高通量, 用定量斑点杂交分析法绝对测定组织层中选定蛋白质的含量 (QDB)
2018年8月21日
在这里, 我们展示了定量斑点杂交分析 (QDB) 的详细过程, 通过确定目标蛋白的绝对含量, 帽肌动蛋白, gelsolin 样 (CAPG), 在三种不同的小鼠组织。我们展示了高通量, 方便, 定量应用免疫印迹技术的生物标志物验证在细胞和组织水平。
这种方法可以称为组织水平的 ELISA，以与传统的细胞和组织水平蛋白质含量的相对半定量定量相距甚远，后者是目前研究实验室和临床诊断领域的常态。该技术的主要优点可以用三个词来描述：高通量、定量和绝对。如果我们要添加另一个词，那会很简单。
该技术的含义延伸到蛋白质组学领域，而生物标志物的验证可以以高通量形式实现。该方法在整个研究和临床领域都有广泛的应用。目前，细胞和组织水平的蛋白质量定量仍然很原始。
一般来说，刚接触这种方法的人学习这种技术不会遇到任何问题，而且它是非常基础的，需要最少的实验室技能才能执行。我们很高兴使用动物模型来展示该技术的可靠性、简单性和准确性。样品可以使用研究实验室中常用的任何裂解缓冲液制备，有或没有去污剂，如 MP40 或 Triton X.In 我们的情况下，我们使用 Triton X 裂解缓冲液。
将 5 至 100 毫克的组织切片放入 1.5 毫升的试管中。接下来，加入 200 μL 补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液。接下来，用匀浆器在冰上匀浆组织 1 分钟。
然后在 4 摄氏度下以 8， 000 倍 g 离心样品 10 分钟。将上清液收集到新试管中，取出 1 微升，以使用蛋白质测定试剂盒（如 BCA 测定）测量蛋白质裂解物中的总蛋白量。在 37 摄氏度下孵育 30 分钟，然后在酶标仪上测量 562 纳米处的吸光度。
在该步骤中，使用已知浓度的重组蛋白作为标准品，将蛋白质稀释至浓度为 12， 000 pg/μL 作为储备液。同时，将制备的样品裂解物稀释至每微升 4 微克。为了获得更可靠的结果，我们建议使用样品裂解物混合物，以避免单个样品之间存在任何差异。
连续稀释标准蛋白和制备的样品，用于典型的剂量研究。补充 BSA 以确保每个样品的蛋白质上样量大致相等。之后，将 10 μL 连续稀释的标准蛋白或样品裂解物与 10 μL 2X 上样缓冲液混合。
然后将混合物在 85 摄氏度下加热 5 分钟。在此过程中，将一个空的移液器吸头盒放在 QDB 板下方，以避免板底部接触桌面。将最多 2 μL 的样品加载到 QDB 板单个单元底部的膜中心。
加载时切勿让 QDB 板的底部接触任何表面，并且不要为单个孔加载太多。根据我们的经验，每孔不超过 4 微升。接下来，将加载的 QDB 板在室温下放置 1 小时，或在通风良好的空间下将加载的 QDB 板在 37 摄氏度下放置 15 分钟。
要封闭板，请将 QDB 板浸入转印缓冲液中，然后轻轻摇晃 10 秒钟。之后，用 TBST 轻轻冲洗 QDB 板 3 次，然后在 TBST 中不断摇晃洗涤板 5 分钟。随后，在不断摇动下用封闭缓冲液封闭 QDB 板 1 小时。
现在，在封闭缓冲液中以选定的浓度稀释一抗，并向普通 96 孔板的每个孔中加入 100 μL。将 QDB 板插入 96 孔板中，并在室温下孵育组合板 2 小时或在 4 摄氏度下持续摇动孵育过夜。之后，用 TBST 轻轻冲洗板 3 次，然后用 TBST 洗涤 3 次，每次在不断摇晃下洗涤 5 分钟。
接下来，在封闭缓冲液中以所选浓度稀释二抗，并将 100 μL 分装到 96 孔板的每个孔中。然后将 QDB 板在加载的 96 孔板内在室温下不断摇动孵育 1 小时。用 TBST 轻轻冲洗 QDB 板 3 次，然后用 TBST 在不断摇晃下洗涤板 3 次，每次 5 分钟。
为了定量，制备 ECL 底物并以每孔 100 微升的浓度将其分装到 96 孔板中。然后将 QDB 板插入 96 孔板内，在不断摇动下放置 2 分钟。之后，从 96 孔板中取出 QDB 板并短暂摇晃以去除多余的液体。
随后，将板放在白色微量滴定板上。接下来，打开酶标仪并在用户界面上选择带盖板，然后将组合板放入酶标仪中进行定量。确保选择带盖的板以避免错误。
该图显示了兔抗 CAPG 抗体的特异性，使用从脾脏、心脏、肌肉、肾脏、肝脏和前列腺制备的小鼠组织裂解物和蛋白质印迹分析。确定了使用前列腺、肾脏、脾脏制备的裂解物和纯化的重组 CAPG 蛋白标准品对兔抗 CAPG 抗体进行 QDB 分析的线性范围。结果是一式三份的平均值。
这里显示的是从小鼠肾脏、脾脏和前列腺制备的裂解物中 CAPG 水平的绝对测定。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在 4 到 24 小时内完成。在尝试此程序时，请务必记住在整个程序中使用预定的特异性抗体。
按照此程序，可以执行其他方法，如生物统计学分析，以回答只能通过在细胞或组织水平上绝对测量单个蛋白质含量才能实现的其他问题。自开发以来，该技术为蛋白质组学研究领域的研究人员在人群水平上探索蛋白质生物标志物与各种疾病的假定关系铺平了道路。观看此视频后，您应该对如何以高通量格式执行 QDB 分析有很好的了解。
不要忘记，处理人体或动物组织可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如使用手套。
概述
本文介绍了一种定量点印迹分析（QDB）方法，用于测定多种小鼠组织中帽状肌动蛋白结合蛋白gelsolin样蛋白（CAPG）的绝对含量。该技术具有高通量、操作简便和定量准确的特点，适用于生物标志物的验证。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物化学
- 蛋白质组学
背景
- 传统的蛋白质定量方法通常是半定量的。
- 需要高通量技术以有效验证生物标志物。
- QDB 为蛋白质的绝对定量提供了一种可靠的替代方法。
- 操作步骤简单，使实验技能有限的研究人员也能轻松使用。
研究目的
- 展示一种用于蛋白质绝对定量的高通量方法。
- 利用CAPG作为生物标志物在小鼠组织中验证该技术。
- 为领域内的研究人员提供一个简便的实验方案。
使用的方法
- 使用传统裂解缓冲液进行样品制备。
- 组织样品的匀浆和离心。
- 使用重组蛋白标准品进行定量。
- 样品在QDB板上的连续稀释与加样。
主要结果
- 成功定量小鼠组织中的CAPG水平。
- 利用多种组织裂解液验证了QDB分析的线性范围。
- 结果表明该方法在多个样本中具有良好的重复性和准确性。
- 若操作正确，该技术可在数小时内完成。
结论
- QDB 是一种用于绝对蛋白质定量的有价值工具。
- 该方法简单，新用户可快速掌握。
- 它在科研和临床环境中均有广泛应用。
常见问题
行业重要性概述
定量点印迹分析（QDB）通过实现组织水平上绝对的、高通量的蛋白质定量，弥补了蛋白质组学中的一个关键空白，这对于生物标志物验证和信号通路确认至关重要。该方法提供可靠且可重复的数据，支持跨研究比较和大规模分析，减少靶点验证中的机制模糊性。其操作简便且对技术要求较低，有助于在整个企业范围内的发现和转化研究流程中广泛采用。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：能够对 CAPG 等靶蛋白进行绝对定量，支持治疗假设的验证和生物学风险的降低。
- 操作价值：使用简单的裂解缓冲液和常规实验室设备，仅需 minimal 培训即可实现稳定操作。
- 预测价值：利用重组标准品生成线性范围数据，提高对靶点结合和通路调控评估结果的可信度。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：提供定量的绝对蛋白质测量结果，可实现可靠的化合物筛选和剂量-反应分析。
- 操作价值：兼容96孔板格式和微孔板读板仪，支持高通量筛选的可扩展性。
- 再利用潜力：建立标准化且可转移的检测平台，适用于跨样本集的长期蛋白质监测。
转化与临床前研究
- 转化价值：通过提供与疾病模型相关的组织水平蛋白质数据，连接发现阶段与临床前阶段。
- 风险降低：利用绝对定量值支持生物标志物的验证，增强对靶点与疾病关系的信心。
- 连续性：采用相同的定量方法，实现从早期发现到临床前验证全过程中的蛋白质持续追踪。
流程与工作流整合
QDB 通过提供绝对蛋白质定量，契合了发现研究的连续过程，有助于靶点验证，实现可用于筛选的检测，并通过可重复的定量结果支持转化研究的连续性。
- 发现生物学：通过在与疾病相关的组织中对目标蛋白水平进行绝对定量，支持假设验证和通路阐明。
- 筛选：提供标准化的定量读数，适用于高通量化合物评估和苗头化合物确认。
- 分析：生成绝对浓度数据（例如，pg/µL），实现不同样本、条件和研究之间的直接比较。
- 转化研究：通过提供与表型或临床终点相关联的组织水平蛋白数据，促进生物标志物的整合与比对。
- 企业级复用：作为一种可重复使用、与平台无关的蛋白定量能力，支持跨项目和治疗领域的应用。
运营与企业影响
- 科学价值：通过消除半定量变异性，提高靶点验证的预测可信度。
- 操作价值：通过标准化的封闭、洗涤和检测步骤，确保实验的可重复性。
- 战略价值：提供靶点蛋白的绝对定量数据，用于靶点优先排序和项目组合筛选，从而优化“推进/终止”决策。
- 项目组合影响：基于相关组织中经验证的靶点表达水平，实现风险调整后的推进决策。
实施注意事项
- 需要具备免疫印迹、抗体验证和蛋白质标准品操作方面的专业知识。
- 依赖于酶标仪、培养箱以及标准裂解缓冲液（如 Triton X）的可及性。
- 需要在不同团队之间对抗体稀释比例、上样体积和孵育时间进行标准化。
- 在不同模型系统间的适用性取决于组织特异性的裂解效率和抗原可及性。
- 实际限制包括需要经过验证的抗体，以及优化封闭和洗涤步骤以尽量减少背景信号。
