Name: rna 干扰和热休克诱导转录因子表达在重编程生殖细胞到神经元中的应用C. 线虫 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: 学习利用RNA干扰和热休克诱导技术在秀丽隐杆线虫中将生殖细胞重编程为神经元的方法。该技术结合转录因子CHE-1过表达与LIN-53基因沉默，为研究细胞命运转换机制及再生医学应用提供可靠的活体实验模型。

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感谢 Alina El-Khalili 和 Martina Hajduskova 提供的技术支持。感谢 Tursun 研究组成员对本文稿的评论。本工作由欧洲研究理事会（ERC-StG-2014-637530）和欧洲研究理事会（ERC CIG PCIG12-GA-2012-333922）资助，并得到亥姆霍兹协会下属马克斯·德尔布吕克分子医学中心的支持。

本研究中涉及动物护理的所有方法均已获得德国柏林州立卫生与消费者保护局（LaGeSo Berlin）的批准
1. 溶液配制
<ol>
	<li>NGM-琼脂平板（1 L）
	<ol>
		<li>加入 3 g NaCl、2.5 g 蛋白胨培养基（例如 Bacto-Peptone）和 20 g 琼脂。高压灭菌后，加入 1 mL 胆固醇（95% 乙醇中的储存液浓度为 5 mg/mL）、1 mL 1 M MgSO₄4，1 mL 1 M CaCl₂，25 mL 1 M K₂PO₄4，以及1 mL两性霉素B（2.5 mg/mL 储液）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>NGM-琼脂RNAi平板（1 L）
	<ol>
		<li>加入 3 g NaCl、2.5 g 蛋白胨培养基和 20 g 琼脂。高压灭菌后，加入 1 mL 胆固醇（5 mg/mL 溶于 95% EtOH 的储备液）、1 mL 1 M MgSO₄4，1 mL 1 M CaCl₂，25 mL 1 M K2PO4，1 mL 两性霉素B（2.5 mg/mL 储液），1 mL 1 M IPTG，以及1 mL 羧苄青霉素（50 mg/mL）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>LB琼脂（1 L）
	<ol>
		<li>加入10 g蛋白胨培养基、5 g酵母提取物、5 g NaCl、20 g琼脂、10 mL 1 M Tris（pH 8.0），加H20至1 L。高压灭菌后，加入1 mL 50 mg/mL羧苄青霉素和2.5 mL 5 mg/mL四环素。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>LB培养基（1 L）
	<ol>
		<li>加入10 g蛋白胨培养基、5 g酵母提取物、5 g NaCl和10 mL 1 M Tris（pH 8.0）。加入H20 到 1 升。高压灭菌后&#160; 加入1 mL浓度为50 mg/mL的羧苄青霉素。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>M9缓冲液（1 L）
	<ol>
		<li>加入6.0 g Na2HPO4，3 g KH2PO4，5 g NaCl 和 50 mg 明胶。使用前加入 1 mL 1 M MgSO₄4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>漂白溶液（10 mL）
	<ol>
		<li>加入1 mL NaClO和2 mL 5 N NaOH，加水至10 mL。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. RNAi 平板的制备
注意：C. elegans 通常在含有 7.5 mL 线虫生长培养基琼脂（NGM-琼脂）的 6 cm 培养皿中进行实验室培养10,11。本方案针对在 15 °C 条件下培养的线虫进行了优化。制备 NGM 培养皿时，应采用标准无菌操作技术，以防止真菌和细菌污染。以下是制备添加了 RNAi 试剂的 NGM 培养皿的方案。
<ol>
	<li>制备含有1 mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）和50 µg/mL羧苄青霉素的6 cm NGM-琼脂RNAi平板，于室温避光条件下干燥24–48小时12.
	<ol>
		<li>将RNAi平板置于4 °C避光保存。若超过14天，请勿使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>选择RNAi细菌（Escherichia coli HT115) 含有L4440质粒的克隆 lin-53 来自现有RNAi文库的冻存甘油菌中的基因DNA序列13 在含有50 µg/mL羧苄青霉素和12.5 µg/mL四环素的LB-琼脂平板上，采用三区划线法接种细菌，于37 °C过夜培养。12该克隆可实现异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）依赖性的蛋白表达 lin-53 细菌中的dsRNA
	<ol>
		<li>此外，培养含有L4440质粒但无任何基因序列的RNAi细菌，作为空载体对照14.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第二天，从 lin-53 或使用200 µL移液枪头将空载体LB-琼脂平板上的菌落分别接种至含有2 mL液体LB培养基的独立培养管中14 添加50 µg/mL羧苄青霉素。在37 °C下过夜培养，直至培养物在600 nm处的光密度（OD）达到0.6 – 0.8。使用分光光度计测定OD值。15. 
	注意：与用于从甘油菌种划线培养细菌的LB琼脂平板不同，液体LB培养基中不应含有四环素，因为在诱导过程中加入四环素会导致RNAi效率降低 12</li>
	<li>加入每种细菌培养物各 500 µL（lin-53 将质粒（或空载体）使用多通道移液器加入6 cm NGM-琼脂RNAi平板中。将平板盖上盖子，在室温避光条件下孵育过夜以干燥。在此期间，NGM平板中的IPTG将诱导细菌产生dsRNA。
	<ol>
		<li>每次实验每种细菌培养物至少使用3个培养皿。这将为每次实验提供3个技术重复。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将含有细菌的干燥NGM-琼脂RNAi平板置于4 °C避光保存，最多可保存两周。</li>
</ol>
3. C. elegans 菌株 BAT28 的制备
<ol>
	<li>维持线虫品系 BAT288 含有转基因 otIs305 [hsp-16.2prom::che-1, rol-6(su1006)] 和 ntIs1 [gcy-5prom::gfp在15 °C条件下，使用标准NGM琼脂平板培养OP50细菌。 
	注意：有关线虫培养的详细方案，请参见10。该 rol-6(su1006) 是一种显性等位基因，常用作表型注射标记16 导致典型的滚动运动。它被用于 otIs305 转基因追踪 hsp-16.2prom::che-1.
	<ol>
		<li>始终将 BAT28 菌株保存在 15 °C 环境中，以防止其过早激活 hsp-16.2prom::che-1 转基因。在处理该品系时，应尽可能减少暴露于高于15 °C的温度环境。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为了进行线虫的年龄同步化，采用漂白法17.
	<ol>
		<li>用 900 µL M9 缓冲液冲洗含有 BAT28 成虫和卵的 6 cm NGM 琼脂平板。在 900 × g 离心 1 分钟以沉淀线虫。弃去上清液。</li>
		<li>加入 0.5–1 mL 漂白液，振荡试管约 1 分钟，直至成虫开始破裂。使用标准体视显微镜进行观察。</li>
		<li>以 900 × g 离心 1 分钟收集虫体，弃上清液。</li>
		<li>将800 µL M9缓冲液加入线虫沉淀中，重悬后在900 x g下离心，重复洗涤3次。</li>
		<li>将清洗后的卵置于接种了OP50细菌的新鲜NGM平板上。在OP50细菌上于15 °C培养经漂白处理的种群，直至其发育至L4阶段（约4天）。L4期幼虫可通过虫体腹侧中部约一半位置处的白色斑块进行识别。18 使用标准体视显微镜。 
		注意：为了在耗尽时实现生殖细胞向神经元转化的表型 lin-53，需要在亲代（P0）中将其耗尽。表型转换的评分在下一代（子代F1）中进行。为实现耗尽 lin-53 在P0代，L4期动物即开始接受RNAi处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>手动使用铂金丝将50条L4期线虫转移至不含任何细菌的NGM平板上，每组重复一次，使线虫远离任何被转移的OP50细菌。让线虫在平板上移动约5分钟。使用先前接种于NGM-琼脂RNAi平板上的细菌 lin-53 将RNAi细菌（或空载体对照）转移至相应的RNAi平板。
	<ol>
		<li>避免将OP50细菌转移到实际的RNAi平板上。操作需迅速，以尽量减少菌株在高于15 °C温度下的暴露时间。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在15 °C下将线虫孵育于NGM-琼脂RNAi平板上，约7天，直至线虫的F1后代发育至L3–L4阶段。F1后代体型较大且较粗，可明显与P0代个体区分。
	<ol>
		<li>在体视显微镜下观察F1代线虫是否表现出外翻的阴门（protruding vulva）表型pvul）表型，如图所示 图1. 针对的RNAi lin-53 具有多效性作用，并导致 pvul 表型，可用于评估针对RNAi的干预效果 lin-53 已取得成功。 
		注意：&#160; RNAi 靶向 lin-53 也可能导致F1代胚胎死亡。若在动物发育至L3至L4阶段之前将培养板暴露于高于15 °C的温度下，该效应会增强。死亡胚胎表现为发育停滞且无法孵化。</li>
		<li>在避光条件下孵育平板，因为IPTG对光敏感。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 诱导生殖细胞重编程
<ol>
	<li>将含有经 lin-53 和空载体 RNAi 处理的 F1 后代的 RNAi 培养板在避光条件下于 37 °C 孵育 30 分钟，以激活 CHE-1。使用带通风功能的培养箱，因其可实现更高效的热激。</li>
	<li>将热激后的线虫在室温下避光恢复 30 分钟，然后将培养板在避光条件下于 25 °C 过夜孵育。</li>
	<li>使用配备荧光光源的常规体视显微镜，在 GFP 滤光片下观察线虫中体区域由 gcy-5prom::gfp 驱动的信号，如图 2所示。显微镜 GFP 信号设置：激发光最大波长为 488 nm，发射光最大波长为 509 nm。</li>
	<li>通过将中体区域显示 GFP 信号的线虫置于含琼脂垫的显微镜载玻片上，评估生殖细胞向神经元转化的程度19。
	<ol>
		<li>统计显示生殖细胞向神经元转化的个体数量与无信号个体数量，以评估表型外显率。通常，在 lin-53 缺失条件下，约 30% 的个体在生殖系中表现出明确的 GFP 信号，而在空载体 RNAi 条件下，不超过 5% 的个体在生殖系中表现出弥散性 GFP 信号。&#160;</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争利益。

尽管使用转基因 C. elegans 菌株 BAT28 及针对 lin-53 的 RNAi 所描述的实验方案较为直接，但其中多个步骤至关重要，以确保实现预期的生殖细胞向神经元重编程结果。菌株 BAT28 在实验前必须始终保存在 15 °C 环境中。在菌株操作与维护过程中，应尽可能减少暴露于高于 15 °C 的温度下的时间。正确的热激条件非常重要，因为 che-1 过表达若诱导不足，将无法实现生殖细胞向 ASE 神经元的转化。这一情况可通过本方案中所述的方法检测表型外显率来判断。过度的热激处理可能导致线虫死亡。例如，放置在静态空气培养箱内壁附近或底部的培养板常会经历过度加热。因此，建议使用通风式恒温培养箱。此外，热激诱导的时间点尤为关键，因为在 L3 期之前的幼虫阶段过早过表达 che-1，可能导致 gcy-5prom::gfp 在其他体区（如阴门部位）异位表达（图 3）9。此外，过度热激还可通过空载体 RNAi 动物中的表型外显率进行判断，其值不应超过 5%，同时需注意其他组织（尤其是肠道）出现的增强自荧光现象。
偶尔，RNAi 细菌可能会失去高效产生靶基因 dsRNA 的活性。遗憾的是，在 RNAi 实验之前无法检测到这种情况。此时，应按照方案第 2 节所述，从甘油菌中重新划线培养新鲜菌落。如果仍未观察到由 RNAi 引起的多效性表型（例如，成功对 lin-53 基因进行 RNAi 所导致的 pvul 表型），则应对相应细菌进行质粒 DNA 提取，并使用含有 lin-53 序列的 L4440 质粒重新转化 HT115 感受态细菌。
重要的是，BAT28 品系具有由注射标记质粒 pRF4 引起的 Roller 表型，该质粒在将 hsp-16.2prom::che-1 DNA 构建体转入动物基因组时使用。偶尔，动物会失去 Roller 表型，这可能表明 hsp-16.2prom::che-1 转基因发生了沉默。为正确维持 BAT28 品系，应挑选 10 只 Roller 表型个体转移至新鲜培养板，并在传代过程中持续选择具有 Roller 表型的个体进行扩繁。
该方案的应用仅限于F1代RNAi实验，即亲代（P0代）未暴露于 lin-53 RNAi 不会显示生殖细胞向神经元的转化，原因是存在母体拯救效应4. Ciosk 及其同事描述了一种将生殖细胞转化为神经元的替代方法15 使用RNAi敲低 gld-1 和 mex-3 未过表达转录因子的情况下获得。然而，所获得的神经元并不属于特定类型的神经元，且在RNAi介导的耗竭条件下，生殖细胞也会转化为类肌细胞 gld-1 和 mex-315此前已证明，针对RNAi lin-53 在过表达Pitx型同源结构域转录因子UNC-30的条件下，允许生殖细胞转化为类GABA能神经元细胞16 而不是 CHE-14对于未来的研究方向，可以测试不同的命运诱导型转录因子是否 lin-53 耗竭的生殖细胞可转化为特定神经元以外的其他细胞类型。在此背景下，肌源性bHLH转录因子HLH-1（哺乳动物MyoD的同源物）的过表达17，可诱导生殖细胞转化为肌肉细胞 lin-53 RNAi5. 生殖细胞在特定体细胞类型重编程过程中已建立的重编程 lin-53 RNAi 及适当命运诱导型转录因子的过表达可用于多种不同的遗传筛选。此类抑制性或增强性筛选有助于解析在细胞命运转变过程中发挥作用的调控通路。

通过异位表达转录因子（TF）实现细胞命运重编程，例如成肌转录因子 MyoD 在过表达时可直接将成纤维细胞转化为类肌肉细胞1，这一领域数十年来一直是研究热点。然而，由于存在维持细胞身份的保护机制，分化后的细胞通常对此类重编程过程具有抗性。生殖细胞也表现出类似的保护程度，其内在机制常构成屏障，阻止在过表达细胞命运诱导性转录因子时将生殖细胞转化为其他细胞类型。通常，表观遗传调控（如组蛋白修饰和染色质结构）会阻碍细胞命运的转换2,3。我们此前在 C. elegans 中应用反向遗传学方法，通过 RNAi 沉默筛选，鉴定了维持细胞身份并从而抑制生殖细胞向神经元重编程的关键因子4。具体而言，多梳抑制复合物 2（PRC2）以及高度保守的组蛋白伴侣 LIN-53（在人类中为 CAF-1/RBBP4/7）能够阻止 C. elegans 中生殖细胞直接转化为特定体细胞类型，例如谷氨酸能味觉神经元4,5。为了鉴定这些抑制生殖细胞重编程的屏障因子，我们使用了携带热休克诱导型锌指转录因子 CHE-1 的转基因线虫。CHE-1 正常情况下仅在 C. elegans 的两个头部神经元中表达，决定被称为 ASE 的谷氨酸能味觉神经元的命运6。ASE 神经元的命运可通过 ASE 特异性荧光报告基因 gcy-5prom::gfp 的表达进行可视化观察。GCY-5 是一种仅在 ASE 右侧神经元中表达的化学感受器7。当通过 RNAi 沉默 lin-53 并通过热休克诱导 CHE-1 的广泛异位表达时，可在体内将生殖细胞转化为神经元4,5。值得注意的是，RNAi 处理的时间至关重要：只有在成虫期（P0 代）接受 lin-53 RNAi 处理的线虫，其 F1 子代的生殖系才具备向神经元重编程的许可性4。
上述所述的生殖细胞转化为神经元的实验步骤 秀丽隐杆线虫 可用于研究多种生物学问题，例如信号通路在细胞命运重编程中的作用。例如，我们利用在RNA干扰条件下由CHE-1诱导的生殖细胞向ASE神经元的重编程 lin-53 为了研究Notch信号通路在生殖细胞重编程过程中的作用8通过执行双重RNAi共同耗竭 lin-53 组蛋白去甲基化酶编码基因 utx-1 我们发现Notch信号通路通过在生殖系中激活UTX-1的表达，拮抗PRC2介导的基因沉默8这一发现表明，本方案中描述的生殖细胞转化为神经元的过程可用于在完整生物体中，以及在不同发育和环境条件下，研究细胞重编程等复杂的生物学过程。此外，该方法还为进一步通过过表达不同的命运决定转录因子来挑战生殖细胞、研究其在限制细胞可塑性中的作用提供了可能。9，或评估其诱导生殖细胞重编程为其他细胞类型的潜能 体内.
尽管哺乳动物组织培养也可用于研究细胞命运重编程的不同方面，但培养条件下生长的细胞在模拟信号通路状态方面的能力有限，无法与完整生物体相比。因此，秀丽隐杆线虫（C. elegans）是一种多功能的模型，可用于在体内（in vivo）研究Notch信号通路等各类生物学过程在重编程中的作用。此外，该模型还适用于遗传筛选，易于维护和进行低成本的遗传改造。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;化学试剂&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>琼脂，Kobe I</td><td>Roth</td><td>5210.1</td><td></td></tr><tr><td>蛋白胨&amp;nbsp;</td><td>A. Hartenstein GmbH</td><td>211 677</td><td>Peptone Media&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>酵母提取物&amp;nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A1552,0100</td><td></td></tr><tr><td>两性霉素B</td><td>USBiological</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Merck Biosciences</td><td>208290</td><td></td></tr><tr><td>胆固醇</td><td>Roth</td><td>8866.2</td><td></td></tr><tr><td>明胶</td><td>Roth</td><td>4275.3</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma</td><td>15502-10G</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Roth</td><td>T875.2</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Roth&amp;nbsp;</td><td>3904.2</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>VWR</td><td>25,163,364</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Roth</td><td>P030.1</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Roth</td><td>9265.1</td><td></td></tr><tr><td>NaClO</td><td>Roth</td><td>9062.3</td><td></td></tr><tr><td>NaOH (5 N)</td><td>Roth&amp;nbsp;</td><td>KK71.1</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Roth</td><td>AE15.2</td><td></td></tr><tr><td>羧苄青霉素</td><td>Roth</td><td>634412</td><td></td></tr><tr><td>四环素</td><td>Roth</td><td>2371.2</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;培养箱&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>培养箱&amp;nbsp;</td><td>New Brunswick Scientific C24</td><td>M1247-0052</td><td>用于热激</td></tr><tr><td>培养箱&amp;nbsp;</td><td>Sanyo MIR-5</td><td>5534210</td><td>用于在15 &amp;deg;C 或 25 &amp;deg;C 下维持线虫品系</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;显微镜&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>M205 FA</td><td>Leica</td><td></td></tr><tr><td>显微镜（成像）+ 相机</td><td>Axio Imager 2</td><td>Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>显微镜（成像）+ 相机</td><td>Sensicam</td><td>PCO</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>SMZ745</td><td>Nikon</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;细菌菌株&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Escherichia coli HT115&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>F-，mcrA，mcrB，IN(rrnD-rrnE)1，rnc14::Tn10（DE3溶原：lavUV5&lt;br/&gt; 启动子-T7 RNA聚合酶）（IPTG可诱导T7聚合酶）（RNA酶&lt;br/&gt; III缺失）。</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Escherichia coli OP50&amp;nbsp;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>尿嘧啶营养缺陷型大肠杆菌菌株</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;线虫菌株&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;BAT28:&lt;/strong&gt; &lt;em&gt;otIs305 (hsp16.2prom::che-1::&lt;br/&gt; 3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V.&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>由OH9846经与N2回交4次获得</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;RNAi克隆&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>lin-53</td><td>SourceBioscience</td><td>ID I-4D14</td><td>Ahringer文库16B07 ChromI, K07A1.12</td></tr><tr><td>空载体：L4440</td><td>Addgene&amp;nbsp;</td><td>#1654</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;其他&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>线虫挑取针&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>使用巴斯德吸管和铂丝自制</td></tr></tbody></table>

在 c. elegans 中应用 rnai 与热激诱导的转录因子表达将生殖细胞重编程为神经元

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

研究特定细胞类型在转变其细胞身份过程中的细胞生物学事件，可为维持和保护细胞身份的机制提供重要见解。在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans，C. elegans）中将生殖细胞转化为特定神经元的过程，是开展遗传筛选以解析保护已建立细胞身份的调控通路的有力工具。将生殖细胞重编程为一种称为ASE的特定神经元类型，需要利用转基因动物实现锌指转录因子（TF）CHE-1的广泛过表达。内源性CHE-1仅在头部两个神经元中表达，对于决定谷氨酸能ASE神经元的命运至关重要，该命运可通过gcy-5prom::gfp报告基因轻松可视化。一种包含热激启动子驱动的che-1基因表达结构的转基因，可在热激处理后使CHE-1在整个动物体内广泛异位表达。对染色质调控因子LIN-53进行RNA干扰（RNAi），并结合热激诱导的che-1过表达，可导致生殖细胞重编程为类似ASE神经元的细胞。本文详细描述了实现生殖细胞向神经元成功转化所需的特定RNAi操作步骤以及转基因动物热激处理的适当条件。

如图1所示，表现出pvul表型的F1代动物表明lin-53 RNAi已成功应用。这些动物在热激诱导che-1过表达后，其生殖细胞易于转化为类似ASE神经元的细胞，如图2所示。与在对照空载体RNAi上生长的线虫相比，经lin-53 RNAi处理的线虫在热激后于25 °C过夜培养，会在身体中部区域显示出异位的GFP信号，如前所述4,8。在落射荧光显微镜下进一步观察这些线虫可发现，显示GFP信号的细胞还表现出神经元细胞典型的神经突样突起（图2B，白色箭头）。如果lin-53的RNAi干扰未成功，或热激条件不适宜，则GFP信号将类似于对照RNAi处理动物中的信号（图2）。重要的是，应避免在动物发育至中期L3阶段之前通过热激诱导che-1的过表达。若在过早的发育时期诱导che-1过表达，动物可能在身体其他区域（如正在发育的外阴）出现ectopic gcy-5prom::gfp表达，如图313所示。
<img alt="秀丽隐杆线虫RNAi实验，显微图像显示对照组和lin-53 RNAi处理样本。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56889/56889fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1： 针对 lin-53 的RNAi引起的突出性阴门（pvul）表型。（上图）来自对照组或lin-53 RNAi处理母代的F1子代L4/年轻成虫阶段线虫的微分干涉差（DIC）图像。比例尺 = 20 µm。（下图）经lin-53 RNAi处理的动物表现出突出性阴门（pvul）表型（黑色箭头）。pvul表型证实针对lin-53的RNAi处理成功。比例尺 = 20 µm。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56889/56889fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于基因表达分析的秀丽隐杆线虫RNAi实验，采用微分干涉差显微镜（DIC）与GFP荧光成像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56889/56889fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：生殖细胞成功重编程为神经元的线虫。（A）在空载体上培养的BAT28品系动物，在热激诱导che-1过表达后，生殖系中未显示GFP信号。白色虚线标出线虫轮廓。比例尺 = 20 µm。（B）与在空载体上培养的BAT28品系对照组相比，在lin-53 RNAi培养基上生长的RNAi动物在身体中部区域显示出gcy-5prom::gfp信号。在63X放大倍数下拍摄的身体中部GFP信号图像显示GFP阳性细胞具有突起结构（白色箭头）。这一形态学特征表明生殖细胞已转化为类似ASE神经元的细胞。白色星号标记由肠道产生的自发荧光。所有图像均使用落射荧光显微镜在20X和63X放大倍数下采集。白色虚线标出线虫轮廓。比例尺 = 20 µm。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56889/56889fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="在秀丽隐杆线虫中诱导hsp::che-1表达，微分干涉相差（DIC）及gcy-5prom::gfp荧光显微图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56889/56889fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 3"> 
图3： 早期阶段线虫出现异位GFP表达。 在空载体RNAi细菌上培养的BAT28品系动物，在早期幼虫阶段（如L2期）经热激诱导过表达che-1后，可在虫体中部区域观察到GFP信号（白色星号标记）。这些信号并非源于生殖细胞重编程。白色虚线勾勒出线虫轮廓。比例尺 = 20 µm。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56889/56889fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本方案描述了如何研究细胞命运转换过程中的细胞活动 体内秀丽隐杆线虫利用转基因动物，通过热激启动子驱动神经元命运诱导型转录因子 CHE-1 的过表达，并结合RNAi介导的染色质调控因子 LIN-53 的耗竭，可观察到生殖细胞向神经元的重编程过程 体内.

在 C. elegans 中应用 RNAi 与热激诱导的转录因子表达将生殖细胞重编程为神经元

研究特定细胞类型身份转换过程中的细胞生物学事件，可为维持细胞命运的机制提供重要见解……

本实验的总体目标是在秀丽隐杆线虫（C.elegans）中诱导生殖细胞转化为神经元。该方法有助于研究信号通路或表观遗传学等生物学过程在细胞命运重编程调控中的作用。本视频所述方法的主要优势在于，可在活体动物中通过过表达一种决定细胞命运的转录因子，来诱导生殖细胞发生转化。与此同时，可以进行遗传筛选（例如RNAi筛选），以鉴定参与调控细胞重编程的新型因子。该技术的应用前景涉及再生治疗，因为这种体内方法可用于在不同的发育和环境条件下研究细胞重编程过程。该方法的可视化演示至关重要，因为重编程步骤难以掌握。由于在敲低 lin-53 后，生殖细胞转化为神经元的表型仅在严格控制的条件下才会发生。对于 RNAi 平板，需准备含有 IPTG 和羧苄青霉素的六厘米 NGM 琼脂平板。在避光条件下于室温干燥 24 至 48 小时。然后将其转移至 4 摄氏度保存最多 14 天。接下来，用携带 lin-53 基因的 L4440 质粒的 RNAi 细菌克隆，在含有羧苄青霉素和四环素的选择性平板上划线接种。采用三区划线法进行划线接种，并确保同时接种空载体对照。随后，在37摄氏度条件下将平板培养过夜。次日，挑选至少三个单菌落，分别接种于含有2毫升LB培养基的独立培养管中，LB培养基中需添加羧苄青霉素，但不添加四环素。每种条件需准备三个健康的培养物。接下来，在37摄氏度下过夜培养，直至培养物在600纳米处的光密度达到0.6至0.8。然后，将每种细菌培养物各500 µL加入六厘米NGM琼脂RNAi平板中。将培养板在避光条件下于室温孵育过夜。本方案针对在15摄氏度下培养的BAT28品系线虫优化，在此温度下外源基因最稳定。品系遗传学的详细信息见正文。线虫的年龄同步至关重要。采用漂白法进行处理。用800微升M9缓冲液洗涤含有成虫和卵的六厘米NGM琼脂平板。然后通过离心收集线虫，弃去上清液。接下来，向线虫中加入0.5至1毫升漂白液。在体视显微镜下观察线虫，同时振荡离心管，直至成虫开始破裂，然后收集卵。随后将卵与废弃物分离。首先离心试管，并弃去上清液。然后用 800 µL M9 缓冲液洗涤组织沉淀，共洗涤三次。每次洗涤之间务必通过离心收集组织沉淀。现在，将清洗后的卵转移到接种了OP50细菌的新鲜NGM平板上。短暂检查胚胎是否成功分离并转移至NGM平板上。在15摄氏度条件下培养线虫。为了在lin-53缺失时实现生殖细胞向神经元的转化，缺失处理需从亲代开始。为缺失lin-53，对L4期动物进行RNAi处理。每组重复实验手动转移50只L4线虫至不含细菌的NGM RNAi平板中。使用铂金丝。L4期线虫可通过其腹侧约一半位置处的白色斑块来识别。现在，将线虫在黑暗条件下于15摄氏度培养约七天。IPTG 对光敏感。当 F1 子代发育至 L3 和 L4 阶段时，将其与体型更大、更粗壮的亲代个体分离。此时，筛选 F1 中具有突出阴门表型的个体，该表型表明针对 lin-53 的 RNA 干扰已成功实现。RNAi 活性也可能导致致死效应，且在超过 15 摄氏度时致死率升高。为激活 che-1 并在 F1 子代中诱导生殖细胞向神经元的转化，需将线虫置于黑暗条件下，在 37 摄氏度进行 30 分钟的热激处理。请使用带通风口的培养箱，因其可实现更高效的热激。热激后，将培养皿置于 25 °C 黑暗条件下过夜培养。在动物发育至中期 L3 阶段之前，避免通过热激诱导 che-1 的过表达非常重要，否则可能导致 che-1 蛋白在非靶向组织中表达。第二天，设置荧光光源和GFP滤光片，以检测动物中段区域由转基因产生的荧光。为评估表型外显率，计算发出荧光信号的动物所占比例。通常情况下，约有30%的动物会显示出明显的GFP信号。相比之下，在携带空载体RNAi的动物中，超过5%的群体中甚至无法观察到生殖系内弥散的信号。表现出突出阴门表型的F1代动物说明lin-53 RNAi成功发挥作用。在这些动物中，经热激诱导che-1后，生殖细胞转化为类似ASE神经元的细胞是常见现象。仔细观察可发现，来自生殖系细胞的神经元样突起，这是生殖细胞来源神经元的典型特征。相比之下，空载体对照组中GFP的表达极低，最多仅为弥散状。这些动物的生殖细胞缺乏神经元样特征。在诱导 che-1 过表达时，如果动物处于过早的发育阶段，常常会在身体其他区域（如正在发育的外阴）出现异位的转基因表达。观看本视频后，您应能充分理解如何精心设计并实施利用活体线虫进行的实验，以将生殖细胞重编程为神经元。本视频中描述的方法将使您能够进一步研究多种不同因素在细胞重编程调控中的作用。一旦掌握，该实验程序可在10天内完成。在进行实验时，诱导重编程前需仔细筛选动物，并将BAT28菌株维持在15摄氏度。在完成该操作后，可进一步采用双RNA干扰等其他方法，以探讨更多科学问题，例如：在细胞命运转变过程中起关键作用的潜在机制是什么？

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