小心使用18号皮下注射针头从一侧刺穿装有样品的锥形管管盖。将针头插入试管，直至其位于液态单体溶液的液面以下。然后用另一支18号皮下注射针头刺穿管盖的对侧，但不要让其浸入溶液中，以起到排气作用。将氮气罐的管路连接到浸没在水凝胶液面下的皮下注射针头上，缓慢打开氮气，使氮气以稳定气泡的形式通过液体。去氧完成后，迅速拔出两根针头，并用石蜡膜覆盖管盖，以防止试管与环境之间进一步发生气体交换。最后，将样品置于37摄氏度的培养箱中孵育3小时，以使水凝胶聚合。聚合完成后，倒掉残留的水凝胶。然后，用 0.01 摩尔的 PBS 溶液分 3 至 5 次洗涤样本，每次洗涤 15 分钟。洗涤完成后，将样本转移至含有 40 毫升透明化缓冲液的 50 毫升锥形管中。在 37 摄氏度下将样本置于透明化缓冲液中孵育，并每隔一天更换一次新鲜的透明化缓冲液。为检查透明是否充分，将样本置于光源前观察，确保样本透光但外分泌区域仍保留一些棕褐色。过度透明的样本边缘会显得蓬松，用镊子夹取时质地非常柔软。样本透明不均是常见现象。用 40 毫升 0.01 摩尔 PBS 缓冲液替换透明缓冲液，将样品置于摇床中，在室温下以 60 转/分钟振荡一天。进行四到五次缓冲液更换，并让最后一次洗涤过夜。接下来，在 2 毫升平底管中配制 PACT 染色缓冲液，并向 1 毫升基础 PACT 缓冲液中加入 2% 正常血清。然后，向染色缓冲液中加入大约五倍于标准用量的初级抗体。使用刮勺将样本从洗涤缓冲液中取出，并用纸巾轻轻吸去多余的缓冲液。将样本放入含有初级抗体溶液的离心管中，在室温下置于摇床上，以60 RPM的速度孵育2至4天。孵育结束后，移除抗体溶液，加入 0.01 摩尔 PBS。在摇床中以 60 RPM 充分洗涤样本，更换新鲜缓冲液四至五次，并将最后一次洗涤液留在摇床上过夜。接着，按 1:200 的比例将二抗加入含 2% 血清的 PACT 染色缓冲液中。使用刮刀将样品从洗涤缓冲液中取出，并用纸巾轻轻吸去多余的缓冲液。然后将样品放入含有二抗溶液的离心管中。在室温下，于摇床以60 RPM的转速孵育两天，期间避免光照。孵育结束后，移除抗体溶液，并替换为 0.01 摩尔的 PBS。在摇床中以 60 RPM 的速度彻底清洗样品，更换新鲜缓冲液四到五次，并将最后一次洗涤液留在摇床上过夜。首先，准备折射率匹配溶液缓冲液：准确称取 11 克非离子型密度梯度介质，小心转移至 50 毫升锥形管中。然后使用刮勺向粉末状非离子密度梯度介质中加入 5 毫升 0.02 摩尔磷酸盐缓冲液，以释放其中的空气。如有需要，可继续加入更多 0.02 摩尔磷酸盐缓冲液，使总体积达到 10 毫升，用刮勺混匀，再将刮勺上多余的液体刮入离心管中。将缓冲液在 37 摄氏度下孵育，直至完全溶解，并在此过程中定期颠倒并轻轻混匀。将样品转移至折射率匹配溶液缓冲液中，在避光条件下于室温孵育2至4天，然后进行成像。成像前，先在八孔盖玻片底共聚焦培养皿中加入少量折射率匹配溶液，随后将样品加入孔中，并盖上盖片。在人类胰腺中，可通过胰岛素、胰高血糖素和分泌颗粒三号分别标记β细胞、α细胞或所有内分泌细胞来界定胰岛。施万细胞呈白色，内分泌细胞则由胰岛素或胰高血糖素染色显示。神经与胰岛边缘的血管伴行，呈现为白色线条，并延伸进入胰岛内部。此处可清晰观察到施万细胞与内分泌细胞之间的接触。该样本采用本视频所示方法制备，经血管活性肠肽染色后，使用光片显微镜成像。神经纤维以高分辨率清晰可见，显示其环绕前景中的导管以及背景中的神经节。进行此操作时，重要的是要记住使用不含主要导管和血管的胰腺腺泡区域。

high-resolution-3d-imaging-of-the-human-pancreas-neuro-insular-network

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科研

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生物工程

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in situ 小鼠胰岛β细胞数量的原位定量分析

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计算机辅助的大规模胰岛质量、大小分布及结构的可视化与定量分析

我们描述了光学投影断层成像技术（optical projection tomography, OPT）1...

近红外光学投影断层成像用于糖尿病研究中β细胞质量分布的评估

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生成人胰腺组织切片以研究内分泌和外分泌胰腺生理学

学习被动光学透明化方法对人类胰腺组织进行高分辨率三维成像，结合免疫荧光染色技术揭示胰岛自主神经与感觉神经网络结构。该方法为糖尿病神经生物学研究提供重要技术支持。

人类胰腺神经-胰岛网络的高分辨率三维成像

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