4.10: 光度法蛋白的测定

测定样品中蛋白质的浓度是许多生化分析的基本步骤。光度测定可以用小样品量进行。样品中含有的吸光物质越多，通过它的光就越少。这提供了吸收物质的定量测量。这些概念对科学来说是如此基础，以至于介绍其中两种技术的文章出现在有史以来引用次数最多的三篇论文中。本视频将展示一些最常见的光度蛋白质测定技术背后的概念、它们的执行方式以及如何分析收集的数据。

光度法蛋白质测定基于浓度和光吸收性之间的关系。这被称为比尔-朗伯定律，该定律指出，光吸收物质的浓度与其吸光度成正比。

该原理是所有光度蛋白质测定方法的基础。

对于直接吸收分析，测量未改变蛋白质样品的吸光度值。由于色氨酸和酪氨酸残基具有芳香族侧链，因此在 280 nm 波长处具有最高的吸光度读数。

然而，这些氨基酸是蛋白质中最常见的两种氨基酸，在每种蛋白质中的含量不同，因此每次测定都是独一无二的。为了克服这一限制，开发了更复杂的分析方法（不依赖于这些氨基酸）。

一个例子是 Bradford 测定法，其中将有色染料添加到样品中。这种被称为考马斯蓝的染料按比例反应——存在的蛋白质越多，与染料的结合事件就越多。

然后，通过测量结合的考马斯蓝染料的吸光度来确定蛋白质浓度，该染料吸收 594 nm 处的光。然而，Bradford 分析在短浓度范围内是线性的，因此通常需要在分析前进行稀释。

Lowry 方法结合了 Biuret 试剂（一种与肽键反应的铜离子的碱性溶液）和 Folin-Cioc？lteu 试剂（氧化芳香族蛋白质残基）。样品的颜色变化与蛋白质浓度成正比。

还原的 Folin 试剂的吸光度可在 750 nm 处测定。与直接吸收一样，每种蛋白质都有独特的反应，必须针对目标蛋白质进行校准。现在我们已经回顾了一些最常见分析背后的基本原理，让我们看看如何进行直接吸收和 Bradford 分析。

要开始直接吸收分析，分光光度计用空白校准以确定零吸光度。制备标准溶液，用于创建校准曲线。然后，将第一个标准品的等分试样加入比色皿中，并放入分光光度计中。

然后记录 280 nm 处的吸光度值。对每个标准品重复此过程，每次运行使用干净的比色皿。完成后，通过绘制吸光度与浓度的关系来创建校准曲线。这条线的斜率是摩尔衰减系数，它与吸光度与浓度有关。

接下来，将未知样品添加到比色皿中，并记录吸光度值。由于不同光度测定方法的数据分析相似，我们将在查看 Bradford 测定之后介绍这一点。

在这里，Bradford 蛋白测定是在 96 孔板上使用 BSA 标准品进行的。首先，准备 BSA 储备溶液。

用去离子水稀释未知溶液，以确保浓度在检测范围内。根据试剂盒的不同，考马斯染料可能还需要稀释。然后，通过将 BSA 标准品添加到 96 孔板中来设置校准曲线。

添加去离子水以达到所需的浓度，以生成标准曲线。应将未知样品一式三份添加到板中，以确保进行准确测量。接下来将考马斯染料加入每个孔中，与移液管混合。

将去离子水作为空白加入空井中，以测量吸光度。等待染料结合 5 分钟后，在读板器中在 590 nm 处测量吸光度。

现在我们已经进行了一些分析，让我们看看如何分析数据。每种光度蛋白质测定方法都基于 Beer-Lambert 定律。

测量的标准品吸光度用于创建校准曲线，然后使用该曲线确定未知样品的浓度。该曲线可以手动绘制，但较新的分光光度法工具将在测量完所有标准品后创建校准曲线。这些系统还将在分析未知样品时计算蛋白质浓度。

现在我们已经回顾了如何分析光度蛋白质测定数据，让我们看看这些程序的一些使用方式。

光度蛋白测定的原理也可用于直接测量核酸浓度。nanodrop 分光光度计可在光学活性基座上接受非常小体积的样品。然后测量吸光度，系统自动测定核酸浓度。由于蛋白质和其他来源会干扰测量，因此通过分析 260 至 280 nm 和 260 至 230 nm 的吸光度比来确定样品纯度。DNA 和 RNA 的纯核酸比率通常分别约为 1.8 和约 2.0。

光度蛋白测定还可用于生产仿生材料，仿生材料的灵感来自大自然，可引发特定的细胞反应。重组粘附素与聚苯乙烯珠结合，以模拟细菌对宿主细胞的附着。Bradford 测定法用于确定仿生材料生产中重组粘附到珠子上的偶联效率。

替代光度蛋白质测定可用于蛋白质抗菌剂的检测和表征。Remazol 亮蓝 R 染料与热灭活细菌共价键合。蛋白质抗菌剂在染色溶液中孵育。然后，将样品离心，并使用微孔板分光光度计测量上清液在 595 nm 处的吸光度。通过从标记细菌释放到上清液中的可溶性染料增加的吸光度是酶活性的定量测量。

您刚刚观看了 JoVE 关于光度蛋白测定的视频。本视频介绍了光度测定的基本原理，介绍了一些常见分析的一般程序，并介绍了技术的一些新进展。感谢观看！