Name: 简化的3D 小脑鉴别协议, 可选2D 修改 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: 学习使用简化3D分化协议从人多能干细胞生成小脑细胞谱系，支持2D和3D培养环境。该方法利用限定培养基和减少的生长因子，可形成具有神经上皮结构的细胞聚集体，表达小脑发育相关标志物，为研究儿童脑疾病机制提供可靠基础。

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我们感谢Gerbren Jacobs和Jurjen Broeke提供的专业技术支持，感谢Prisca Leferink在两个对照iPSC细胞系的建立与表征工作中所做出的贡献，以及感谢Lisa Gasparotto对本实验操作流程的示范。

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

复杂性和成本是干细胞研究人员在选择或开发分化方案时需要考虑的重要因素。尤其值得注意的是，目前尚不明确在诱导生成目标细胞类型时，究竟需要多大程度的外部干预；换言之，若仅提供充足营养，人多能干细胞（hPSCs）在多大程度上能够自主构建其发育所需的微环境。外源因子的引入 体外 可能会产生所需的目标细胞产物，但也可能干扰细胞原本应表现出的内在发育潜能 体内这些考虑因素至关重要，特别是当目标是利用患者来源的iPSC进行疾病建模时。广泛使用模式化诱导和/或生长因子可能会掩盖疾病的表型特征。本报告中详述的实验方案遵循既往研究的趋势，旨在降低复杂性、成本以及对外源性模式化因子的依赖。8,9.
根据Muguruma报道的结果 等人， 根据我们最近的研究，似乎无需刻意模拟即可实现向小脑命运的分化 体内 条件，正如之前的研究所做的那样1,2,3,4,8,10有趣的是，这两项研究使用了不同的生长因子组合，表明这些组合中的任一组都不是必需的，尽管两者都使用了FGF2。我们进行了额外的实验，选择性地从方案中去除FGFs，结果表明细胞在无外源性FGFs的情况下仍能生成相同产物。10我们研究之间的差异可能源于所使用的人多能干细胞系和培养方法不同，采用视黄酸（RA）诱导神经分化，并添加了支持颗粒细胞存活与成熟的成分（BDNF、GDNF、SAG 和 KCl）。11-14此外，与Muguruma相比，该方法的启动过程更为简单。 等，被采用。他们的方案首先在96孔板中生成均一的拟胚体（EBs），从而在物理和化学上将彼此隔离开来。而本实验方案在6孔板中进行EB形成，使所有PSCs相对聚集在一起，允许它们自由相互作用。这种差异可能如何不同地影响EB及其后续类器官的物理与化学微环境（包括信号分子的内在产生），目前尚不明确，有待进一步探索。此外，尽管我们展示了与小脑起源相关基因的表达——提示具有小脑特征——且这些结构在形态上与Muguruma报道的结构相似， 等我们不能排除生成具有非小脑身份的类神经元结构的可能性。未来的研究可使用大量抗体组合，如Muguruma等人所报道的那些抗体 等 (即，ATOH1，CALB， 等等。将使此类指认以及两种方案产物间的比较更具结论性。
在3D培养方案中，为确保获得足够数量的终末产物用于分析，起始培养时必须具备并维持足够数量的细胞。由于在方案早期存在显著的细胞死亡现象，我们建议在培养的前3天内，每孔起始的拟胚体（EB）数量应超过500个（图1）。对于无饲养层培养条件下人多能干细胞（hPSCs）的集落大小而言，这一目标通常不难实现；但对于仍在使用饲养层依赖性方法的研究者而言，可能较难达到。鉴于细胞数量庞大，需密切观察培养基颜色变化（提示pH改变）以及死细胞的积累。上述问题必须及时纠正，以防止培养体系崩溃。此外，细胞和聚集体可能出现团聚，形成巨大的结构。尽管这些大聚集体仍可能用于分析，但产物数量将显著减少，因此可通过轻柔吹打将其分散为较小的聚集体，这可能是有益的。然而，应避免干扰正常的聚集体，因为它们本身可生长至较大尺寸（图4）。如果聚集体过于稀疏，建议合并孔间培养物，以避免聚集体完全孤立。产物在数量、大小和形态上的变异性是3D细胞培养中公认的问题，即使是从均一、单个拟胚体形成步骤开始的方案也存在此类问题，这提示较为简化的起始流程（例如本文所述方案）可能更具实用性8,15。尽管这种异质性是研究人员在分析过程中必须注意的问题，但本方案所获得的产物与其他3D培养方案报道的结果具有一致性8,9,15。根据其大小和形态特征，这些产物处于神经玫瑰花环样结构至脑类器官的范围之内，如Kelava和Lancaster近期综述中所述15，其中大多数最符合球状体（spheroid）的分类。尤为显著的是，观察到存在提示神经玫瑰花环结构的三维构造，包括管腔、（亚）室管膜区以及菱脑唇样特征（图5和 图6），这些结构已被其他研究团队所识别8,15,16,17。由于每次实验均至少产生一个具有假定的VZ/SVZ结构及小脑相关标志物（ZIC1、KIRREL2）的聚集体，因此这些可作为判断本方案3D分化是否成功的有效标准，而菱脑唇样特征则提供进一步支持证据。本研究未测试超过35天的延长培养，但可进一步探索以确定该技术所能支持的生长极限、结构复杂性及成熟度。
二维培养方案采用与三维方案相同的非黏附性胚状体（EB）形成和神经诱导过程，因此上述注意事项同样适用。一旦接种，还需考虑另一组因素。EB应迅速贴壁，以便细胞向外增殖生长。如果存在贴壁困难的问题，可尝试添加ROCK抑制剂（RI）（若尚未使用）、减少培养基体积，或对PLO/LAM的浓度进行实验性调整。需注意避免细胞在孔中生长过密或过稀（理想状态为20%-80%融合度），每日监测并及时传代至关重要，以防止过度融合或细胞漂浮。与三维方案不同，在培养过程中不应出现明显的细胞死亡，尽管可能存在局部生长不良或增殖速率减慢的情况。传代会影响细胞的成熟状态（例如，会去除细胞突起以及细胞间已形成的网络结构），因此在计划收集或分析细胞时应充分考虑此因素。例如，进行钙成像实验时，建议在分析前2至6天内进行传代。传代时间距离分析过近可能导致细胞尚未充分连接或成熟，而间隔过长则可能导致细胞过度拥挤，从而影响成像效果。尽管不同实验之间可能存在一定变异性，但结果与最初报道的二维小脑分化方案一致1,2。免疫细胞化学染色和基因表达分析证实存在表达颗粒细胞标志物ZIC1的细胞，同时也检测到其他神经及小脑细胞类型的标志物（图7 和 图8）。钙成像实验通过电刺激经fluor5染料孵育的细胞，显示了功能性神经元活动（图9、补充图1 和 补充图2），但尚不能确定这些细胞是否为颗粒细胞。可以认为，若延长培养时间至35天以上，给予细胞更充分的成熟时间，功能性神经元活动的水平有望进一步提高。这一可能性有待未来进一步探索。
除了上述建议的研究方向外，还值得探究2D与3D培养方案在产物特性（数量与质量）上的差异。在2D方案中尚未检验外源性FGF的作用，了解在接种后缺乏3D结构及其相关信号通路的情况下，2D培养是否对早期模式化化合物具有更高或更低的依赖性，将具有重要意义。更简化的方案（例如，无RA、BDNF、SAG）同样值得作为进一步研究的方向。最后，未来的研究可借助新的研究工具，以更准确地表征（并评估）人类特异性小脑神经元亚型的生成效率。
在考虑上述注意事项的前提下，这两种已报道的方案均可用于小脑分化，其产物适用于不同目的。这些方案可为研究人员开展预实验、检测细胞系进行此类分化的可行性，或作为其他类型靶向神经分化的基础模型提供实用的起点。

体外诱导人多能干细胞（hPSCs）向小脑谱系分化的方案最初基于模拟体内小脑发育的原理1,2,3,4。因此，这些方案需要在特定时间依次引入多种因子，以驱动前小脑模式形成及后续成熟过程。其中最为关键的因子包括WNT、骨形态发生蛋白（BMPs）和成纤维细胞生长因子（FGFs），它们在中后脑发育及峡部组织者（isthmic organizer）的形成中具有明确作用5,6,7。然而，每增加一个步骤或因子，都会提高实验操作的劳动强度和研究成本，因此开发更为简化的、同时能达到同等效果的方案具有重要意义。这一实际问题也与一个假设性问题高度契合：即细胞在体外发育过程中是否真的需要如此严密的外部调控。
在小脑分化方面，2015年发表的一项方案通过仅使用FGF2、FGF19和基质细胞衍生因子1（SDF1）进行模式诱导，解决了以往需要使用大量生长因子的问题8。该研究还采用了一种悬浮的三维培养系统，与此前的小脑分化方案有所不同。除了生成表达小脑标志物的细胞外，该技术所产生的脑&#34;类器官&#34;还表现出传统二维单层培养无法实现的相关形态特征，例如类似菱脑唇的结构。尽管该方法在生长因子的使用上更为简单且成本较低，但其初始步骤中诸如形成均一的拟胚体（EBs）以及在96孔板（96WPs）中进行培养等操作，使其在实验流程上较为复杂。同年发表的另一项三维培养方案则报道了利用常见且低成本的细胞培养技术成功实现向神经谱系的分化9。尽管该研究团队主要关注的是皮层而非小脑分化，但其提出的方法理念应用于小脑分化的可能性仍不可忽视。
我们最近报道了一种三维小脑分化方案，该方案采用较少的模式诱导因子（即 FGF2、4 和 8），并通过在整个过程中将细胞维持在6孔板（6WPs）中以简化实验设置，从而减少培养基的使用量10为促进颗粒细胞的生成，在最终成熟阶段使用了平滑受体激动剂（SAG）。由于SAG在促进颗粒细胞前体（GCPs）生长方面具有重要作用，因此可作为音猬因子（SHH）的一种成本较低的化学替代物，而SHH此前已被用于小脑分化方案中。 体内1,2,11,12,13分化产物与其他3D方案的结果一致，包括在形态学相关结构中存在小脑相关标志物8,9此类结果进一步印证了先前的观点，即对细节的精确模拟 在体内 环境对于复杂的三维结构可能并非必需 体外 分化方案。
除了三维培养方案外，本报告还描述了一种二维培养方案，该方案具有相同的快速启动、基础材料以及较少的生长因子种类。该方法能够从人胚胎干细胞（hESCs）或诱导性多能干细胞（hiPSCs）生成表达早期神经、小脑及颗粒细胞相关标志物的细胞。此外，钙成像结果表明存在功能性的人类神经元。研究者可根据需要在两种方案之间进行选择，从而获得更高的灵活性，适用于以下研究方向：（1）特定细胞类型的生成；（2）人类脑发育及其相关结构的建模；（3）适用于单层培养条件的分析（例如，膜片钳记录）；或（4）混合神经培养中的细胞间相互作用。这两种方法操作简便且成本较低，便于刚进入hPSC领域的研究人员使用，或为需要基础hPSC操作流程以进一步探索其他分化路径的研究者提供支持。

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12+Glutamax</td><td>Gibco</td><td>31331-028</td><td>含谷氨酰胺的DMEM/F12培养基</td></tr><tr><td>Neurobasal培养基</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td>神经基础培养基</td></tr><tr><td>N2添加剂</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27添加剂</td><td>Gibco</td><td>17504001</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Imgen</td><td>PT468-B</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸（NEAA）</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>β-巯基乙醇</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>多聚-L-鸟氨酸</td><td>Sigma</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>聚（2-羟乙基甲基丙烯酸酯）</td><td>Sigma</td><td>P3932</td><td>又称Poly-Hema</td></tr><tr><td>层粘连蛋白</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>E8培养基及添加剂</td><td>Gibco</td><td>A1517001</td><td>人多能干细胞培养基及添加剂</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma</td><td>S-5886</td><td></td></tr><tr><td>y-27632（ROCK抑制剂）</td><td>SelleckChem</td><td>S1049-10mg</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D-2650</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex</td><td>Gibco</td><td>A1413302</td><td>适用于人多能干细胞的粘附涂层（PAAC）</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>Gibco</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>0.2 μm滤器</td><td>VWR</td><td>28145-77</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Eppendorf离心管</td><td>VWR</td><td>525-0130</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>21331-020</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>VWR</td><td>83804360</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm封口膜</td><td>Sigma</td><td>PM996</td><td>培养板包裹用</td></tr><tr><td>冻存管</td><td>ThermoFisher</td><td>368632</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco</td><td>12563-029</td><td>基于胰蛋白酶的细胞解离试剂</td></tr><tr><td>定义型胰蛋白酶抑制剂（DTI）</td><td>Gibco</td><td>R-007-100</td><td></td></tr><tr><td>FGF-2</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>FGF-4</td><td>R&amp;D Systems</td><td>100-31</td><td></td></tr><tr><td>FGF-8B</td><td>Peprotech</td><td>100-25</td><td></td></tr><tr><td>视黄酸</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>脑源性神经营养因子</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td></td></tr><tr><td>胶质细胞源性神经营养因子</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>神经营养因子3</td><td>Peprotech</td><td>450-03</td><td></td></tr><tr><td>Smoothened激动剂（SAG）</td><td>Cayman</td><td>11914</td><td>CAS 912545-86-9</td></tr><tr><td>Axiovert 40C显微镜</td><td>Zeiss</td><td></td><td>明场成像显微镜</td></tr><tr><td>Axiocam</td><td>Zeiss</td><td></td><td>明场成像—图像采集</td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5810离心机</td><td>Eppendorf</td><td>521-0996</td><td>细胞培养用离心机</td></tr><tr><td>PBS（磷酸盐缓冲液）</td><td>Braun Medical</td><td>3623140</td><td></td></tr><tr><td>5 ml移液管</td><td>VWR</td><td>612-4950</td><td></td></tr><tr><td>10 ml移液管</td><td>VWR</td><td>612-4951</td><td></td></tr><tr><td>6孔培养板</td><td>VWR</td><td>734-2323</td><td></td></tr><tr><td>12孔培养板</td><td>VWR</td><td>734-2324</td><td></td></tr><tr><td>人胚胎干细胞（hESCs）</td><td>WiCELL</td><td></td><td>品系H01</td></tr></tbody></table>

简化的3d小脑分化方案及可选的2d改良方法

Streamlined 3D Cerebellar Differentiation Protocol with Optional 2D Modification

降低分化方案的复杂性和成本对研究人员至关重要。这一需求也与人们关注的外源性模式形成因子可能对人多能干细胞（hPSC）的脑发育或病理生理模型产生的非预期效应相一致，例如掩盖疾病表型。本文中，我们提出了两种针对hPSC的 cerebellar 分化方案，其设计具有更简化的起始方法、更少的模式形成因子以及更低的材料需求，优于以往的方案。近期，我们开发了培养程序，可生成悬浮的三维（3D）结构，与其他脑类“&#34;类器官&#34;”培养方案一致，包含适用于模拟脑发育的形态结构，如类似脑室下区/脑室区和菱形唇的结构。第二种方案则采用贴壁的二维单层培养程序完成分化，已证明能够生成具有功能性的 cerebellar 神经元，其产物表达 cerebellar 相关标志物，并表现出类似神经元的钙离子内流。综上，这些方案为科研人员提供了适用于不同研究目的的选择，同时也为测试其他类型的简化神经分化方案提供了基础模型。

减少生长因子的二维与三维小脑分化方案的可视化概述 
图1展示了二维和三维小脑分化方案的总体时间线，标明了外源性因子及铺板时间。人类多能干细胞（hPSCs）进行三维小脑分化过程的典型进展如图2所示：hESC系H01在第0天以集落形式开始于无饲养层培养中（图左上）；第2天形成拟胚体（EB）（图中上）；在第14天经视黄酸（RA）和成纤维细胞生长因子8（FGF8）诱导神经分化后，发育为具有明显腔隙的较大细胞聚集体（图右上）；第28天形成大小和形状各异的细胞聚集体（图左下）；第28天单个聚集体中出现更复杂的多种结构（图中下）；至第35天，这些结构继续发生形态学变化（图右下）。人类多能干细胞进行二维小脑分化的典型进展如图3所示：hESC系H01在第0天以集落形式存在于无饲养层培养中（图左上，圆圈标示出hESC集落中已分化细胞的区域）；第2天形成拟胚体（图中上）；第13天经RA和FGF8诱导神经分化后，发育为具有明显腔隙的较大细胞聚集体（图右上）；第14天铺板后以贴壁细胞形式增殖（图左下）；至第35天，在低倍（图中下）和高倍（图右下）放大下均呈现为形态更复杂/成熟的单层细胞。
三维类器官表现出早期神经上皮的标志物和结构 
图2（左下图）和图4展示了在整个培养过程中观察到的三维聚集体形态的异质性，这是由于聚集体的生长和/或成熟速率不同，以及聚集体之间随机融合或分裂所致。尽管存在异质性，每次分化均能产生表达早期神经和神经元标志物的聚集体，包括小脑颗粒细胞标志物ZIC1，如图5中的免疫细胞化学（ICC）染色所示。更重要的是，图5和图6表明，一种简化成分、减少生长因子的三维培养体系足以生成具有与脑发育相关复杂结构的聚集体，例如早期神经上皮和菱唇结构。
二维培养产物表达小脑标志物并具有功能性神经元活性 
尽管二维培养无法重现复杂的三维结构，但其仍可生成表达早期神经及神经元标志物的细胞，包括小脑颗粒细胞标志物 ZIC1，免疫细胞化学染色结果如图7所示。通过RT-PCR进行的基因表达分析（见图8）支持免疫细胞化学染色结果，但早期颗粒细胞标志物ATOH1在不同实验和细胞系之间的表达存在差异。钙成像在二维培养中更易于操作。如图9、补充视频1和补充视频2所示，经电刺激的细胞表现出典型的神经元放电模式相关的钙内流，提示已生成具有功能性的神经元。
<img alt="神经发育时间线示意图；FGF2、FGF8 处理；poly-HEMA、PLO/LAM 培养基质。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1：分化方案的时间线（从分化第 0 天开始）。 实线框表示向培养基中添加特定因子的时间，虚线框表示可选的二维修饰所需的包被处理。FGF2 中，向下的箭头表示较低浓度（4 ng/mL），向上的箭头表示较高浓度（20 ng/mL）。本图经 Holmes 和 Heine10 修改。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="人类胚胎干细胞分化，35天内的显微镜图像，细胞发育阶段。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：3D方案的代表性明场图像。 第0天的hESC集落，第2天的EBs，第14天诱导后的聚集体，第28天不同大小和形态的聚集体（编号1-5），第28天具有独特可识别特征的单个聚集体（由字母a-c标示），以及第35天相同特征的可见变化。比例尺 = 100 µm。该图已根据Holmes和Heine10修改。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="人类胚胎干细胞分化，第0至35天，显微镜图像，细胞发育阶段。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 3"> 
图3：二维分化方案的代表性明场图像。 第0天的人类胚胎干细胞（hESC）集落、第2天的拟胚体（EBs）、第13天诱导后的细胞聚集体、第14天接种后的聚集体，以及第35天成熟后的细胞形态，分别以5倍和20倍放大倍数观察。左上角图中的白色圆圈标示出hESC集落中已分化的细胞区域。比例尺 = 50 µm。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="随时间变化的hESC与hiPSC集落；显微镜图像显示第8天和第35天的细胞生长情况。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4：明场图像显示3D培养中集落大小和结构复杂性的差异。 分别为（A）第8天（hESC）和（B）第35天（hiPSC）的细胞聚集体。后者由三张独立图像拼接而成，以展示完整的聚集体结构。两个聚集体均可能受到较小聚集体合并或部分结构脱落（断裂）的影响。比例尺 = 200 µm。该图改编自Holmes和Heine10。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="神经组织免疫荧光，DAPI，PAX6，TBR2，DCX，NeuN，KIRREL2，ZIC1 标记物，显微镜。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 5"> 
图 5：3D 产物的免疫细胞化学图像显示相关标记物与结构。 在培养第 35 天，3D 产物表现出以下特征：PAX6（绿色）和 TBR2（红色）位于类神经玫瑰花结样结构的腔面（第一行）；DCX（绿色）和 NeuN（红色）从类脑室区（VZ）外缘向外扩散（第二行）；KIRREL2（第三行左侧），一种与小脑神经上皮相关的标记物；以及 ZIC1（第三行右侧），一种与小脑颗粒细胞相关的标记物。本实验使用四种不同的人多能干细胞（hPSC）系重复多次：hESC 系 H01（n = 5），以及 iPSC 系 hvs88（n = 4）、hvs60（n = 3）和 hvs51（n = 1）。箭头指示类菱脑唇（RL）结构。比例尺 = 100 µm。该图改编自 Holmes 和 Heine10。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
<img alt="脑类器官免疫荧光，PAX6/TBR2/DAPI标记，显微镜图像，干细胞研究" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图6"> 
图6：三维产物中大规模的室管膜区样结构。 在培养第35天，人胚胎干细胞分化形成的细胞团表达PAX6（绿色）和TBR2（红色），这两种标记物通常与脑室区（VZs）和脑室下区（SVZs）内的早期神经元相关。 体内.（顶部）星号（*）标记类脑室区（VZ样区域）的顶端侧，该区域沿类器官边缘分布，方括号表示VZ/SVZ的深度或分层。（中部）合并信号显示PAX6+/TBR2-细胞呈散在分布，并向VZ的右上端逐渐增大。（底部）中部图中矩形框所示区域的高倍放大图像。比例尺 = 100 µm该图已根据 Holmes 和 Heine 的内容修改10. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="神经分化荧光显微镜图像；hESCs，hiPSCs；ZIC1，TAG1 标记物；细胞分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 7"> 
图7：2D分化产物的免疫细胞化学图像显示相关标记物表达。 在培养第35天，来自hESCs（上排）和hiPSCs（下排）的2D分化产物中可见表达颗粒细胞标记物ZIC1和迁移性小脑神经元标记物TAG1的细胞（左列）；以及表达神经元标记物神经丝蛋白（NF）和TAG1的细胞（右列）。比例尺 = 50 µm。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="蛋白质表达分析、Western blot结果、hESC与hiPSC比较、ZIC1、ATOH1标记物。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig8.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图8"> 
图8：二维培养产物的RT-PCR结果。 在二维培养方案结束时，对hESC系H01（上排）和hiPSC系hvs60（下排）进行mRNA表达分析，通过凝胶电泳检测以下标记物：颗粒细胞标记ZIC1、颗粒细胞标记ATOH1、迁移性小脑神经元标记TAG1、浦肯野细胞标记Calbindin（CALB）、电压门控钙通道CACNA1A（C-1A）、CACNA1E（C-1E）、γ-氨基丁酸（GABA）B受体1（G-Br1），以及看家基因EIF4G2。
<img alt="10Hz刺激下hESC的钙离子内流；荧光显微镜图像及图表结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig9.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图9"> 
图9：二维分化产物的钙成像/分析。 在培养第35天，将hPSC分化产物与Fluor5染料孵育后，在显微镜下记录2分钟。在30秒时，细胞接受10 Hz频率的电刺激，持续10秒。（A）静态图像显示hESC在0秒（左图）和电刺激开始后30秒（右图）的情况。箭头指示用于钙离子内流分析的兴趣区域（ROI）。（B）图形分析显示ROI的相对荧光强度随时间的变化（荧光变化 = (F-F0)/F0，其中F0 = (∑F1-n)/n），在刺激前、刺激中和刺激后均出现类似神经元的尖峰信号。黑色条形表示电刺激持续时间。比例尺（白色）= 50 µm。hESC的完整记录（如图所示）和一个hiPSC细胞系的记录（未显示）分别见于补充视频1和补充视频2。视频为AVI格式，播放速度为4倍速。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig9large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充视频 1：人胚胎干细胞系 H01 的二维分化产物的钙成像视频。在培养第 35 天，将人胚胎干细胞系 H01 的分化产物与 fluor5 染料共孵育后，在显微镜下记录 2 分钟的钙成像。在 30 秒时，细胞以 10 Hz 频率进行 10 秒的电刺激。图像采集速度为每秒 2 帧，后期处理为每秒约 7 帧的 AVI 视频，最终生成时长约 30 秒、速度约为原速 4 倍的视频。<a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56888/figS1_hESC_stim@10Hz.avi">请点击此处下载该文件。</a>
补充视频 2：hiPSC 系 hvs51 来源的二维分化产物的钙成像视频。在培养第 35 天，将 hiPSC 系 hvs51 的分化产物与 fluor5 染料孵育后，在显微镜下记录 2 分钟。在第 30 秒时，细胞以 10 Hz 频率进行 10 秒的电刺激。记录速率为每秒 2 帧，后处理为每秒约 7 帧的 AVI 视频，最终视频时长约 30 秒，播放速度约为实际速度的 4 倍。<a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56888/figS2_hiPSC_stim@10Hz.avi">请点击此处下载该文件。</a>

我们描述了一种简化的hPSCs三维分化方案，该方案使用成分明确的培养基并减少生长因子，能够生成具有早期神经上皮结构且表达小脑相关标志物的细胞聚集体；此外还提供一种可选的二维改良方法，通过单层培养分化细胞以获得功能性神经元。

简化的3D小脑分化方案及可选的2D改良方法

降低分化方案的复杂性和成本对研究人员而言至关重要。这一需求与人们对潜在非预期...的担忧相一致。

这些分化培养的总体目标是在二维或三维环境中生成小脑细胞谱系。这些方法可利用患者来源的干细胞，帮助回答有关儿童脑部疾病的新进展或潜在疾病机制的基础科学问题。该技术的主要优势在于起始和维持操作简单，所需因子较少，并可作为测试更复杂神经分化方案的基础。演示本实验操作的是我实验室的技术员 Lisa。采用改良的 G 法进行分化时，首先将所需体积的神经维持培养基转移至无菌离心管中，并添加 4 纳克/毫升 FGF2 和 10 微摩尔 ROCK 抑制剂。然后，将培养基离心管置于室温或 37°C 水浴中保温

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Developmental Biology

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