Name: 体外刺激对龟脑神经的运动测量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: 学习使用体外离体头部制备技术测量红耳滑龟眼球运动的运动学特征。该方法通过刺激颅神经记录眼动和瞳孔变化，无需行为训练即可精确量化眼动参数，为眼动控制与视觉进化研究提供可靠电生理学手段。

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作者感谢Paulette McKenna女士和Lisa Pezzino在本研究中提供的行政支持，感谢Phil Auerbach先生提供的技术支持。作者还感谢Michael Ariel博士和Michael S. Jones博士（圣路易斯大学医学院）向我们介绍了体外分离头体制备方法。in vitro。本合作研究得到了拉法耶特学院生物学系（Robert S. Chase基金）、学术研究委员会以及神经科学项目的资助。最后，本工作谨献给Phil Auerbach先生，他于2016年9月28日逝世；他曾退役一台扫描电子显微镜，并认识到其五轴样品台在本实验方案中的应用价值。他的友谊与创造力将令人深切怀念。

注意：红耳滑龟（包括雄性和雌性）均购自供应商。龟类饲养于温暖的动物房内，房内设有两个60加仑的水箱，配备砖砌晒台，并在250瓦红外灯下供其晒背。环境维持14小时光照/10小时黑暗的光周期，水温保持在22 °C。灯光于早上6:00开启，晚上8:00关闭。水箱配备过滤系统，每周清洁一次，龟类每隔一天自由进食（ad libitum）。红耳滑龟的饲养管理及本文所述所有实验操作32,33均经拉法耶特学院机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准。
1. 仪器设置
<ol>
	<li>配制龟林格氏液。按以下顺序将下列成分加入蒸馏水中：氯化钠 96.5 mM（58.44 g/mol）、氯化钾 2.6 mM（74.56 g/mol）、氯化镁 2.0 mM（203.31 g/mol）、碳酸氢钠 31.5 mM（84.01 g/mol）、葡萄糖 20.0 mM（180.16 g/mol），用浓盐酸调节 pH 至 7.51，最后加入氯化钙 4.0 mM（110.98 g/mol）（见材料表）。每加入一种盐时均需搅拌溶液。 
	警告：浓盐酸具有危险性（对皮肤、眼睛、吸入和摄入均有危害）。</li>
	<li>使用长度为 5 cm 的毛细玻璃管（见材料表）制作吸电极尖端，通过火焰抛光制成不同内径的尖端，以适配不同粗细的脑神经。
	<ol>
		<li>用小锉刀在毛细玻璃管上刻划一条线，用&#160;纸巾包裹后折断成两段。</li>
		<li>将毛细玻璃管的一端缓慢滚入本生灯火焰中。使用解剖显微镜和光纤光源（见材料表）定期检查尖端的尺寸、光滑度和对称性。 
		注：对于头宽在 20 至 30 mm 之间的龟，动眼神经（nIII）的最佳匹配内径通常为 0.4 至 0.8 mm，滑车神经（nIV）为 0.3 至 0.6 mm，外展神经（nVI）为 0.2 至 0.4 mm。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>清洁并整理用于解剖的咬骨钳、钝性分离探针、显微剪、精细镊子、弯头镊子以及带刀片的手术刀柄（见材料表）。 
	注：器械的灭菌为可选步骤。</li>
</ol>
2. 麻醉与安乐死
<ol>
	<li>将龟放入冰桶中 60 分钟以进行低温麻醉。</li>
	<li>使用小型动物断头器（见材料表）对龟实施断头处死。
	<ol>
		<li>用小型称量勺轻轻撬开动物的下颌，以便插入钩子并旋转至固定在上颌尖端下方。</li>
		<li>施加稳定压力，将动物头部拉出断头器，迅速完成断头。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将龟头置于解剖皿中。准备足量的龟林格氏液用于组织灌注，并用 95/5% O2/CO2 气体混合物对溶液进行氧合（见材料表）。</li>
	<li>通过在解剖皿外周放置冰块，将组织维持在 4 °C。</li>
</ol>
3. 解剖
<ol>
	<li>使用带有光纤光源的解剖显微镜进行解剖操作。</li>
	<li>移除下颌。将钝性解剖探针经口插入，以更方便地操作头部。用手术刀切断齿骨与颅骨之间的关节。用咬骨钳将下颌从颅骨上拉离。用咬骨钳剥离附着于颅骨背侧和外侧区域的皮肤和肌肉。</li>
	<li>移除脊柱。
	<ol>
		<li>在颅骨尾端识别脊柱。将脊柱向腹侧弯曲，以暴露脊髓。使用显微剪剪断脊髓。使用咬骨钳向尾侧牵拉，将脊柱及其他组织从颅骨中移除。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>切断脑神经后，将脑组织从颅骨中取出。
	<ol>
		<li>从枕骨大孔开始，使用咬骨钳在颅骨背侧做两个切口。切口应浅层进行，避免损伤下方的脑组织。</li>
		<li>使用咬骨钳小心地剥离颅骨背侧部分。使用显微剪去除脑膜，以暴露其余脑组织。持续去除脑膜直至可辨认位于前颅腔内的嗅球（见图1A）。根据需要，持续用龟林格液冲洗脑组织。</li>
		<li>使用弯头镊子轻柔地向尾侧牵拉大脑，使脑神经产生轻微张力。用弯头镊子小心剪除并移除嗅球和大脑。</li>
		<li>使用显微剪轻柔地将中脑推向中线，以暴露脑神经；动眼神经（nIII）位于滑车神经（nIV）前方约0.6 mm处，nIV的直径略小于nIII。在脑神经与中脑连接处剪断nIII和nIV（见图1B）。在另一侧重复此操作。</li>
		<li>使用显微剪剪断左右两侧视神经（nII）。然后将脑干向一侧倾斜，观察展神经（nVI）从脑桥与延髓交界处附近的腹侧表面发出（见图1C）；nVI直径较小，约为0.3 mm。剪断左右两侧的nVI。</li>
		<li>使用精细镊子和显微剪将脑干的剩余部分从龟体内移除。当颅腔完全清空后，检查颅腔底部，辨认nIII、nIV和nVI。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用精细镊子和显微剪移除上下眼睑。</li>
</ol>
4. 眼球运动的校准
<ol>
	<li>使用刚性实验台（参见 材料列表) 以支撑云台及其他仪器的安装。将龟的头部放入云台卡盘中，使头背部与地平线平行，可借助置于颅骨上的小型气泡水平仪进行判断。大致将其中一只眼睛置于云台水平与垂直旋转轴的中心位置。</li>
	<li>将配备有红外发光二极管（LED）的红外相机（属于基于视频的眼动追踪系统的一部分）放置于 材料表），观察距离约为12 cm，从龟眼算起。
	<ol>
		<li>将相机置于眼睛视线方向上方45度角处。当观察相机镜头时，LED应位于11点钟位置。沿眼睛的光轴方向使LED居中。从眼睛上方观察时，相机将略微偏离光轴。</li>
		<li>调整相机与眼睛的距离，使眼球尽可能充满相机视野。确保眼睛的内外眦位于水平视野的边缘。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将摄像头连接至基于视频的眼动追踪系统以处理数据。将信号分路至DVD录像机以记录原始视频。调节摄像头焦距，获得清晰的眼部图像。使用云台提供的三个线性调节维度（x、y、z），仔细微调眼部位置，使其位于摄像头视野中心。</li>
	<li>使用基于视频的眼动追踪系统配套程序，通过适当设置阈值和对比度来检测暗瞳孔。
	<ol>
		<li>使用鼠标，单击 &#34;视频&#34; 菜单和下方 &#34;模式&#34; 选择 &#34;高精度&#34; 以30 Hz的采样率（分辨率为640像素 × 480行）采集图像。同样在 &#34;视频&#34;，选择 &#34;暗瞳&#34; 用于 &#34;瞳孔类型&#34; 和 &#34;椭圆（旋转椭圆）&#34; 用于 &#34;瞳孔分割方法&#34;.</li>
		<li>在 &#34;眼动相机&#34; 窗口，单击 &#34;瞳孔搜索区域调整&#34; 图标（中间带有一个点的小竖直矩形）。使用鼠标拖拽出一个矩形框，限定瞳孔周围的区域，避免包含可能被误认为瞳孔的暗区。</li>
		<li>在 &#34;对照组&#34; 窗口，确认勾选以下选项框 &#34;自动成像&#34; 和 &#34;正向锁定阈值追踪&#34; 进行检查。点击 &#34;自动阈值&#34; 优化扫描密度，这将在暗色瞳孔上显示为绿色点。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将基于视频的眼动追踪程序的视频显示校准至云台在其水平轴上±12.5°、垂直轴上±10°范围内的旋转。
	<ol>
		<li>在 &#34;对照组&#34; 窗口，单击 &#34;显示&#34;. 勾选下方两个复选框 &#34;注视&#34; 和 &#34;刺激&#34; 用于 &#34;注视点&#34;, &#34;校准区域&#34;，以及 &#34;几何网格&#34;. 勾选下方复选框后 &#34;几何网格&#34;，将弹出一个窗口并显示， &#34;在显示几何网格之前，必须先测量刺激显示的几何参数。您希望现在进行测量吗？&#34; 选择 &#34;Y&#34; 是</li>
		<li>使用鼠标，单击 &#34;Windows&#34; 菜单并选择 &#34;刺激&#34;。该 &#34;刺激&#34; 窗口将打开，显示一条垂直线和一条水平线在屏幕中心相交。将线段长度测量至最接近的毫米。按下 &#34;退出&#34; 在键盘上按以退出 &#34;刺激&#34; 窗口。</li>
		<li>使用鼠标，单击 &#34;刺激&#34; 菜单并选择 &#34;几何设置&#34;输入刚刚测量的线段长度。调整观察距离，使水平线每条线对应的角度为25°，垂直线为20°。点击 &#34;储存&#34; 按钮并关闭窗口。</li>
		<li>在 &#34;EyeSpace&#34; 窗口中，选择校准次数 &#34;数据点&#34; 是 &#34;9&#34;以海龟的眼睛为中心，点击中心数据点，然后点击 &#34;重新呈现&#34; 按钮 
		注意： &#34;刺激&#34; 窗口将打开， &#34;准备就绪&#34; 将出现在屏幕中央。一个方框会出现在中心位置，随后消失。在其消失后， &#34;刺激&#34; 窗口将关闭。此时中心位置应已完成校准。</li>
		<li>通过将云台向右/左旋转 +12.5°/-12.5°，以及向上/下旋转 +10°/-10°，重复上述步骤以校准其余数据点。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为校准扭转旋转，使用基于视频的眼动追踪程序提供的模板拟合算法。该算法根据虹膜标记设定零位位置，并在标记相对于瞳孔质心发生偏移时计算旋转角度。
	<ol>
		<li>使用鼠标指针，单击 &#34;Windows&#34; 菜单并选择 &#34;扭转&#34;. 单击 &#34;开始&#34; 按钮在 &#34;扭转&#34; 窗。在 &#34;眼动相机&#34; 窗口中，眼睛图像上方将出现一个弧形。</li>
		<li>调整弧线的半径、角度和长度，使用滑块定位到虹膜中存在不规则标记的位置。勾选相应的复选框以 &#34;实时图形&#34; 和 &#34;调节后自动设置&#34;如有必要，在控制窗口中调整亮度和对比度，并重新对暗色瞳孔进行阈值设定（参见步骤4）。单击 &#34;设置模板&#34; 按钮</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将直尺置于与瞳孔相同的焦平面，记录相机完整视野的宽度。该数值将用于后续确定瞳孔的实际宽度。</li>
</ol>
5. 定位颅神经上的吸引电极以诱发眼球运动
<ol>
	<li>将一根针状参考电极小心地插入头部残留的结缔组织或肌肉组织中。</li>
	<li>使用安装在悬臂上的显微操作器和解剖显微镜，将吸吮电极（参见材料表）放置在颅神经上。使用光纤光源观察并引导电极的定位。
	<ol>
		<li>根据神经的大小选择匹配的毛细玻璃尖端。需通过反复试验，使玻璃尖端与神经直径达到最佳贴合（参见步骤1.2中的尺寸建议）。将玻璃尖端安装到吸吮电极上。用任氏液（Ringer's solution）填充吸吮电极，并调节注射器内的液体体积至其容量的一半左右。</li>
		<li>使用显微操作器小心移动电极的玻璃尖端，使其位于所选神经的切断端上方。确保任氏液充满颅腔，且尖端位于液面以下。如有必要，可使用油灰封堵任氏液从颅腔泄漏的位置。</li>
		<li>向后拉动注射器的活塞。 
		注意：真空将神经吸入毛细玻璃尖端的末端。若神经能稳定停留在尖端内，且无需施加额外负压，即表明贴合良好。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 颅神经刺激与眼动分析
<ol>
	<li>使用通用神经/肌肉刺激器并配备电流隔离装置（参见 材料表通过吸附电极刺激颅神经。
	<ol>
		<li>将吸电极通过导线连接至电流隔离装置。将针状参考电极的导线连接至隔离装置的接地端。</li>
		<li>使用刺激器和隔离装置上的旋钮和开关选择电流参数。电流范围为1至100 µA，频率为10至400 Hz。采用持续时间为100、500或1,000 ms的脉冲串，每个脉冲时长为1 ms或2 ms。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>记录刺激的时间。 
	注意：晶体管-晶体管逻辑（TTL）脉冲与刺激器输出的电流同步，并通过电缆实时传输至基于视频的眼动追踪系统的输入通道。该通信由随视频眼动追踪软件提供的软件模块控制。
	<ol>
		<li>为了观察电流刺激的时间及其对眼动的影响，请点击 &#34;PenPlots&#34; 菜单。选择 &#34;X轴注视位置&#34;, &#34;Y 眼动位置&#34;, &#34;扭转&#34;，以及 &#34;瞳孔宽度&#34; 显示X轴和Y轴眼动位置、旋转角度及瞳孔宽度的实时原始数据图。同时选择 &#34;秒 &amp;#38; 标记物&#34; 从 &#34;PenPlots&#34; 菜单显示一个带有刻度标记的时间图，刻度标记以1秒为间隔出现。 
		注意：大写字母 &#34;T&#34; 将出现标记，指示TTL脉冲的起始，该起始与电流施加同时发生。</li>
		<li>要存储电流诱发的眼动数据，请点击 &#34;文件&#34; 菜单并选择 &#34;新建数据文件&#34; 在……下方 &#34;数据&#34;输入文件名并按压 &#34;输入&#34;. 可通过组合键命令暂停并重新启动数据保存， &#34;Ctrl&#34; + &#34;p&#34;实验会话完成后，选择 &#34;关闭数据文件&#34; 关闭 &#34;文件&#34; 菜单下方 &#34;数据&#34;.</li>
		<li>为便于记录所施加电流的类型，单击 &#34;Windows&#34; 菜单并选择 &#34;数据板&#34;。该 &#34;键盘/数据标记器&#34; 窗口将出现。点击字母或数字以识别当前正在向神经施加的刺激参数。 
		注意：例如， &#34;X&#34; 可代表 10 µA。点击 &#34;X&#34; 实时记录其进入数据文件的信息 事后检验 分析。它也出现在 &#34;PenPlot&#34; 用于 &#34;秒 &amp;#38; 标记物&#34; 用于持续观察。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分析眼动仪系统的数据。
	<ol>
		<li>将保存的数据文件（文本分隔格式）导入所选的电子表格程序中，以整理数据并进行统计分析。
		<ol>
			<li>将文件中存储的瞳孔宽度值转换为以毫米为单位的实际尺寸。</li>
			<li>将X轴和Y轴的眼球位置及扭转值转换为度（degree）单位，并采用描述眼球运动的常规方式：即旋转的正方向为内旋（intorsion）、上转（elevation）和内收（adduction）；旋转的负方向为外旋（extorsion）、下转（depression）和外展（abduction）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将标题信息复制到新的工作表中。标题信息包括屏幕尺寸（宽度和高度）和观看距离。在标题信息下方，将跟随以 30 Hz 采样率收集的八列数据。</li>
		<li>返回包含原始数据的工作表。执行以下操作 &#34;查找&#34; 用于 &#34;X&#34; 在最后一列，标题为 &#34;标记物&#34; 确定以10 µA电流施加刺激的位置。找出发生率 &#34;T&#34;，标记当前刺激的开始。复制刺激开始前发生的15行（0.5秒）数据 &#34;T&#34; 以及之后的90帧 &#34;T&#34; (3.0 s) 即，总计 3.5 秒。将数据粘贴到新工作表中标题信息的下方。</li>
		<li>在之后插入一个空白列 &#34;瞳孔宽度&#34;在空白列中，转换为以毫米为单位的校准尺寸： 
		瞳孔水平直径 = &#34;瞳孔宽度&#34; × 相机视图宽度的尺寸</li>
		<li>在两者之后各插入两列空白列 &#34;X_Gaze&#34; 和 &#34;Y_Gaze&#34;将坐标位置归一化至显示屏幕的尺寸：屏幕左上角为 (0, 0)，右下角为 (1, 1)。在第一个空白列中，将位置转换为以屏幕中心为 (0, 0) 的坐标系。同时包含转换为屏幕实际毫米尺寸的计算： 
		X =（0.5 × 宽度）&#160; – (&#34;X_Gaze&#34; × 宽度）； Y = (0.5 × 身高) – (&#34;Y_Gaze&#34; × 高度） 
		注意：操作顺序适用于左眼。对于右眼，需将顺序反转，以符合外展为负、内收为正的常规约定。</li>
		<li>在第二列中，使用三角函数转换为旋转角度（°）： 
		水平旋转 = arctan (X/观看距离）；垂直旋转 = arctan（Y/观看距离</li>
		<li>扭转度数已以度为单位显示，但为了符合内旋为正的惯例，若测量左眼，则需乘以 -1；对于右眼，无需乘法操作。程序将顺时针旋转编码为正值。</li>
		<li>绘制瞳孔直径和旋转角度随时间变化的曲线。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

关键步骤：
本方案中的关键步骤如下：1）解剖过程以及采取措施保持横断神经的活性；2）使用吸电极匹配颅神经的尺寸，以获得一致的反应；3）将头部放置于万向支架中，以充分校准眼球的旋转。
问题排查：
解剖操作可能具有挑战性，但经过数次练习后，操作步骤应会变得相对简单直接。如果神经表现出无反应，最可能的原因是解剖失败。在移除脑组织时，切割神经过程中应尽量减少对其施加的牵拉和压力。应尽可能避免使用金属手术器械接触神经；若问题持续存在，可改用玻璃钩和塑料镊子替代金属工具34。尽管龟类组织能够耐受不同水平的氧气，但仍建议使用新配制并以95/5% O2/CO2气体饱和且已冷却的龟氏任氏液；不过这一点相对不那么关键。毕竟，使用该实验制备物的优势在于其在不同氧浓度和温度波动条件下均具有良好的存活能力2,3</...

使用红耳滑龟进行电生理实验的原理：
红耳滑龟（Trachemys scripta elegans）被认为是全球最具危害性的入侵物种之一1，其出现可指示生态系统可能已出现问题。红耳滑龟之所以如此成功，其原因尚不完全清楚，但部分可能归因于其耐受性强的生理特性，以及拥有可在缺氧条件下存活的神经组织2,3,4。利用该物种进行实验不会威胁其种群数量，且只需较少操作，电生理制备样本即可维持较长时间的活性，最长可达18小时5,6。这一优势类似于使用无脊椎动物（如螯虾）7进行实验的好处，后者同样具备耐受低氧环境的能力8。
眼动测量技术：
利用非人灵长类动物测量前视性动物眼动的方法已得到充分发展9。眼睛在眼眶内围绕三个轴旋转：水平轴、垂直轴和扭转轴。磁搜索线圈法通常被认为是最可靠的旋转测量方法，但该方法具有侵入性，需要将微小线圈植入动物的巩膜中10,11。基于视频的系统也可用于测量眼动旋转，其优势在于非侵入性。随着摄像设备的改进以及创新的图像处理技术的发展，视频系统功能不断提升，已成为一种颇具吸引力的替代方案12,13,14。
针对非哺乳动物眼动测量所开发的技术重要性远不及前者。现有方法要么分辨率较低，要么仅能描述部分眼球旋转15,16,17,18。这种发展滞后在一定程度上可归因于训练非哺乳动物追踪视觉目标的困难。尽管红耳滑龟的眼动已得到较为广泛的研究19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30，但由于训练动物追踪目标存在挑战，其眼动的精确运动学特征仍不清楚。
红耳滑龟通常被认为是侧眼型脊椎动物，但由于它们能够将头部完全缩入壳内31，甲壳会显著遮挡侧方视觉视野32。其结果是，它们的视线被迫朝向前方，行为上更类似于前眼型哺乳动物。因此，将其作为研究眼动测量方法的模型，也提供了一个独特的进化视角。
本工作中描述的方案使用了一种 体外 分离头部制备以鉴定红耳滑龟眼球运动的运动学。将脑组织从颅骨中解剖取出，保留完整的脑神经。头部被固定于万向支架中，用于校准眼球运动，并通过电刺激支配眼肌的脑神经来诱发反应。眼球旋转的测量采用基于视频的系统，结合软件算法，追踪深色瞳孔及虹膜上的标记。该制备方法为测量眼外肌（即水平、垂直和扭转旋转32 和眼内（即瞳孔变化33 运动。
分析传出神经通路的模型系统：
更普遍而言，该方法为研究者提供了研究传出神经信号如何在肌肉处于松弛状态且缺乏大脑整合的感觉信息输入时驱动眼球运动的机会32,33。因此，可以在一个仅依赖传出神经通路（即神经信号离开脑部并传递至肌肉的通路）处理的模型系统中，对眼球运动学进行考察。

<table><tbody><tr><td>红耳滑龟</td><td>Kons Scientific</td><td>&lt;em&gt;Trachemys scripta elegans&lt;/em&gt;</td><td>体型较大（甲壳长度 15–20 cm）</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich 公司有限责任公司</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma-Aldrich 公司有限责任公司</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Sigma-Aldrich 公司有限责任公司</td><td>M7304</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma-Aldrich 公司有限责任公司</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich 公司有限责任公司</td><td>C5767</td><td></td></tr><tr><td>浓盐酸</td><td>Sigma-Aldrich 公司有限责任公司</td><td>H7020</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Sigma-Aldrich 公司有限责任公司</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>pH计</td><td>奥克顿</td><td>pH 6+</td><td></td></tr><tr><td>负压刺激电极</td><td>A-M Systems</td><td>573000</td><td>双极吸引电极。注意 573000 已被 573050 取代。</td></tr><tr><td>毛细玻璃管</td><td>A-M 系统</td><td>626000</td><td>无内丝单通道硼硅酸盐毛细管玻璃，长10 cm，外径1.0 mm，内径0.50 mm</td></tr><tr><td>替代性负压刺激电极</td><td>A-M Systems</td><td>573050</td><td>双极吸电极。需要较大直径的毛细玻璃管：627000，外径1.2 mm，内径0.68 mm</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Lieca</td><td>GZ7</td><td>放大倍数范围，10倍 &amp;ndash; 70x</td></tr><tr><td>光纤光源</td><td>Amscope</td><td>HL250-A</td><td>150W 光纤光学显微镜照明光源箱</td></tr><tr><td>咬骨钳</td><td>卡罗来纳生物供应公司</td><td>625654</td><td>不锈钢，直弹簧，5.25&quot;</td></tr><tr><td>钝性解剖探针</td><td>卡罗来纳生物供应公司</td><td>627405</td><td>Huber 鞘管探针，双头探针和定位器，6&quot;</td></tr><tr><td>显微剪刀</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td>623555</td><td>虹膜显微解剖剪，不锈钢，0.5&quot; 刀片，4.75&quot; 长</td></tr><tr><td>精细镊子</td><td>Sigma-Aldrich 公司有限责任公司</td><td>F6521</td><td>珠宝镊，Dumont No. 5，inox合金，4.25&quot;</td></tr><tr><td>弯头镊子</td><td>Sigma-Aldrich 公司有限责任公司</td><td>Z168696</td><td>中号尖头弯镊，不锈钢，4&quot;</td></tr><tr><td>手术刀柄</td><td>Sigma-Aldrich 公司有限责任公司</td><td>S2896</td><td>手术刀柄，3号，不锈钢</td></tr><tr><td>手术刀片</td><td>Sigma-Aldrich 公司有限责任公司</td><td>S2771</td><td>11号手术刀片，钢制</td></tr><tr><td>断头台</td><td>哈佛仪器公司</td><td>73-1918</td><td>小型剪刀式切片器，型号 7575</td></tr><tr><td>刮勺</td><td>Sigma</td><td>Z648299</td><td>微型药匙和刮勺称量套装。使用小型刮勺：5.9&amp;rdquo; 长 x 0.07&amp;rdquo; 直径为0.17的方形端手柄&amp;rdquo; ×1.3&amp;rdquo; 长，另一端圆形：0.17&amp;rdquo; × 1.27&amp;rdquo; 长</td></tr><tr><td>钩</td><td>自动区</td><td>98069</td><td>SureBilt 挂钩和探针套装。使用磨床将挂钩的尖锐端磨钝，以防止对动物口腔造成伤害。</td></tr><tr><td>95/5% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Airgas, Inc.</td><td>X02OX95C2003102</td><td>5% 二氧化碳余量为氧气的认证标准气体混合物，200 型气瓶，CGA-296 接头</td></tr><tr><td>调节因子</td><td>Airgas公司</td><td>Y11244D296-AG</td><td>单级黄铜0-100 psi分析气瓶减压器，CGA-296接口，带针型出口。使用黄铜可调空气管道阀，从3/8英寸 переход&quot;，内径，连接至调节器的3/16英寸乙烯基输气管&quot;，内径，通向气石或玻璃巴斯德吸管的气路连接。</td></tr><tr><td>可调式通气管道阀门</td><td>福斯特与史密斯医生</td><td>CD-12061</td><td>黄铜阀门</td></tr><tr><td>刚性台面</td><td>未知</td><td>未知</td><td>将高压灭菌锅门平放在坚固的桌面上。九个 5&quot; 直径网球使桌面顶部表面与振动隔离。</td></tr><tr><td>5&quot; 网球</td><td>Petco 动物用品公司</td><td>712868</td><td>Petco 超大宠物网球：球体未切开，固定于灭菌器门下方的集成框架内。</td></tr><tr><td>替代式振动隔离台</td><td>Newport Corporation</td><td>INT1-36-6-N</td><td>刚性振动控制系统，完整性1：表面尺寸，3英尺 x 6英尺</td></tr><tr><td>万向节</td><td>ISI，International Scientific Instruments, Inc.</td><td>SUPER III-A 扫描电子显微镜载物台</td><td>五轴同心样品台：X、Y 和 Z 轴线性移动， &amp;plusmn;20 毫米，0.1 毫米精度；旋转，垂直方向 &amp;plusmn;10&amp;deg;和水平的 &amp;plusmn;12.5&amp;deg;，含1.25&amp;deg; 精确度。注意：来自已停用的仪器。</td></tr><tr><td>万向节夹头</td><td>未知</td><td>未知</td><td>将一个来源不明的旧切片机的标本夹改装，以适配扫描电镜载物台的样品杆</td></tr><tr><td>替代云台</td><td>ThorLabs, Inc.</td><td>GN2/M 与 MBT602/M</td><td>双轴测角仪（GN2/M）安装在带拇指旋钮调节器的三轴微调平台（MBT602/M）上：设计一个卡盘以固定龟头，使眼睛位于测角仪顶面以上12.7 mm处（至旋转点的距离）</td></tr><tr><td>基于视频的眼动追踪系统</td><td>Arrington Research, Inc.</td><td>ViewPoint 眼动仪，PC-60</td><td>追踪方法：基于暗瞳法的红外视频；黑白相机（货号 BC02）：30 Hz，640 × 480；系统要求：Windows 2000、XP、7、8、8.1、10；可视范围：水平 ±44°&amp;deg;；垂直方向 ±20&amp;deg;；准确度约 0.5&amp;deg;；空间分辨率约0.15&amp;deg;瞳孔尺寸分辨率约0.03 mm；眼动数据：注视点X、Y坐标，瞳孔高度和宽度，眼动扭转角，时间增量，总时间，以及感兴趣区域（ROI）；实时通信（项目0022）：4通道模拟输出，配备八个TTL输入通道，用于在数据文件中标记代码</td></tr><tr><td>多位置磁性底座</td><td>Harbor Freight Tools</td><td>匹兹堡，货号 #5645</td><td>磁力架最高可达12&quot; 可产生45磅的磁性拉力，用于固定相机位置。在杆的末端加工有机螺纹孔，用于安装相机。</td></tr><tr><td>显微操作仪</td><td>Kopf</td><td>900</td><td>用于吸电极安装的五轴操控：X、Y、Z 三轴线性移动，双轴旋转</td></tr><tr><td>吊臂上的解剖显微镜</td><td>Lieca</td><td>GZ6</td><td>放大倍数范围，6.7倍 &amp;ndash; 40x</td></tr><tr><td>神经/肌肉刺激器</td><td>Astro-Med Grass Telefactor</td><td>Grass S88</td><td>双脉冲电压刺激器：具有两个输出通道，可独立运行或同步操作，以产生非隔离的恒定电压脉冲（10 mV 至 150 V）。脉冲可为单次（10 &amp;mu;秒至10秒）、重复性（0.01 Hz至1 kHz）和脉冲串（1毫秒至10秒）模式，并可与TTL输入和输出同步。通过DB25连接器的输出通道将TTL信号发送至ViewPoint眼动仪的TTL输入通道。注意：Astro-Med Grass Telefactor公司已停止营业。</td></tr><tr><td>当前分离装置</td><td>Astro-Med Grass Telefactor</td><td>PSIU6</td><td>当前刺激隔离单元：可实现S88向标本安全输送恒定电流。PSIU6通过BNC电缆连接至S88的一个输出通道。PSIU6上的倍率开关使S88能够产生范围从0.1起的多种电流强度 &amp;micro;A 至 15 mA。</td></tr><tr><td>带隔离功能的替代性神经/肌肉刺激器</td><td>A-M Systems</td><td>2100</td><td>独立脉冲刺激器：该设备内置隔离器，可产生恒定电流。</td></tr></tbody></table>

眼动运动学测量 体外 刺激龟类的脑神经

Ocular Kinematics Measured by In Vitro Stimulation of the Cranial Nerves in the Turtle

动物被安乐死后，其组织会开始死亡。龟类具有优势，因为其组织存活时间更长，尤其是与恒温脊椎动物相比。因此，可以在龟类上进行较长时间的体外（in vitro）实验，以研究神经信号及其对靶向行为的控制。我们采用离体头部制备方法，测量了龟类眼球运动的运动学特征，以及由脑神经传递的电信号对这些运动的调节作用。在将脑组织从颅骨中移除而保留脑神经完整的前提下，将解剖后的头部置于万向支架中，以校准眼球运动。将玻璃电极连接至脑神经（动眼神经、滑车神经和外展神经），并通过电流刺激诱发眼球运动。我们使用红外视频追踪系统监测眼球运动，并量化眼球的旋转角度。采用不同幅度、频率和脉冲串持续时间的电流脉冲，观察其对反应的影响。由于该制备方法已将头部与脑部分离，因此可单独研究支配肌肉靶点的传出通路，从而在排除中枢处理的感觉信息干扰的情况下，探究神经信号传递机制。

图1 显示了描述解剖过程的视频截图。这些图像提供了在从脑部切断之前神经的典型位置。
<img alt="显示嗅球、大脑、视顶盖和延髓标记的鱼类脑解剖示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56864/56864fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：从解剖视频中截取的图像静帧，显示视神经（nII）、动眼神经（nIII）、滑车神经（nIV）和外展神经（nVI）的位置。（A）去除脑膜后脑部各标记区域的图像。白色比例尺 = 10 mm。（B）显示nII、nIII和nIV在中脑右侧连接位置的图像（去除嗅球和大脑后）。（C）显示n...

本方案描述了如何使用一种 体外 分离的龟头制备用于测量其眼球运动的运动学。在从颅骨中移除脑组织后，可通过电流刺激颅神经，以量化眼球的旋转及瞳孔大小的变化。

动物安乐死后，其组织会开始死亡。龟类具有优势，因为其组织存活时间较长，尤其是当……

本电生理实验方案的总体目标是利用离体头部制备方法，实现对红耳滑龟眼球运动的运动学测量。该方法有助于解答眼动研究领域中的关键问题，例如龟类视觉系统的演化过程。该技术的主要优势在于无需训练动物追踪目标，并且采用万向支架对其眼球运动进行校准。演示该技术的是我实验室的本科生 Steven Nesbit。将龟头置于解剖皿中开始操作。准备足量的龟林格液以用于冲洗组织。将培养皿外部周围放置冰块，使组织保持在四摄氏度。将钝头解剖探针从口腔插入，以更方便地操作头部。然后，在解剖显微镜下操作，用手术刀切断齿骨与颅骨之间的关节连接处。接下来，使用咬骨钳将下颌从颅骨上拉开。然后，从颅骨背侧和外侧区域的附着点处剥离皮肤和肌肉。在颅骨的枕骨大孔端确定脊柱位置后，将脊柱向腹侧弯曲以暴露脊髓，并使用显微剪剪断脊髓。使用咬骨钳向尾侧牵拉，以去除颅骨上的脊柱及其他组织。随后，从枕骨大孔处开始，在颅骨背侧做两个浅表切口，小心剥离背侧颅骨。使用显微剪去除脑膜，暴露其余脑组织。去除足够的脑膜，以便在颅腔前部辨认嗅球。根据需要继续用龟林格液灌注脑组织。接着，使用弯头镊子轻轻向后牵拉大脑，使脑神经产生轻微张力。使用弯头镊子小心剪除并移除嗅球和大脑半球。然后用显微剪刀轻柔地将中脑推向中线，以暴露脑神经。在脑神经四前方可见脑神经三。第四对神经的直径略小于第三对神经。然后切断左侧和右侧的视神经，即第二对脑神经。在第三对和第四对神经与中脑相连处将其切断。在另一侧重复此操作。将脑干向一侧倾斜，观察从脑桥与延髓交界处附近的腹侧表面发出的第Ⅵ对脑神经，即外展神经。在左侧和右侧分别切断第Ⅵ对脑神经。使用精细镊子和显微剪刀从头部去除脑干的剩余部分。颅腔清空后，检查颅腔底部，并辨认第三、第四和第六对脑神经。最后，用精细镊子和显微剪刀去除上眼睑和下眼睑。将龟的头部放入万向夹具中，然后使用小型气泡水平仪检查头部背侧表面是否与水平面平行。将其中一只眼睛置于万向节水平和垂直旋转的中心位置。将红外相机置于眼睛视线方向上方45度角处。当观察相机镜头时，红外LED应位于11点钟位置，以使LED沿眼睛的光轴居中。调整相机与眼睛之间的距离，使眼球尽可能充满相机视野。确保眼睛的角位于水平视野的边缘。调节相机焦距，以获得清晰的眼睛图像。然后利用云台提供的三轴线性调节功能，微调眼睛位置，使其位于相机视野的中心。使用基于视频的眼动追踪系统配套程序，通过适当设置阈值和对比度来检测瞳孔。使用鼠标点击“Video”菜单，在“Mode”下选择“High Precision”，以每秒30帧的采样率捕获图像，分辨率为640像素 × 480行。同时，在“Video”下打开“Pupil Type”，选择“Dark Pupil”以及“Ellipse, rotated ellipse”作为瞳孔分割方法。在 EyeCamera 窗口中，单击瞳孔搜索区域调整图标。使用鼠标拖动绘制一个矩形，限定在瞳孔周围的区域，避开可能与瞳孔混淆的暗区。然后，在 Controls 窗口中，确认已勾选 AutoImage 和 Positive Lock Threshold Tracking 对应的复选框。单击“AutoThreshold”以优化扫描密度，扫描结果将以绿色点的形式显示在暗色瞳孔上。根据文本所述，将基于视频的眼动追踪程序的视频显示校准至云台的旋转，并校准扭转旋转。将一把直尺置于与瞳孔相同的焦平面内，记录相机完整视野的宽度。放置电极时，首先将针状参考电极插入头部残留的结缔组织或肌肉组织中。根据待刺激神经的大小，选择合适尺寸的火焰抛光毛细玻璃尖端，并将其套在吸吮电极上。用任氏液填充吸吮电极，并调节注射器内的液体体积至其容量的一半左右。确保脑神经清晰可见。然后，在通过支架固定的解剖显微镜观察的同时，使用显微操作器小心地将电极的玻璃尖端移至所选神经切断端的上方，并位于充满颅腔的任氏液液面以下。向后拉动注射器的活塞。真空会将神经吸入毛细管尖端的末端。使用电缆将吸电极连接到电流隔离装置。将针状参考电极的导线连接到隔离装置的接地端。 使用刺激器和隔离装置上的旋钮和开关输入刺激参数。电流范围为1至100微安，频率为10至400赫兹。脉冲时长为1或2毫秒，脉冲串持续时间为100、500、1000毫秒。为了可视化电流刺激的时间及其对眼动的影响，请点击 PenPlots 菜单。选择 X 注视位置、Y 注视位置、扭转和瞳孔宽度，以显示实时的原始数据图，包括视线的 x 和 y 坐标位置、扭转角度以及瞳孔宽度。此外，从 PenPlots 菜单中选择秒数和标记，以显示带有刻度标记的时间图，这些刻度标记以每秒为间隔出现。为了便于记录所施加电流的类型，请点击“Windows”菜单并选择“DataPad”。此时将出现“KeyPad”和“DataMarker”窗口。点击字母或数字以标识正在向神经施加的电流刺激参数，并按照方案文本中所述方法分析数据。该图显示了一个制备样本中六次刺激的平均瞳孔直径，虚线表示标准差。x 轴上的矩形波形表示一毫秒脉冲、100 赫兹串脉冲的起始与终止，脉冲幅度为 50 微安。该示意图显示了刺激前虹膜在眼球中的方位。此图像显示了一个代表性试验在刺激前的静态帧。此图像显示了刺激过程中的眼睛。此处，显示的是刺激后的眼睛。在进行该操作时，重要的是在解剖过程中留出充足时间，使吸电极的大小与每条脑神经相匹配，并将头部适当地放置在万向架中。完成这些步骤后，可采用其他方法，如测试不同温度或施加药理学试剂（包括镇痛剂），以回答更多问题，例如这些因素如何影响眼球运动及神经组织的存活能力。

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

体外刺激对龟脑神经的运动测量

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学习使用体外离体头部制备技术测量红耳滑龟眼球运动的运动学特征。该方法通过刺激颅神经记录眼动和瞳孔变化，无需行为训练即可精确量化眼动参数，为眼动控制与视觉进化研究提供可靠电生理学手段。

眼动运动学测量体外刺激龟类的脑神经

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