Name: 成人皮肤角质形成细胞的生成与培养 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: 学习从成人皮肤中分离和培养原代人角质形成细胞的方法，用于体外研究皮肤生物学。该技术适用于18岁以上人群的皮肤样本，为研究表皮细胞分化和炎症性皮肤病提供可靠的实验模型。

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作者感谢 Annette Blak Rasmussen 和 Kristine Moeller 提供的技术支持

采集接受整形手术的健康成年志愿者的皮肤样本需获得所在机构伦理委员会的批准。本方案已通过丹麦中日德兰大区区域伦理委员会（M-20110027）的审批。本文所述方法参考了 Maciaq et al.10 和 Liu 与 Karasek11 所开展的类似研究。
1. 从人皮肤中分离角质形成细胞
<ol>
	<li>首先配制以下溶液：50 mL 含 0.25% 胰蛋白酶和 0.1% 葡萄糖的 DPBS 溶液。混合后用 0.2 µm 滤器过滤除菌。配制 10 mL RPMI-1640 + 2% FBS 溶液、50 mL DPBS 以及无血清角质形成细胞培养基（KSFM）。向 500 mL KSFM 中加入 KSFM 添加剂和 250 µL 庆大霉素。使用前将所有溶液预热至 37 °C。</li>
	<li>收集接受整形手术的健康成年志愿者的皮肤组织。所用皮肤样本大小约为 10 cm × 15 cm，但可有所差异。运输过程中将皮肤样本置于含冷却元件的泡沫箱中以保持低温。如有需要，皮肤样本可在 4 °C 下保存过夜。</li>
	<li>使用无菌剪刀、手术刀和镊子去除皮肤组织下方的脂肪组织。</li>
	<li>将皮肤组织（约 10 cm × 15 cm）用针固定在培养皿上方的无菌盖上，使其呈绷紧状态。首先用干燥的无菌纱布擦拭皮肤表面，随后用浸有 70% 乙醇的无菌纱布再次清洁皮肤。</li>
	<li>使用足部刨刀切下皮肤组织的上层（表皮层），并将其放入一个 9 cm 的培养皿中。立即向培养皿中加入 25 mL 第 1.1 步配制的 DPBS/胰蛋白酶/葡萄糖溶液。在 37 °C 下孵育 30 分钟。</li>
	<li>用移液器吸除培养皿中的 DPBS/胰蛋白酶/葡萄糖溶液，加入 10 mL RPMI-1640 + 2% FBS 以中和胰蛋白酶活性。</li>
	<li>使用两把镊子轻轻刮擦并搅动皮肤组织的表皮层和真皮层，使表皮细胞释放到培养基中。</li>
	<li>将表皮细胞悬液通过孔径为 1 mm 的金属滤网过滤，并收集至 50 mL 离心管中。将剩余的皮肤组织加入另一含有 10 mL 不含 FBS 的 RPMI-1640 培养基的 50 mL 离心管中，涡旋振荡 10 秒。将该悬液同样通过金属滤网过滤，收集至含有表皮细胞悬液的 50 mL 离心管中。再加入 DPBS 至总体积为 50 mL。</li>
	<li>将细胞悬液在室温下以 450 × g 离心 10 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，根据细胞沉淀的大小，用约 10 mL 37 °C 的 KSFM 重悬表皮细胞沉淀。在显微镜下采用台盼蓝染色法进行细胞计数。从一块 10 cm × 15 cm 的皮肤组织中通常可获得约 50–100 × 106 个细胞。将 8 × 106 个细胞与 12 mL 37 °C 的 KSFM 一起接种至每个 75 cm2 的培养瓶中。轻轻摇晃培养瓶，确保细胞均匀分布。</li>
	<li>将角质形成细胞置于 37 °C、100% 湿度及 5% CO2 的培养箱中培养。2 天后首次换液，之后每周换液三次。当细胞融合度达到 70–80% 时进行传代，具体时间约为 2 周，视角质形成细胞的增殖速率而定。</li>
</ol>
2. 角质形成细胞的传代
<ol>
	<li>将适量的0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液在培养箱中加热至37 °C。对于75 cm2培养瓶，使用4.5 mL的0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液。</li>
	<li>移除细胞培养基，向细胞中加入预热的4.5 mL/75 cm2培养瓶的0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液。将培养瓶放入培养箱（37 °C），约5分钟后在显微镜下观察细胞是否开始脱落。</li>
	<li>当约50%的细胞已脱落时，轻轻用手敲击培养瓶使剩余细胞脱落。随后，为灭活胰蛋白酶，向75 cm2培养瓶中加入6 mL RPMI-1640 + 2% FBS（37 °C），并将细胞悬液转移至50 mL离心管中。</li>
	<li>用3 mL RPMI 1640 + 2% FBS冲洗培养瓶，并将冲洗液加入50 mL离心管中。室温下以450 × g离心10分钟。
	<ol>
		<li>将沉淀的细胞重悬于10 mL KSFM（37 °C）中。计数细胞后，将3 × 106个细胞与20 mL KSFM（37 °C）一起转移至150 cm2培养瓶中。轻轻摇动培养瓶以确保细胞均匀分布。当培养细胞融合度达到80–90%时进行冻存，通常需要约4–6天，具体时间取决于角质形成细胞的增殖速率（见下文第3节冻存方案）。扩增角质形成细胞以制备合适的冷冻储备细胞株。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 角质形成细胞的冷冻
<ol>
	<li>将适量的 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液在 37 °C 培养箱中预热。每 150 cm2 培养瓶使用 9 mL 的 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液。</li>
	<li>吸除细胞培养基，向细胞中加入 9 mL/150 cm2 预热的 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液。将培养瓶放入培养箱（37 °C），约 5 分钟后在显微镜下观察细胞是否开始脱落。</li>
	<li>当约 50% 的细胞脱落时，轻轻用手敲击培养瓶以使剩余细胞脱落。随后，为灭活胰蛋白酶，向 150 cm2 培养瓶中加入 12 mL RPMI-1640 + 2% FBS（37 °C），并将细胞悬液转移至 50 mL 离心管中。</li>
	<li>用 6 mL RPMI 1640 + 2% FBS 冲洗培养瓶，并将冲洗液加入 50 mL 离心管中。在 4 °C 条件下以 450 × g 离心 10 分钟。同时配制冰上预冷的细胞冻存液（KSFM + 10% DMSO）。</li>
	<li>用 KSFM + 10% DMSO 重悬细胞沉淀，计数细胞，并按照 6 × 106 个细胞/mL 的密度，采用标准的慢速冷冻法进行细胞冻存12。</li>
	<li>将角质形成细胞储存于液氮（气相）中，待使用时取出。</li>
</ol>
4. 冻存角质形成细胞的解冻与培养
<ol>
	<li>在37 °C水浴中快速解冻相应的冻存管。用70%乙醇擦拭冻存管外壁。将适当数量的细胞（约15,000个细胞/cm2）转移至培养瓶，并立即向培养瓶中加入预热的生长培养基（KSFM）。 
	可根据实验设置选择任意规格的培养瓶。</li>
	<li>25 cm2培养瓶中加入5 mL培养基。由于不同供体来源的细胞生长状态存在差异，接种至培养瓶中的细胞数量可能有所变化。将细胞置于37 °C、100%湿度、5% CO2的培养箱中培养。</li>
	<li>培养2天后首次换液，之后每周更换三次新鲜预热的KSFM培养基。 
	注意：我们的研究数据显示，采用本方案分离的细胞中，平均约95%表达角质形成细胞标志物细胞角蛋白-1413。</li>
</ol>

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</ol>

作者无利益冲突。

本文介绍了如何从成人皮肤中轻松分离原代人角质形成细胞，以及如何在体外培养这些细胞。in vitro。该模型可广泛应用于表皮细胞生物学研究，对于致力于皮肤疾病研究的科研人员也具有重要价值。
本方案的优点之一在于，与从接受包皮环切术的新生男婴包皮中分离的角质形成细胞相比，成人患者的原代人角质形成细胞可来源于男性和女性，并且可涵盖任何年满18岁的个体。因此，这些细胞的生物学多样性远大于新生儿包皮来源的角质形成细胞。此外，接受整形手术（如乳房缩小术或减重手术）的患者可提供相对较大的皮肤样本。
如上所述，表皮由不同层次组成，这些层次对应角质形成细胞的特定分化阶段。为了研究皮肤生物学，此处描述的模型受限于缺乏三维微环境。该模型无法模拟表皮的不同层次以及皮肤中存在的多种细胞类型。为克服这一局限，可采用人皮肤等效模型，该模型包含多层上皮结构，其中角质形成细胞在暴露于气-液界面时发生分化，从而更接近于天然表皮17,18</...

皮肤是人体最大的器官，作为抵御外部环境的保护屏障。皮肤主要由两层构成：真皮层和表皮层，其中表皮层构成皮肤的最外层。表皮中最丰富的细胞类型是角质形成细胞，占表皮细胞总量的95%以上1,2。角质形成细胞在表皮中处于不同的分化阶段，并有序地分布为基底层、棘层、颗粒层和角质层，分别对应特定的分化阶段3。角质形成细胞的主要功能是维持表皮的结构完整性，从而形成一道完整的外界屏障。
角质形成细胞也是皮肤抵御病原体的第一道防线，因此在先天免疫反应中发挥着重要作用4,5角质形成细胞暴露于外界刺激后，会激活细胞内信号通路，进而产生多种炎症介质，包括细胞因子、趋化因子和抗菌肽。这些由角质形成细胞产生的蛋白质通过募集和激活树突状细胞、中性粒细胞及特定T细胞等免疫细胞，参与炎症反应。6,7因此，由于角质形成细胞在多种生物过程中发挥着关键作用，本文所介绍技术的原理旨在生成一种 体外 用于研究皮肤生物学的模型。通常采用新生儿包皮来源的原代角质形成细胞培养物来研究皮肤生物学8,9然而，采用此处所述技术，可获得来自两种性别的角质形成细胞，从而实现细胞更高的生物学多样性。
本文介绍了一种从成人皮肤中分离和培养原代人角质形成细胞的详细方案，包括细胞的维持与冻存。该方法的总体目标是获得可用于研究皮肤生物学的原代人角质形成细胞模型。 体外.

<table><tbody><tr><td>KSFM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17005-034</td><td>细胞培养基</td></tr><tr><td>KSFM 添加剂</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>37000-015</td><td>KSFM 培养基专用添加剂</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190-144</td><td>不含钙和镁的 DPBS</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>二甲基亚砜</td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15710-049</td><td>细胞培养基添加剂</td></tr><tr><td>灭菌滤器</td><td>Sartorius</td><td>16534</td><td>孔径为 0.2 &amp;micro;m 的注射器滤器</td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7409</td><td>用于细胞消化</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td>-</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>61870-010</td><td>-</td></tr><tr><td>FBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>16000044</td><td>用于灭活胰蛋白酶</td></tr><tr><td>镊子</td><td>-</td><td>-</td><td>任何厂商生产的镊子均可使用</td></tr><tr><td>剪刀</td><td>-</td><td>-</td><td>任何厂商生产的剪刀均可使用</td></tr><tr><td>手术刀</td><td>Swann Morton</td><td>0501</td><td>任何厂商生产的手术刀均可使用</td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>纱布垫</td><td>NOBAMED</td><td>875420</td><td>任何供应商提供的纱布垫均可使用</td></tr><tr><td>足部削皮刀</td><td>Credo Solingen</td><td>1510</td><td>任何供应商提供的足部削皮刀均可使用</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>TPP</td><td>93100</td><td>任何供应商提供的培养皿均可使用</td></tr><tr><td>金属滤网</td><td>-</td><td>-</td><td>自制金属滤网，孔径 1 mm</td></tr><tr><td>75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 培养瓶</td><td>NUNC</td><td>156499</td><td>-</td></tr><tr><td>150 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 培养瓶</td><td>TTP</td><td>90151</td><td>-</td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300-062</td><td>传代时用于细胞消化</td></tr></tbody></table>

成年皮肤来源人原代角质形成细胞的分离与培养

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

角质形成细胞的主要功能是维持表皮的结构完整性，从而形成抵御外界环境的机械屏障。此外，角质形成细胞作为先天免疫系统的一部分，能够快速、非特异性地响应抗原刺激，在表皮免疫反应的启动、维持和调控中发挥关键作用。本文介绍一种从成人皮肤中分离原代人角质形成细胞的实验方案，并证明这些细胞在钙诱导下可发生终末分化，表现为分化标志物兜甲蛋白（involucrin）表达水平升高。此外，我们还显示，分离获得的角质形成细胞可响应IL-1β诱导的细胞内信号通路激活，表现为p38 MAPK通路的活化。综上所述，本文描述了一种从成人皮肤中分离和培养原代人角质形成细胞的方法。由于角质形成细胞是表皮中最主要的细胞类型，该方法适用于研究皮肤生物学中的分子机制

关键词：角质形成细胞，原代细胞培养，表皮，终末分化，兜甲蛋白，IL-1β，p38 MAPK，皮肤生物学 体外.

钙诱导的终末分化 
人角质形成细胞在钙处理后会发生终末分化14,15,16。原代人角质形成细胞的分离与培养按照上述方案进行。当细胞融合度达到约50–60%时，用钙（1.2 mM）或对照溶剂处理细胞，并于第0、1、2天拍摄细胞图像。图1展示了钙刺激后观察到的角质形成细胞形态学变化。
钙刺激后兜甲蛋白的表达增加 
培养的人角质形成细胞生长至约50 - 60%融合度后，用钙离子（1.2 mM）或对照溶剂处理24和48小时。我们发现，随着角质形成细胞形态学变化所反映的细胞分化程度升高，分化标志物兜甲蛋白的mRNA表达在钙刺激后显著上调。与对照组相比，刺激24小时和48小时后，兜甲蛋白mRNA表达分别升高约5.5倍和3.5倍（图...

人类皮肤作为抵御外部环境的第一道防线。本文介绍一种从成人皮肤中分离原代人角质形成细胞的方法。这些分离得到的角质形成细胞可用于多种实验体系，是研究皮肤生物学中分子机制的理想模型。 体外.

角质形成细胞的主要功能是提供表皮的结构完整性，从而维持对外界环境的机械屏障。

本实验的总体目标是获得可用于体外研究皮肤生物学的原代人角质形成细胞。该方法有助于回答表皮细胞生物学领域的一些关键问题，例如人角质形成细胞分化是如何被调控的，或作为研究炎症性皮肤病的模型。该技术的主要优势在于，原代人角质形成细胞可常规地从成年男性和女性的皮肤组织中分离获得，并且可包括18岁以上任何年龄段个体的皮肤样本。演示该实验操作的是来自我实验室的技术员 Annette Blak Rasmussen。首先，配制 50 毫升含 0.25% 胰蛋白酶和 0.1% 葡萄糖的 DPBS 溶液。然后混合并过滤除菌。准备 10 毫升含 2% FBS 的 RPMI 1640、50 毫升 DPBS 以及无血清角质形成细胞培养基（KSFM）。向 500 毫升 KSFM 中加入 KSFM 添加剂和 250 微升庆大霉素。使用前将上述溶液预热至 37 摄氏度。从接受整形手术的健康成年志愿者处采集 10 厘米 × 15 厘米的皮肤样本。将皮肤样本置于含有制冷元件的泡沫塑料盒中运输，以保持低温。如有必要，可将皮肤样本在 4 °C 条件下保存过夜。使用灭菌的剪刀、解剖刀和镊子，去除皮肤切片下方的脂肪组织。然后，用针将皮肤切片在培养皿上方的无菌盖上展开固定。用干燥的灭菌纱布擦拭皮肤，进行清洁。然后，使用经灭菌的纱布垫蘸取70%乙醇擦拭。接着，用足部削皮器切除皮肤切片的上层表皮，并将其转移至一个9厘米的培养皿中。随后，立即向培养皿中加入25毫升预先配制的DPBS胰蛋白酶葡萄糖溶液。将样品在37摄氏度下孵育30分钟。使用移液器从培养皿中移除DPBS胰蛋白酶葡萄糖溶液，并加入10毫升含2%FBS的RPMI 1640培养基以灭活胰蛋白酶。接着，用两把镊子轻轻刮擦并搅动皮肤组织的表皮层和真皮层，使表皮细胞释放到培养基中。将表皮细胞悬液通过金属滤网过滤，并将滤液收集到一个50毫升离心管中。将剩余的皮肤组织片段加入含有10毫升不含FBS的RPMI 1640培养基的50毫升离心管中，涡旋振荡10秒。将此悬液通过金属滤网过滤，滤液收集至含有表皮细胞悬液的50毫升离心管中。然后，加入DPBS至总体积为50毫升。在室温下以450 × g离心细胞悬液10分钟。随后，弃去上清液，并根据细胞沉淀的大小，将表皮细胞沉淀重悬于约10毫升37摄氏度的KSFM培养基中。采用台盼蓝染色法，在显微镜下对细胞进行计数。然后，向每个75平方厘米的培养瓶中分别加入8×10⁶个细胞，并加入12毫升37°C的KSFM培养基。轻轻摇晃培养瓶，以确保细胞均匀分布。将角质形成细胞置于37摄氏度、100%湿度、5% CO2的培养箱中孵育。两天后更换培养基，之后每周更换三次。当细胞达到70-80%汇合度时，将适量的0.05%胰蛋白酶EDTA溶液置于37摄氏度培养箱中预热。吸去细胞中的培养基，向每个75平方厘米的培养瓶中加入4.5毫升预热的0.05

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

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介绍了一种从人皮肤中快速、高效分离活体成年上皮干细胞的方法。该方法利用酶消化皮肤胶原基质，随后拔取毛囊，并分离单细胞悬液或组织碎片用于细胞培养。...

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本视频介绍了一种利用重组逆转录病毒制备基因修饰的原代人角质形成细胞的详细实验方案。该方法可用于调控角质形成细胞中的基因表达。...

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一种简化且高效的人类原代角质形成细胞从成人皮肤组织中的分离方法

本方案描述了一种简便的方法，可重复且稳定地培养三维重建人表皮。此外，还对表皮屏障模型的结构-功能关系进行了表征。同时展示了重建人表皮在受到促炎刺激后的生物学反应。...

大规模培养三维重建人表皮

本文介绍了一种在三维悬浮培养体系中系统培养表皮球体的实验方案。该方案可广泛应用于多种上皮组织类型，并可用于多种人类疾病和病理状态的建模研究。...

建立高通量表皮球体培养系统以模拟角质形成细胞干细胞可塑性

本实验方案描述了从小鼠成年腭部分离和培养口腔角质形成细胞的方法。同时报道了一种使用免疫染色进行评估的方法。...

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研究与肌肉骨骼损伤相关的伤口愈合通常需要评估施万细胞（SCs）、角质形成细胞和成纤维细胞之间的体外相互作用。本方案描述了从人包皮中分离、培养和鉴定这些原代细胞的方法。...

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生成用于角质形成细胞活细胞成像的原代培养

学习从成人皮肤中分离和培养原代人角质形成细胞的方法，用于体外研究皮肤生物学。该技术适用于18岁以上人群的皮肤样本，为研究表皮细胞分化和炎症性皮肤病提供可靠的实验模型。

成年皮肤来源人原代角质形成细胞的分离与培养

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