生物化学

透析是一种在生物化学中常用的基于扩散原理分离分子的技术。在此过程中，半透膜允许特定分子根据其大小进行移动。该方法可用于去除缓冲液（称为脱盐），或置换蛋白质溶液中的缓冲液分子或离子。 本视频介绍了透析的原理以及通用操作流程。 同时回顾了透析的多种应用，包括超速离心后去除梯度试剂、膜蛋白提取后去除去垢剂，以及通过改变溶液环境实现蛋白质的重构成。 生化样品通常含有高浓度的缓冲液，可能会干扰后续的处理和分析。透析是一种常见且经济的技术，用于基于扩散来分离分子。该方法利用半透膜，根据分子大小选择性地允许某些组分通过。本视频将介绍透析的基本原理、通用操作步骤以及其在生物化学中的一些应用。 透析最重要的部分是半透膜，这种膜具有孔隙，可设定分子量截留阈值，允许小于特定尺寸的分子通过。例如，10 kDa的膜通常会截留分子量大于10千道尔顿的分子。然而，分子量截留值并非一个明确或精确的界限。膜通常包含一系列不同大小的孔径，因此接近截留值的小部分分子可能会丢失。

酶动力学描述了酶的催化作用，酶是一类促进生物体必需化学反应的生物大分子。酶作用于被称为底物的分子，生成产物。通过测定底物或产物浓度随时间的直接或间接变化，可以确定酶动力学参数。  本视频将介绍酶动力学的基本原理（包括速率方程）和动力学模型。还将讨论酶活性测定的相关概念，随后介绍一种典型的比色法测定。应用部分将讨论通过荧光共振能量转移（FRET）分析进行酶活性测定、表征环境中胞外酶活性，以及利用分子探针研究DNA修复动力学。 酶是生命所必需的生物催化剂。酶活性测定用于研究酶促反应的动力学特性，阐明酶的催化作用。本视频将介绍酶动力学和酶活性测定的基本原理，概述一般实验步骤，并展示一些应用实例。 酶是蛋白质，或较少情况下为RNA，它们作用于特定的反应物，该反应物被称为底物。酶能够降低启动生化反应所需的活化能，从而使反应以更快的速率进行。 酶促反应可分为三个基本步骤。第一步是酶-底物复合物的形成，即底物与酶的活性位点结合。该复合物可分解为原始组分，这是第二个基本反应。或者，该复合物可生成产物并释放出酶，这是第三个基本反应。

基质辅助激光解吸电离（MALDI）是一种适用于生物大分子分析的质谱电离源。该技术并非对气态化合物进行电离，而是将样品嵌入基质中，再用激光照射。基质吸收大部分能量，随后将部分能量传递给样品，使其发生电离。电离后的样品离子可通过飞行时间分析器（TOF）进行鉴定。 本视频介绍了基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）的基本原理，包括基质的选择以及飞行时间（TOF）如何用于确定质荷比。该实验流程演示了MALDI靶板的制备、样品在靶板上的点样，以及飞行时间质谱仪的操作。在最后部分，展示了该技术的应用与变体，包括全细胞分析、复杂生物样品的表征，以及电喷雾电离技术。 基质辅助激光解吸电离（MALDI）是一种适用于生物大分子分析的质谱电离源。大多数电离源在电离过程中会破坏大分子量且结构脆弱的生物分子的结构信息，而 MALDI 能在将分子加速进入质量分析器的同时保持其结构完整性和相关信息。质量分析器根据化合物的大小和电荷对其进行分离。与 MALDI 最常联用的质量分析器是飞行时间（TOF）质量分析器。本视频将介绍 MALDI 电离的基本原理、通用实验操作流程及其在生物化学中的一些应用。

在串联质谱分析中，从生物样品中分离出目标生物分子，然后将其裂解为多个亚单位，以帮助阐明其组成和序列。该过程通过串联的质谱仪实现：第一台质谱仪对样品进行离子化，并筛选出具有特定质荷比的离子；筛选后的离子被进一步裂解，产生的碎片随后进入第二台质谱仪进行分析。 本视频介绍了串联质谱的基本原理，包括质荷比选择和解离方法。同时展示了一种利用碰撞诱导解离进行串联质谱分析生物化学化合物的一般步骤。应用部分涵盖了选择反应监测、蛋白质翻译后修饰的鉴定，以及血液中他克莫司浓度的检测。 串联质谱技术将多个质谱阶段结合在一起，首先分离特定生物分子，然后分析其化学组成。生物分子具有庞大而复杂的结构，使其分子构成难以确定。串联质谱技术可选择目标分子，并将其碎裂为多个亚单位，从而有助于阐明该分子的身份及其序列。本视频将介绍串联质谱技术的基本原理、通用实验流程，以及其在生物化学中的一些应用。

蛋白质结晶是指获得生物大分子的固态晶格，有助于阐明蛋白质结构，并实现对蛋白质功能的研究。结晶过程涉及在多种因素共同作用下使纯化的蛋白质脱水，这些因素包括pH值、温度、离子强度和蛋白质浓度。一旦获得晶体，便可利用X射线衍射技术并结合电子密度模型的计算，解析出蛋白质的结构。 本视频介绍了蛋白质结晶技术，并演示了一般操作流程。流程中涵盖了蛋白质表达与纯化、结晶以及X射线衍射等内容。蛋白质结晶的应用包括 计算机模拟 药物设计、结合位点确定和膜蛋白结构分析。 蛋白质结晶是指获得蛋白质晶格状固体形式的过程。这些晶体对结构生物学家尤为重要，有助于研究蛋白质的功能。其他技术，如质谱或SDS-PAGE，只能提供有关蛋白质一维结构的信息。蛋白质结晶通常与重组蛋白表达和X射线衍射技术相结合使用。本视频将介绍蛋白质结晶的基本原理、通用的实验操作流程，以及其在生物化学领域中的若干应用。

在生物化学中，基于色谱的纯化方法被用于从复杂混合物中分离化合物。生物化学家常用的两种此类方法是凝胶过滤色谱和亲和色谱。在凝胶过滤色谱中，填充有多孔微珠的色谱柱根据分子大小对混合物中的组分进行分离。而亲和色谱则利用含有针对特定目标分子的配体的固定相色谱柱，实现对生物大分子更特异性的分离。 本视频介绍了尺寸排阻色谱和亲和色谱的基本原理及其相关概念。详细描述了通过固定化金属亲和色谱纯化组氨酸标签蛋白的逐步操作流程。同时概述了这两种色谱技术在生物化学与生物医学研究中的应用。 "色谱法"指用于从复杂混合物中分离出某一组分的多种方法，这是在确定生物分子的性质和活性之前必不可少的步骤。每种色谱技术根据样品基质和目标化合物的不同，采用不同的分离机制。本视频将重点介绍生物化学中两种常用方法的原理与操作：尺寸排阻色谱和亲和色谱。 凝胶过滤色谱法或称尺寸排阻色谱法（SEC）是基于样品中化合物的分子大小进行分离的。将含有样品的流动相加入到装有孔状材料（即固定相）的色谱柱中。样品中的分子可分为以下三类。

二维凝胶电泳（2DGE）是一种能够从混合物中分离数千种生物分子的技术。该技术结合了两种不同的分离方法：等电聚焦（IEF）和十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。该方法通过生物分子的等电点（一种电化学性质）和分子量，在凝胶的两个方向上实现化合物的物理分离。 本视频中的实验流程涵盖了二维凝胶电泳（2DGE）的主要原理，以及对复杂蛋白质溶液组成进行表征的一般操作步骤。在应用部分展示了该技术的三个实例，包括疾病发生与发展过程中的生物标志物检测、对患者治疗过程的监测，以及翻译后修饰（PTM）后蛋白质的研究。 二维凝胶电泳（2D凝胶电泳）是一种利用两种不同分离方法的技术，能够从单一混合物中分离数千种蛋白质。其中一种技术——SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）——单独使用时无法完全分离复杂的混合物。二维凝胶电泳将SDS-PAGE与第二种方法——等电聚焦（IEF）相结合，后者根据蛋白质的等电点进行分离，从而能够分辨细胞裂解液中几乎所有可能存在的蛋白质。本视频将介绍二维凝胶电泳的原理、通用实验步骤及其在生物医学领域的一些应用。

代谢标记用于研究细胞内发生的生化转化和修饰过程。该方法通过使用模拟天然生物分子结构的化学类似物来实现。细胞在其内源性生化过程中利用这些类似物，生成带有标记的化合物。这种标记使得检测标签和亲和标签得以引入，随后可结合其他生化分析技术（如SDS-PAGE和核磁共振，NMR）来阐明代谢通路。 本视频介绍了代谢标记的概念，并展示了两种通用实验方法。  第一种方法采用同位素标记，用于表征蛋白质的磷酸化修饰；第二种方法采用光反应性标记，用于表征蛋白质-蛋白质相互作用。此外，还介绍了代谢标记的三个应用：植物材料的标记、RNA标记以测定动力学，以及发育胚胎中糖链的标记。 代谢标记用于研究细胞的分子机制。该方法利用化学类似物来探查所发生的生化转化和修饰过程。本视频将介绍代谢标记的原理、典型的同位素标记和光反应标记方法，以及一些应用实例。 代谢标记可通过多种策略实现。本文将介绍同位素标记、光反应标记和生物正交标记。

电泳迁移率偏移实验（EMSA）是一种用于阐明蛋白质与核酸之间结合的生化方法。在该实验中，将放射性标记的核酸与待测蛋白质混合，通过凝胶电泳分离各组分，根据其质量、电荷和构象来确定是否发生结合。 本视频介绍了凝胶迁移阻滞实验（EMSA）的原理及通用操作流程，包括凝胶与蛋白质样品的制备、结合反应、电泳及检测步骤。视频涵盖的应用包括染色质重塑酶的分析、结合生物素标记技术的改良型EMSA，以及细菌反应调节蛋白结合位点的研究。 EMSA（电泳迁移率偏移分析），也称为凝胶迁移分析，是一种多功能且灵敏的生物化学实验方法。EMSA 通过检测凝胶电泳中条带的迁移偏移，揭示蛋白质与核酸之间的结合情况。 本视频将介绍 EMSA 的基本原理，提供通用实验流程，并讨论其部分应用。

测定浓度是许多生物化学实验的基本步骤。光度法蛋白质测定利用了以下原理：样品中吸光物质含量越高，透过的光就越少。由于浓度与吸光度之间存在线性关系，因此可利用这一现象来测定未知浓度的样品。 本视频介绍了光度法蛋白质测定的基本原理，并讲解了 Bradford 法和 Lowry 法。视频中的操作流程将涵盖典型的 Bradford 测定实验。所涉及的应用包括：直接测定极小体积核酸样品以表征其浓度和纯度、测定仿生材料的偶联效率，以及使用丽春红染料进行光度法蛋白质测定的另一种变体方法。 测定样品中蛋白质的浓度是许多生物化学实验中的基本步骤。分光光度法测定可用少量样品完成。样品中吸光物质越多，透过的光就越少。这为吸光物质提供了定量测量依据。这些概念对科学而言极为基础，介绍其中两种技术的文章位列有史以来被引用次数最多的三篇论文之中。本视频将介绍一些最常用的分光光度蛋白质测定技术背后的原理、实验操作方法以及所收集数据的分析方式。 光度法蛋白质测定基于浓度与光吸收度之间的关系。这被称为朗伯-比尔定律，该定律指出，光吸收物质的浓度与其吸光度成正比。 这一原理是所有光度法蛋白质测定方法的基础。

密度梯度超速离心是一种用于分离和纯化生物分子及细胞结构的常用技术。该技术利用了以下原理：在悬浮液中，密度大于溶剂的颗粒会沉降，而密度小于溶剂的颗粒则会上浮。通过使用高速超速离心机加速这一过程，可在密度梯度中实现生物分子的分离；密度梯度可通过在离心管中逐层叠加密度递减的液体来建立。 本视频将介绍密度梯度超速离心的原理，包括演示样品制备、蔗糖梯度的制备、超速离心以及分步收集目标分析物的操作流程。应用部分将讨论多蛋白复合物的分离、核酸复合物的分离，以及利用氯化铯密度梯度进行分离的方法。 密度梯度超速离心法是生化实验中分离和纯化细胞结构的常用方法。该技术利用高速（即超速）离心机，在密度梯度中无损地分离细胞组分。本视频介绍了密度梯度超速离心的基本原理，提供了一种使用蔗糖梯度的一般操作步骤，并讨论了该技术的一些应用。 首先让我们来探讨超速离心机和密度梯度的基本原理。悬浮液是指在液体溶剂中含有颗粒的混合物。由于重力作用，密度大于溶剂的颗粒会沉降，而密度小于溶剂的颗粒则会上浮。颗粒与溶剂之间的密度差异越大，分离速度就越快。

共免疫沉淀（CoIP）和拉下实验是用于鉴定稳定蛋白质-蛋白质相互作用的密切相关的两种方法。这些方法与免疫沉淀相关，后者是一种通过抗体结合目标蛋白质，并将其与未结合的蛋白质分离的方法。在共免疫沉淀中，与抗体结合的蛋白质本身还与另一种不直接结合抗体的蛋白质相互作用，随后通过分离过程保留该蛋白质-蛋白质复合物。拉下实验的不同之处在于，使用带有亲和标签的诱饵蛋白代替抗体，并利用亲和层析技术来分离蛋白质-蛋白质复合物。 本视频介绍了免疫共沉淀（CoIP）、下拉实验（pull-down assay）及其在实验室中的实施方法。详细讲解了每种技术的逐步操作流程，包括用于纯化和分析结合蛋白的试剂、设备和仪器。此外，视频的应用部分描述了一种研究黏病毒蛋白如何抑制流感病毒核蛋白的方法，一项通过下拉实验探究钙离子在钙调蛋白中作用的研究，以及一种用于表征瞬时蛋白质相互作用的改进型下拉实验。 蛋白质-蛋白质相互作用在多种生物学功能中发挥着重要作用。目前大多数蛋白质-蛋白质相互作用及其生物学效应仍有待鉴定。免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation，简称 CoIP）和拉下实验（pull-down...

复原是指将分离的生物大分子恢复至其原始形态或功能的过程。这一技术对于研究膜蛋白尤其有用，因为膜蛋白能够介导重要的细胞功能，并影响邻近脂质的行为。为了在原位研究纯化后膜蛋白的功能，必须通过将其整合到人工脂质膜中来实现复原。 本视频介绍了膜蛋白重建的相关概念及操作步骤，包括使用去垢剂分离蛋白、利用脂质形成人工囊泡、将分离的蛋白整合至人工囊泡中，以及从溶液中去除去垢剂。最后，介绍了两个应用实例：膜转运蛋白的重建和光捕获蛋白的重建。  复现是指将分离的生物大分子恢复至其原始形态或功能的过程。该方法常用于研究膜蛋白，因为膜蛋白介导许多重要的细胞过程，并影响邻近脂质的行为。然而，细胞环境的复杂性使得在原位（in situ）研究膜蛋白功能十分困难。虽然膜蛋白可以被提取并纯化，但在缺乏膜结构的情况下，其真实功能无法被评估。因此，通常通过将分离的膜蛋白整合到人工脂质膜（如脂质体）中来实现其复现。本视频将介绍膜蛋白复现的基本原理、通用的复现操作流程，以及其在生物化学领域中的若干应用。

弗örster共振能量转移（FRET）是一种用于研究短程生物化学相互作用的现象。在FRET中，如果供体光致发光分子的发射光谱与受体分子的吸收光谱存在重叠，则供体可非辐射地将能量转移给受体分子。所转移能量的多少——从而样品的整体发射强度——取决于一对光致发光分子（供体与受体）之间的接近程度。FRET分析常与其他生物化学技术结合使用，以从这种“光谱尺”中获取生物大分子结构和相互作用的详细信息。 本视频介绍了FRET分析的原理和概念。实验流程重点介绍FRET样品的制备方法，以及数据的呈现和解读方式。最后，应用实例包括通过标记细胞或蛋白质的特定部分来监测构象变化和细胞内过程、监测改变蛋白质结构的酶促反应，以及利用FRET监测细胞表达的单体聚集过程。 弗örster共振能量转移（Förster Resonance Energy Transfer，简称FRET）是一种在发光分子之间发生的非辐射性能量转移，常用于研究短距离的生化相互作用。FRET仅在荧光分子间距小于10...

表面等离子体共振（SPR）是一种无标记生物传感器背后的基本光学现象，可用于评估生物分子的分子亲和力、动力学、特异性和浓度。在 SPR 技术中，生物分子相互作用发生在由一层薄金属镀在棱镜上的生物传感器表面。通过测量从金属层下表面反射的光的变化，可实时监测生物分子的相互作用。 本视频介绍了表面等离子体共振（SPR）的基本概念，以及如何利用SPR分析和可视化生物分子相互作用。随后讲解了用于研究结合速率的SPR样品制备和实验操作流程。在应用部分，探讨了SPR成像、局域SPR以及量子点增强型SPR技术。 表面等离子体共振（SPR）是某些无标记生物传感器用于评估生物分子结合与吸附相互作用背后的物理现象。需要标记的结合测定方法（如ELISA）可能耗时较长，并可能改变分析物的功能。在SPR技术中，生物分子相互作用发生在一个特殊传感器表面，该传感器由棱镜一侧镀上的一层薄金属构成。通过监测从金属层下表面反射光的变化，SPR仪器可在无需标记的情况下实时可视化这些相互作用。本视频将介绍SPR的基本原理、SPR成像的一般操作流程，以及其在生物化学领域中的一些应用。 SPR...