在 C. elegans 中应用 RNAi 与热激诱导的转录因子表达将生殖细胞重编程为神经元
2018年1月1日
本方案描述了如何研究细胞命运转换过程中的细胞活动 体内秀丽隐杆线虫利用转基因动物，通过热激启动子驱动神经元命运诱导型转录因子 CHE-1 的过表达，并结合RNAi介导的染色质调控因子 LIN-53 的耗竭，可观察到生殖细胞向神经元的重编程过程 体内.
本实验的总体目标是在秀丽隐杆线虫（C.elegans）中诱导生殖细胞转化为神经元。该方法有助于研究信号通路或表观遗传学等生物学过程在细胞命运重编程调控中的作用。本视频所述方法的主要优势在于，可在活体动物中通过过表达一种决定细胞命运的转录因子，来诱导生殖细胞发生转化。
与此同时，可以进行遗传筛选（例如RNAi筛选），以鉴定参与调控细胞重编程的新型因子。该技术的应用前景涉及再生治疗，因为这种体内方法可用于在不同的发育和环境条件下研究细胞重编程过程。
该方法的可视化演示至关重要，因为重编程步骤难以掌握。由于在敲低 lin-53 后，生殖细胞转化为神经元的表型仅在严格控制的条件下才会发生。对于 RNAi 平板，需准备含有 IPTG 和羧苄青霉素的六厘米 NGM 琼脂平板。
在避光条件下于室温干燥 24 至 48 小时。然后将其转移至 4 摄氏度保存最多 14 天。接下来，用携带 lin-53 基因的 L4440 质粒的 RNAi 细菌克隆，在含有羧苄青霉素和四环素的选择性平板上划线接种。
采用三区划线法进行划线接种，并确保同时接种空载体对照。随后，在37摄氏度条件下将平板培养过夜。次日，挑选至少三个单菌落，分别接种于含有2毫升LB培养基的独立培养管中，LB培养基中需添加羧苄青霉素，但不添加四环素。
每种条件需准备三个健康的培养物。接下来，在37摄氏度下过夜培养，直至培养物在600纳米处的光密度达到0.6至0.8。然后，将每种细菌培养物各500 µL加入六厘米NGM琼脂RNAi平板中。
将培养板在避光条件下于室温孵育过夜。本方案针对在15摄氏度下培养的BAT28品系线虫优化，在此温度下外源基因最稳定。品系遗传学的详细信息见正文。
线虫的年龄同步至关重要。采用漂白法进行处理。用800微升M9缓冲液洗涤含有成虫和卵的六厘米NGM琼脂平板。然后通过离心收集线虫，弃去上清液。
接下来，向线虫中加入0.5至1毫升漂白液。在体视显微镜下观察线虫，同时振荡离心管，直至成虫开始破裂，然后收集卵。随后将卵与废弃物分离。
首先离心试管，并弃去上清液。然后用 800 µL M9 缓冲液洗涤组织沉淀，共洗涤三次。每次洗涤之间务必通过离心收集组织沉淀。
现在，将清洗后的卵转移到接种了OP50细菌的新鲜NGM平板上。短暂检查胚胎是否成功分离并转移至NGM平板上。在15摄氏度条件下培养线虫。
为了在lin-53缺失时实现生殖细胞向神经元的转化，缺失处理需从亲代开始。为缺失lin-53，对L4期动物进行RNAi处理。每组重复实验手动转移50只L4线虫至不含细菌的NGM RNAi平板中。
使用铂金丝。L4期线虫可通过其腹侧约一半位置处的白色斑块来识别。现在，将线虫在黑暗条件下于15摄氏度培养约七天。
IPTG 对光敏感。当 F1 子代发育至 L3 和 L4 阶段时，将其与体型更大、更粗壮的亲代个体分离。此时，筛选 F1 中具有突出阴门表型的个体，该表型表明针对 lin-53 的 RNA 干扰已成功实现。
RNAi 活性也可能导致致死效应，且在超过 15 摄氏度时致死率升高。为激活 che-1 并在 F1 子代中诱导生殖细胞向神经元的转化，需将线虫置于黑暗条件下，在 37 摄氏度进行 30 分钟的热激处理。请使用带通风口的培养箱，因其可实现更高效的热激。
热激后，将培养皿置于 25 °C 黑暗条件下过夜培养。在动物发育至中期 L3 阶段之前，避免通过热激诱导 che-1 的过表达非常重要，否则可能导致 che-1 蛋白在非靶向组织中表达。
第二天，设置荧光光源和GFP滤光片，以检测动物中段区域由转基因产生的荧光。为评估表型外显率，计算发出荧光信号的动物所占比例。通常情况下，约有30%的动物会显示出明显的GFP信号。
相比之下，在携带空载体RNAi的动物中，超过5%的群体中甚至无法观察到生殖系内弥散的信号。表现出突出阴门表型的F1代动物说明lin-53 RNAi成功发挥作用。在这些动物中，经热激诱导che-1后，生殖细胞转化为类似ASE神经元的细胞是常见现象。
仔细观察可发现，来自生殖系细胞的神经元样突起，这是生殖细胞来源神经元的典型特征。相比之下，空载体对照组中GFP的表达极低，最多仅为弥散状。这些动物的生殖细胞缺乏神经元样特征。
在诱导 che-1 过表达时，如果动物处于过早的发育阶段，常常会在身体其他区域（如正在发育的外阴）出现异位的转基因表达。观看本视频后，您应能充分理解如何精心设计并实施利用活体线虫进行的实验，以将生殖细胞重编程为神经元。本视频中描述的方法将使您能够进一步研究多种不同因素在细胞重编程调控中的作用。
一旦掌握，该实验程序可在10天内完成。在进行实验时，诱导重编程前需仔细筛选动物，并将BAT28菌株维持在15摄氏度。在完成该操作后，可进一步采用双RNA干扰等其他方法，以探讨更多科学问题，例如：在细胞命运转变过程中起关键作用的潜在机制是什么？
概述
本方案概述了一种在体内研究秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）生殖细胞转化为神经元过程中细胞事件的方法。通过使用转基因动物，研究人员可观察过表达神经元命运诱导型转录因子 CHE-1 以及通过RNA干扰耗竭染色质调控因子 LIN-53 所产生的效应。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 发育生物学
背景
- 理解细胞命运重编程对于深入认识发育生物学至关重要。
- 转基因模型可实现对细胞过程的实时观察。
- LINE-53 已知在染色质调控和细胞身份决定中发挥重要作用。
- CHE-1 是一种能够诱导神经元命运的转录因子。
研究目的
- 研究生殖细胞转化为神经元的潜在机制。
- 探讨信号通路和表观遗传因子在细胞重编程中的作用。
- 建立一种可用于再生治疗研究的方法。
使用的方法
- 在热激启动子驱动下表达 CHE-1 的转基因秀丽线虫（C. elegans）。
- 利用 RNA 干扰技术耗竭生殖细胞中的 LIN-53。
- 采用漂白法对线虫进行年龄同步化处理。
- 通过热激处理在特定发育阶段诱导 CHE-1 的表达。
主要结果
- 在LIN-53耗竭后，观察到生殖细胞成功转化为类神经元细胞。
- 约30%的F1代子代显示出荧光信号，表明外源基因成功表达。
- 空载体RNAi对照组荧光信号极弱，证实了该方法的特异性。
- 表型分析显示，转化后的细胞具有类神经元的突起结构。
结论
- 本方案提供了一种在体内研究细胞重编程的可靠方法。
- 研究结果有助于理解细胞身份的调控机制及其潜在的治疗应用。
- 掌握该技术可促进对细胞重编程因子的进一步研究。
常见问题
行业重要性概述
在活体系统中将秀丽隐杆线虫（C. elegans）的生殖细胞重编程为神经元，能够直接探究细胞身份决定机制及表观遗传调控。该方法可为参与细胞命运决定的通路提供高可信度的靶点验证和机制层面的风险评估。此技术特别适用于早期发现团队，有助于解析维持细胞身份的调控网络，并为再生医学策略提供理论依据。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 能够在细胞命运重编程过程中实现对染色质调控因子和转录因子的功能验证。
- 支持通过遗传筛选鉴定维持细胞身份的新调控因子。
- 通过分离特定基因扰动对重编程结果的影响，促进机制层面的风险评估。
- 提供活体动物环境，用于信号通路解析和假设验证。
筛选与检测方法开发
- 建立了一个稳定的体内系统，用于针对重编程因子的RNAi遗传筛选。
- 提供基于荧光的定量读数，以实现检测方法的标准化和可重复性。
- 可在多种条件和发育阶段中实现基因功能的规模化评估。
- 为后续化合物或遗传修饰因子筛选准备经过验证的生物系统。
转化与临床前研究
- 契合与细胞可塑性和再生潜能相关的疾病研究问题。
- 实现从发现阶段的遗传学成果到临床前模型开发的连贯推进。
- 支持对参与细胞命运调控的靶点进行风险评估后的优化推进。
- 为基于重编程的治疗策略可行性提供预测性见解。
流程与工作流整合
该方法整合了早期发现与先导识别的界面，能够实现基于假设的遗传筛选以及重编程因子的功能验证。
- 发现生物学：支持在细胞命运转换中对基因功能进行零假设检验。
- 筛选：提供可重复的定量荧光输出，用于不同条件间的比较。
- 分析：提供统计穿透性数据，以支持继续或终止决策。
- 转化研究：当与疾病相关通路一致时，可将机制性发现延伸至临床前模型的开发。
- 企业级复用：提供一个可重复使用的平台，用于对多种不同靶点进行迭代的遗传和表观遗传学探究。
运营与企业影响
- 科学价值：提高靶点验证的预测可信度，降低细胞命运研究中的机制模糊性。
- 操作价值：标准化体内重编程工作流程，实现可重复性和可扩展性。
- 战略价值：为早期“推进/不推进”决策提供依据，并通过降低生物学假说的风险提升资本使用效率。
- 项目组合影响：实现基于风险调整的靶点和通路优先级排序，推动研发进程。
实施注意事项
- 需要具备秀丽隐杆线虫（C. elegans）遗传学、RNA干扰（RNAi）及转基因菌株操作方面的专业知识。
- 需要具备荧光显微镜和可控热激仪器的使用条件。
- 需要在不同研究团队之间严格统一动物发育阶段判定和诱导实验方案。
- 若将本方法应用于其他模式系统，可能需要对实验方案进行优化和验证。
- 表型外显率和特异性对发育时机及环境条件较为敏感。
