人类胰岛神经网络的高分辨率3D 成像

该协议的总体目标是展示一种适用于人胰腺组织的优化、被动光学透明化方法。该方法可以通过提供有关胰岛神经支配的详细信息来帮助回答神经生物学领域与糖尿病有关的关键问题。该技术的主要优点是透明化方法可确保人类胰腺组织的透明度，用于高分辨率共聚焦成像。

首先，将胰腺样品放入新鲜制备的 4% 多聚甲醛中固定，并在 4 摄氏度下孵育样品 48 小时。接下来，将烧瓶放入装有冰块的桶中冷却。然后将桶放在磁力搅拌板的顶部。

确保培养瓶平放，并添加磁性搅拌棒。将 147.8 毫升冰冷的蒸馏去离子水倒入培养瓶中。然后加入 20 毫升 0.1 摩尔 PBS、20 毫升冰冷的 40% 丙烯酰胺溶液、12.2 毫升 16% 多聚甲醛溶液和 250 毫克 VA-044 引发剂。

将整个水凝胶溶液混合至少 10 分钟。接下来，将一根 15 毫升的锥形管放入装有水凝胶溶液的烧瓶旁边的冰中。将 14 毫升单体溶液移液到试管中。

并添加一块固定和切片的组织样本。然后盖上试管。将样品在 4 摄氏度下在单体溶液中孵育 3 天，同时避光。

孵育后，将样品置于冰上。接下来，通过旋塞阀将管道连接到氮气罐。将样品保存在冰上时，小心地使用 18 号皮下注射针刺穿一侧装有样品的锥形管的盖子。

将针头插入管中，直到它位于液体单体溶液的表面下方。然后用另一根 18 号皮下注射针刺穿瓶盖的另一侧，但不要让它浸没在溶液中，这样它就可以起到通风口的作用。将氮气罐的管道连接到浸没在水凝胶下的皮下注射针头，然后慢慢打开氮气，直到它在液体中稳定地冒泡。

脱氧后，快速取出两个针头，并用石蜡膜盖住盖子，以防止试管与环境之间进一步交换气体。最后，将样品放入 37 摄氏度的培养箱中 3 小时，以聚合水凝胶。聚合后，倒掉任何剩余的水凝胶。

然后，用 3 至 5 次 0.01 摩尔 PBS 交换洗涤样品，每个洗涤步骤15 min。洗涤后，将样品转移至含有 40 mL 的 50 mL 锥形管中或透明缓冲液中。将样品在 37 摄氏度的透明缓冲液中孵育，并每隔一天将样品更换为新鲜的透明缓冲液。

要检查是否正确清除，请将样品放在光线下，确保样品允许光线穿过，但在外分泌区域保留一些棕褐色。过度清除的样品在边缘会出现磨损，并且用镊子拾取时纹理会非常柔软。样品清除不均匀是很常见的。

用 40 毫升 0.01 摩尔 PBS 交换澄清缓冲液，并将样品以 60 RPM 的转速放在摇床上，在室温下放置一天。更换缓冲液 4 至 5 次，让最后一次洗涤持续过夜。接下来，在 2 mL 平底管中制备 PACT 染色缓冲液，并将 2% 正常血清添加到 1 mL 基础 PACT 缓冲液中。

然后，向染色缓冲液中加入大约五倍标准量的一抗。使用刮刀从洗涤缓冲液中取出样品，然后将多余的缓冲液轻拍到纸巾上。将样品放入装有一抗溶液的试管中，并在室温下在摇床上以 60 RPM 的转速在溶液中孵育 2 至 4 天。

孵育后，去除抗体溶液并加入 0.01 摩尔 PBS。在摇床上以 60 RPM 的速度彻底清洗样品，更换为新鲜缓冲液 4 到 5 次，然后将最后一次洗涤液在摇床上过夜。接下来，在 PACT 染色缓冲液中加入 1 至 200 的二抗，并添加 2% 血清。

使用刮刀从洗涤缓冲液中取出样品，然后将多余的缓冲液轻拍到纸巾上。然后将样品放入装有二抗溶液的试管中。保护样品避光，同时在室温下在摇床上以 60 RPM 孵育样品两天。

孵育后，取出抗体溶液并用 0.01 摩尔 PBS 替换。在摇床上以 60 RPM 的速度彻底清洗样品，更换为新鲜缓冲液 4 至 5 次，然后将最后一次洗涤液留在摇床上过夜。首先，首先称取 11 克非离子密度梯度培养基，然后小心地将其转移到 50 毫升锥形管中，以制备折光率匹配的溶液缓冲液。

然后使用刮刀加入 5 毫升 0.02 摩尔磷酸盐缓冲液，以从粉末状非离子密度梯度介质中释放空气。如有必要，使用更多的 0.02 摩尔磷酸盐缓冲液，将体积增加到 10 毫升，用刮刀混合，然后将刮刀上多余的部分刮入试管中。将缓冲液在 37 摄氏度下孵育直至其完全溶解，定期倒置并轻轻混合。

将样品转移到示差折光匹配溶液缓冲液中，并在成像前避光在工作台上孵育 2 至 4 天。在成像之前，将少量折射率匹配溶液放入 8 孔盖玻片底部腔室载玻片中。然后将样品加入孔中并盖上载玻片。

在人胰腺中，胰岛可以分别用胰岛素、胰高血糖素和分泌的 Grana Three 来描绘 β 细胞、α 细胞或所有内分泌细胞。雪旺细胞呈白色，内分泌细胞被胰岛素或胰高血糖素染色。在胰岛外围的血管旁边流动的神经以白线的形式突出并延伸到胰岛。

在这里，可以清楚地看到雪旺细胞和内分泌细胞之间的接触。在这里，使用本视频中所示的方法制备的样品对血管活性肠肽进行染色，并使用光片显微镜成像。神经纤维在高分辨率下清晰可见，前景中包裹着导管，背景中包裹着神经节。

在尝试此程序时，请务必记住使用没有主要导管和血管的胰腺腺泡区域。