Name: 用便携式实时 PCR 系统进行土壤载体 Phytopathogens 的现场分子检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 15 s
Description: 学习使用便携式实时PCR系统进行土壤传播植物病原体的现场分子检测方法。该技术结合磁珠DNA提取，可在田间快速诊断病害，有效防止病原体二次传播，为农业生产提供重要的病害管理工具。

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我们感谢北达科他州立大学的 Neil C. Gudmestad 博士提供 S. subterranea 质粒 DNA，华盛顿州立大学（WSU）的 Hanu Pappu 博士提供 PMTV RNA，以及华盛顿州立大学（WSU）的 Debra Inglis 博士提供 R. solani AG3。特别感谢华盛顿州立大学的 Jeremy Jewell 博士对本文稿提出的修改意见，以及华盛顿州立大学农业、人类与自然资源科学学院通讯部门（WSU CAHNRS Communications）提供的视频拍摄支持。本研究由西北马铃薯研究联盟和华盛顿州农业部特色作物专项拨款计划（项目编号：K1764）资助。项目编号 PPNS No. 0741，美国华盛顿州普尔曼市华盛顿州立大学农业、人类与自然资源科学学院植物病理学系，农业研究中心，Hatch 项目编号 WNP00833。

1. 使用便携式实时PCR系统进行病原体的现场分子检测
注意： 见图1。
<ol>
	<li>基于磁珠的DNA提取 
	注意： 基于磁珠的DNA提取试剂盒（例如 根据制造商说明使用了Primerdesign公司的试剂。所有试剂应在室温（18–25 °C）下保存。冻干的蛋白酶K（1号瓶）在用1a号瓶溶液重悬后，需于-20 °C保存。
	<ol>
		<li>将20-50 mg土壤样品与500 µL样品制备液在微量离心管中混合。 
		注意： 土壤与Prep Solution的配比非常重要，因为以其他比例混合可能导致后续实验失败（例如， PCR抑制剂的污染。</li>
		<li>使用无菌小研杵研磨管底的土壤，直至溶液变浑浊。通过振荡微量离心管使土壤颗粒进一步悬浮于溶液中，随后静置，避免扰动，让土壤颗粒完全沉降（通常为5至10分钟）。</li>
		<li>将200 µL上清液转移至新的微量离心管中，加入200 µL裂解缓冲液（2号瓶：盐酸胍溶液）和20 µL蛋白酶K（1号瓶）。</li>
		<li>将裂解液充分混匀，通过倒置离心管混和，并在室温下孵育15分钟。 
		注意： 如果裂解液附着在微量离心管盖上，可轻弹管体，或使用离心机（如有）将液体从管盖上甩下。</li>
		<li>向裂解后的样品中加入500 µL结合缓冲液/磁珠混合液（3号瓶）。用移液器轻轻吹打混匀，在远离磁力架的室温条件下孵育5分钟。 
		注意： 使用前务必充分混匀珠子溶液，以确保从储存瓶中分装的珠子均匀一致。</li>
		<li>将微量离心管置于磁力架上。静置至少2分钟，或直至微量离心管中的所有磁珠完全吸附至靠近磁铁的一侧管壁。随后，用移液器小心吸除并弃去全部上清液。 
		注意： 去除和吸弃上清液时请勿扰动磁珠。此时DNA已被磁珠捕获。</li>
		<li>从磁力架上取下微量离心管，加入500 µL洗涤缓冲液-1（4号瓶：高氯酸钠/乙醇溶液），通过反复吹打重悬磁珠，直至磁珠均匀分散。此洗涤步骤用于去除样品中的蛋白质和盐分。静置30秒。</li>
		<li>重复步骤 1.1.6。</li>
		<li>从磁力架上取下微量离心管，加入500 µL洗涤缓冲液-2（5号瓶：高氯酸钠/乙醇溶液），通过反复吹打重悬磁珠，直至磁珠均匀分散。静置30秒。</li>
		<li>重复步骤 1.1.6。</li>
		<li>从磁力架上取下微量离心管，然后加入500 µL 80%乙醇（6号瓶）。 
		注意： 此步骤对于去除样品中残留的盐分是必要的。
		<ol>
			<li>通过反复移液重悬珠子，直至珠子均匀分散。室温静置10分钟，期间偶尔通过倒置混匀。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>重复步骤 1.1.6。</li>
		<li>在室温下将微量离心管管盖打开，使磁珠沉淀空气干燥10分钟。 
		注意： 磁珠应无可见的残留乙醇，但不可完全干燥。</li>
		<li>从磁力架上取下微量离心管，加入 50–200 µL 洗脱缓冲液（7 号瓶），通过反复吹打重悬磁珠，直至磁珠均匀分散，静置 30 秒。 
		注意： 在上述步骤中，纯化的 DNA 从磁珠中释放到洗脱缓冲液中。</li>
		<li>将微量离心管置于磁力架上，静置至少2分钟，或直至管内所有磁珠完全吸附至管壁的磁极一侧。</li>
		<li>将含有纯化后 DNA/RNA 的上清液转移至 0.5 mL 微管中，用于后续实验步骤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>便携式实时 PCR 
	注意： 便携式热循环仪和PCR检测试剂盒均按照制造商的说明使用（参见 材料清单).
	<ol>
		<li>打开并运行热循环仪配套软件，选择 靶标检测实验 并输入所有描述信息到 名称 &amp;#38; 细节、注意事项、样本 和 测试 数据录入字段 
		注意： 第1孔和第2孔分别由软件指定为阴性对照和阳性对照。</li>
		<li>使用前准备PCR试剂。将500 µL的主混合物重悬缓冲液转移至含有冻干主混合物的管中，通过倒置充分混匀。将全部主混合物转移至标有引物/探针的棕色微量离心管中表2).
		<ol>
			<li>盖上离心管盖并振荡混匀。充分混匀以确保所有组分完全重悬。将此混合物室温静置5分钟后再使用。 
			注意： 使用后将反应混合物于 -20 °C 保存。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>通过将上一步骤中制备的反应混合液10 µL转移至0.2 mL PCR管中，然后加入10 µL无菌无核酸酶的去离子水，制备阴性对照。</li>
		<li>通过移液枪吸取10 µL步骤1.2.2中制备的反应混合液，转移至一个0.2 mL的PCR管中，然后加入10 µL阳性对照模板，制备阳性对照。</li>
		<li>每个样本取10 µL上一步制备的反应混合液，加入0.2 mL PCR管中，然后加入10 µL由步骤1.1.16制备的样本DNA。</li>
		<li>按照步骤2.1.1所述，将各PCR管中的内容物加入热循环仪的相应孔中。</li>
		<li>在输入并确认所有必要信息后，选择 开始运行 选择以太网连接的仪器或U盘。 
		注意： 如果选择了U盘选项，则必须将运行文件保存到将与PCR仪一起使用的U盘中例如，F:\genesig)。将U盘插入热循环仪后，程序将立即开始运行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>便携式实时PCR数据分析
	<ol>
		<li>运行结束后，使用热循环仪配套软件从U盘中打开运行文件（.usb），或直接在软件中点击查看运行结果 结果.</li>
		<li>在分析结果之前，保存已完成的运行数据，以避免丢失信息。</li>
		<li>在 结果 标签页，按样本分类查看运行状态。 
		注意： 在此标签页中可获取的数据包括样本的检测结果状态和拷贝数。</li>
		<li>点击 细节 按标签查看扩增曲线。当目标物成功检出时，会显示目标物和内参对照的Cq（定量循环）值。 
		注意： 这些数值在最终报告中进行计算，用于判断样本是否对目标物呈阳性，以及反应或DNA样本是否存在异常。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 其他方案
<ol>
	<li>替代性实验室DNA提取方法
	<ol>
		<li>基于CTAB-苯酚-氯仿的方法
		<ol>
			<li>按照此前所述的Doyle方法18和Dellaporta方法19，进行基于CTAB-苯酚-氯仿的提取操作。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>DNA小量制备法 
		注意： 按照以下步骤执行Edwards方法20。
		<ol>
			<li>向微量离心管中加入500 mg土壤样品、五个1.4 mm陶瓷珠以及750 µL Edwards缓冲液（200 mM Tris，pH 8.0，200 mM NaCl，25 mM EDTA，0.5% SDS），充分混匀。</li>
			<li>将微量离心管在65 °C下孵育5分钟。</li>
			<li>使用珠磨均质器均质样品60秒（或使用研钵和研杵进行研磨）。</li>
			<li>以14,000 × g离心5分钟。</li>
			<li>将500 µL上清液转移至新的微量离心管中，加入500 µL预冷的异丙醇，通过倒置混匀10次。</li>
			<li>以14,000 × g离心15分钟，使DNA沉淀成团。</li>
			<li>弃去上清液，将DNA沉淀在室温下晾干，直至残留乙醇完全挥发。</li>
			<li>用750 µL预冷的70%乙醇洗涤DNA沉淀。</li>
			<li>将沉淀空气干燥后，溶于50–100 µL TE缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0，1 mM EDTA）中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>其他替代方法
		<ol>
			<li>根据生产商说明书，使用试剂盒#1&#160;(MP BIO&#160;Fast DNA Spin) 和试剂盒#2 (Zymo BIOMICS DNA Miniprep Kit) 进行基于硅胶膜的DNA提取。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>常规实验室实时荧光定量PCR 
	注意： 使用常规热循环仪，配合探针法PCR的预混液、多种引物及寡核苷酸探针（表2）进行实验。
	<ol>
		<li>使用底部不透光的PCR管或PCR板，为所有待分析的DNA样品、阴性对照（无核酸酶的去离子水）以及实验室自制的阳性模板对照，分别配制20 µL的反应体系。</li>
		<li>对每个PCR管或孔，配制反应混合液，包含10 µL预混液、7 µL无核酸酶去离子水、2 µL浓度为2 µM的引物/探针混合液，以及1 µL DNA样品（来自步骤1.1.16或2.1）或对照模板。</li>
		<li>封闭PCR管或PCR板，选择合适的PCR程序开始扩增反应。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>常规实验室实时荧光定量PCR数据分析
	<ol>
		<li>使用热循环仪配套软件分析常规热循环仪的实验结果。开始数据分析前，将运行文件从热循环仪导出至U盘：插入U盘后选择导出。</li>
		<li>在热循环仪配套软件中打开导出的运行数据文件（.pcrd格式）。</li>
		<li>通过定位仪器上的对应孔位，选中样品孔。扩增曲线和标准曲线（如适用）将自动生成。若未输入样品信息，请点击板设置或类似功能，开始数据录入后再进行分析。</li>
		<li>在定量分析标签页查看数据，可将其导出，以便使用第三方软件（如CSV、XML或HTML文件阅读器）进行进一步分析。</li>
		<li>根据设定的阈值获取Cq值，并与阳性及阴性对照进行比较。 
		注意： 若实验中使用了目标物的DNA标准品，应将样品的Cq值与标准品的Cq值进行比较，以确定Cq截断值。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。

如表1所示，病原体分子鉴定技术的最新进展已提高了诊断的效率、准确性和速度，有助于检测无症状感染27。在实地诊断方面，环介导等温扩增（LAMP）和侧向流动检测方法因具有便携性、低成本以及可即时获得结果等优势而被广泛使用。然而，血清学方法在实现物种特异性检测方面可能存在困难，有时会导致对非靶标微生物（如常见的土壤微生物）的误检。例如，在马铃薯病原体检测中，Phytophthora spp. 与 Pythium spp. 的血清学检测之间可能出现交叉反应28，表明靶标植物病原体的检测有时仍面临挑战。
在本研究中，我们通过将便携式实时PCR系统与传统的实验室实时PCR系统进行性能比较，开发出一种用于现场检测土传马铃薯病原体的优化方案。我们发现，尽管该现场检测方法的灵敏度比相应的实验室检测方法低约10倍，但仍能特异性地检测土壤样本中的马铃薯病原体。值得注意的是，本研究中的实验室和田间试验均未采用具有生物学代表性的样本量。如先前研究所述29,30&#160;，常规田间土壤筛查需要较大的样本量，通常处理250 g至1 kg的土壤样本，但这些方法需要熟练的操作人员和精密设备来进行DNA提取。通常，大规模土壤DNA提取所用的样品来自单个混合土样，该土样代表了1至4公顷范围内多个子样本的集合6,29,30。然而，本文所开发的方案操作快速、简便，无需分子诊断经验的用户亦可使用，且可在实验室外进行。由于该方法相较于大规模土壤DNA提取更为快速且成本较低，因此可用于检测来自与大规模混合样本相同采样区域的多个小规模样本。这可在一定程度上弥补样本量较小的不足，并提供有关病原体在田间空间分布的额外信息。此外，该方法具有便携性和快速性，也可用于向种植者开展示范活动，以实现教育和推广目的。
另一个需要考虑的因素是，已有大量针对多种植物病原体的实时PCR检测方法被发表5。该系统可直接利用这些现有检测方法，无需重新设计LAMP引物，即可实现田间检测。LAMP检测常被诟病的一点是引物设计较为困难31。因此，便携式PCR技术使得大量现成可用的病原体检测方法能够更简便地应用于现场检测。
传统方法通常成本较高、费时费力、准确性差且耗时较长。我们开发的现场检测方法操作简便，使种植者和行业从业人员能够自行完成病原体检测，或许比将样本送至较远的诊断实验室获得结果更为迅速。便携式PCR方法的快速性和高灵敏度有助于种植者避免潜在的二次感染，从而防止病原体种群进一步扩增以及通过设备或人员无意间传播。总之，本研究开发的现场检测方法能够在田间准确且相对灵敏地检测重要的土传病原体。我们希望本研究所开发的现场检测方法能够融入当前的诊断流程（图6），不仅为田间植物病害的流行病学问题提供快速而准确的答案，同时也有助于加深对植物病原体生物学特性及流行病学规律的理解。

准确且快速地鉴定致病病原体对植物病害管理决策具有重要影响。土传病害尤其难以诊断，因为土壤环境相对于植物生物量而言极为广阔且复杂，使得全面理解土传病害的各个方面充满挑战。此外，土传病害在早期感染阶段可能无明显症状，其发生依赖于环境胁迫因素，且部分病害具有较长的潜伏期，导致诊断延迟1。许多土传病原体已进化出可在土壤中长期存活的休眠结构，例如特化的孢子或黑色素化的菌丝，即使在缺乏寄主的情况下也能在土壤中存活多年。目前用于土传病害管理的措施包括：避免使用已知受侵染的田块、采用无病认证种子和种苗、保持农用设备的清洁卫生，以及在可能的情况下限制土壤和水的移动。通过分子检测技术掌握病原体的存在情况，也可在指导田间早期处理或种植前评估方面发挥重要作用。现场检测不仅能够快速获得结果，避免将样本送往可能较远的诊断实验室，而且若在种植者在场的情况下于田间进行此类诊断，还可提高其参与度。
基于分子检测的现场诊断，其灵敏度、特异性、稳健性（重复性和再现性）以及效率（即.、简便性及成本效益）是需要考虑的关键因素。侧向流动装置（LFDs），如Immunostrip和PocketDiagnostic，因其一步式检测的简便性，已成为现场病原体检测的常用方法。然而，LFDs并非在所有情况下都适合作为诊断工具，因其灵敏度和特异性有限，当目标病原体浓度较低时，可能出现结果不明确的情况，且有时会与相近物种或属发生交叉反应2环介导等温扩增（LAMP）也适用于现场病原体检测，由于其试剂成本低、反应条件恒定以及可通过简单的比色法进行肉眼观察，因此尤为经济。然而，侧向流动试纸条（LFDs）和LAMP通常仅用于定性分析，尽管这两种方法在配备更昂贵设备的情况下也可实现定量检测3聚合酶链式反应（PCR）与上述检测方法相比，具有高特异性、高灵敏度以及定量检测能力。然而，传统的基于实验室的PCR技术需要昂贵的实验设备和熟练的技术人员，这使其在作为现场检测方法应用时存在主要劣势。
本方案展示了一种使用便携式实时PCR仪器的现场诊断方法。与其他方法相比，实时PCR技术在定量准确性、灵敏度和多功能性方面具有优势，已广泛用于检测多种植物病原体4,5，包括土壤中的多种马铃薯病原体6。由于近年来市场竞争日益激烈且发展迅速，PCR技术所需的设备不断向更紧凑、更低成本的方向发展7。本方案包括以下步骤：基于磁珠的核酸提取、便携式实时PCR（基于荧光探针的检测）以及定量数据分析，所有步骤均可通过笔记本电脑远程完成（图1）。
利用本研究开发的便携式PCR方案，对土壤样品进行了分析，以检测土传病原菌Spongospora subterranea。Spongospora被选为研究对象，因为它是引起马铃薯粉痂病的重要病原菌8。近几十年来，该病害的发生范围已扩展至全球多个马铃薯种植区9,10。&#160;粉痂病会导致块茎表面出现类似丘疹的病斑，从而给马铃薯种植者带来严重的品质和产量损失。此外，S.&#160;subterranea 还可传播马铃薯帚顶病毒（PMTV），导致块茎内部出现病斑症状（称为spraing）11,12。因此，在种植前明确田间是否含有S. subterranea具有重要意义6。本研究还展示了该方案在检测Rhizoctonia solani融合群3（AG3）和PMTV方面的有效性。尽管多种Rhizoctonia solani融合群均可引起马铃薯病害，但AG3被认为是全球范围内最重要的一个融合群13，其引起的茎溃疡和黑痣病可导致高达30%的可销售产量损失14。PMTV会在块茎内部引发坏死性病斑，通常称为spraing。该病毒最近首次在美国西北太平洋地区的多个州被报道15,16,17，&#160;已成为这一重要马铃薯产区种植者日益关注的问题。除评估便携式PCR对上述重要病害的检测效果外，本研究还探讨了最佳DNA提取方法及土壤样品取样量。
结果表明，便携式PCR方法具有多功能性，适用于检测不同病原体。我们开发的现场检测方法可使农业一线工作人员（例如，种植者）在病害管理方面更早地做出决策，如品种选择或轮作安排，并可在田间调查期间、种植前对样品中的植物病原体进行定量，以避免潜在的病害暴发。

<table><tbody><tr><td>白色外壳PCR板</td><td>Bio-Rad</td><td>HSP9601</td><td></td></tr><tr><td>CFX Manager</td><td>Bio-Rad</td><td>1845000</td><td></td></tr><tr><td>SsoAdvanced Universal Probes Supermix&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1725280</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Touch qPCR仪器</td><td>Bio-Rad&amp;nbsp;</td><td>1855195</td><td></td></tr><tr><td>乙醇，纯度200 proof</td><td>Decon Laboratories</td><td>04-355-222</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP118-500</td><td></td></tr><tr><td>饱和酚&amp;nbsp;</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP1750I-400</td><td></td></tr><tr><td>三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>q16实时PCR仪</td><td>genesig</td><td>MBS486001</td><td></td></tr><tr><td>超纯十二烷基硫酸钠（SDS）</td><td>Invitrogen</td><td>15525-017</td><td></td></tr><tr><td>2-丙醇（异丙醇）</td><td>JT Baker</td><td>67-63-0</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>JT Baker</td><td>9180-03</td><td></td></tr><tr><td>盐酸，36.5-38.0%（HCl）</td><td>JT Baker</td><td>9535-03</td><td></td></tr><tr><td>异戊醇</td><td>JT Baker</td><td>9038-01</td><td></td></tr><tr><td>FastDNA Spin试剂盒&amp;nbsp;</td><td>MP Biomedicals</td><td>6560-200</td><td>基于硅胶的DNA提取试剂盒 #1</td></tr><tr><td>Luna Universal One-Step RT-qPCR试剂盒</td><td>New England Biolabs</td><td>E3005S</td><td></td></tr><tr><td>0.1 ml低轮廓独立PCR管</td><td>Phenix Research</td><td>MPC-100LP</td><td></td></tr><tr><td>Easy DNA/RNA提取试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Primerdesign</td><td>genesigEASY-EK</td><td></td></tr><tr><td>genesig Easy 1.5 mL管</td><td>Primerdesign</td><td>genesigEASY-1.5</td><td></td></tr><tr><td>磁力管架</td><td>Primerdesign</td><td>genesigEASY-MR</td><td></td></tr><tr><td>Spongospora subterranea f. sp. subterranea genesig Easy试剂盒</td><td>Primerdesign</td><td>Path-S.subterranea-EASY</td><td></td></tr><tr><td>十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6269-100G</td><td></td></tr><tr><td>研磨杵</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-141-364</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>DNA Miniprep试剂盒&amp;nbsp;</td><td>ZymoBIOMICS</td><td>D4300</td><td>基于硅胶的DNA提取试剂盒 #2</td></tr></tbody></table>

利用便携式实时pcr系统对土传植物病原体进行现场分子检测

On-Site Molecular Detection of Soil-Borne Phytopathogens Using a Portable Real-Time PCR System

现场诊断植物病害可为种植者提供及时决策的有力工具，有助于尽早实施病害管理策略，从而减轻病害影响。目前，在许多诊断实验室中，聚合酶链式反应（PCR），尤其是实时PCR，被认为是检测植物病原体最敏感且最准确的方法。然而，基于实验室的PCR通常需要昂贵的仪器设备和熟练的技术人员。本研究以马铃薯土传病原体为例，展示现场分子检测的可行性。该方法采用一种快速且简便的流程，包括基于磁珠的核酸提取和便携式实时PCR（基于荧光探针的检测）。便携式实时PCR方法与实验室系统相比，表现相当。, 检测低至100个DNA拷贝 Spongospora subterranea 本研究开发的便携式实时PCR方法可作为基于实验室方法的替代方案，以及病原体诊断的一种实用现场工具。

DNA提取方法的比较
通过检测病原菌侵染田块土壤样品中S. subterranea DNA 的含量，评估了基于磁珠的DNA提取方法与实时PCR的兼容性。如补充图1所示，将基于磁珠的方法与其他方法进行了比较，包括CTAB-苯酚-氯仿法18、快速DNA小量制备方法19,20以及其他标准的硅胶膜DNA提取试剂盒。使用六种不同方法提取的DNA样品均进行了常规实验室实时PCR检测。结果表明，基于磁珠的方法与其他方法具有可比性，尽管在所测试的方法中，基于硅胶膜的DNA提取试剂盒表现最佳。所有试剂盒均含有硫氰酸胍或盐酸胍：二者均为强效变性剂，可使大多数细胞蛋白（包括RNase和DNase）变性。因此，这些方法适用于DNA和RNA的提取。
便携式实时 PCR 与传统基于实验室的实时 PCR 的比较
为了比较便携式PCR与传统基于实验室的PCR的灵敏度和特异性，使用携带S. subterranea ITS基因的pGEM-T载体21，对不同数量的该基因进行病原体DNA的绝对定量。采用SsTQ引物/探针组22对ITS基因进行10倍系列稀释（106至100拷贝）后进行分析。结果表明，便携式PCR方法可检测到目标病原体DNA（约100拷贝），但其灵敏度比传统基于实验室的PCR方法低10倍，后者至少可检测到10拷贝（图2）。
为进一步验证，对人工接种的土壤进行了检测。 S. subterranea 从马铃薯根部的粉痂病根瘤中获取孢子囊。将孢子囊悬浮液以终浓度10⁶个孢子囊/g土壤接种至土壤中5 孢子数/克干重土壤。采用磁珠法从受侵染的土壤样品中提取DNA，并进行10倍系列稀释，以获得相当于10的浓度5, 104, 103, 102, 101，和100 孢子数/克干重土壤。DNA样品采用SPO引物/探针组进行PCR扩增23结果显示，便携式PCR方法的分析能力与传统的基于实验室的PCR方法相当，但其灵敏度降低了约10倍（图3).
最后，我们测试了一个自然感染 S. subterranea 的田间土壤样品。采用不同土壤用量（每500 µL提取缓冲液分别加入10、20、50和100 mg土壤）进行基于磁珠的DNA提取。结果表明，DNA提取的最佳起始土壤用量为50–100 mg（图4）。超出该范围的土壤用量会导致后续PCR步骤失败。这可能是因为当起始土壤用量过多时，污染物（例如，酚类化合物）可能干扰PCR反应24。而当土壤用量过低时，提取的DNA量可能低于PCR的检测限（例如，从10–20 mg土壤中提取的总DNA产量存在波动）。便携式PCR与常规PCR方法的灵敏度相当。采用不同提取方法获得的DNA样品也得到了相似的结果（补充图2）
使用便携式实时 PCR 在现场检测系统中对其他病原体的检测
我们测试了便携式PCR方法用于检测其他重要的土传马铃薯病原体，即R. solani AG3和PMTV。在本研究中，我们使用RsTq引物/RQP1探针组25对纯培养物DNA进行实时PCR，以检测R. solani AG3。同时，我们使用PMTV-D引物/探针组26对表现出坏疽条斑症状的薯块样本RNA进行实时PCR，以检测PMTV。如图5所示，便携式PCR方法成功检测到了这两种病原体。便携式设备与传统仪器的检测结果具有可比性，表明只要设计有适用于实时PCR的引物序列，该便携式PCR方法具有广泛的适用性，可用于其他病原体的检测。
<img alt="在微型离心管中进行组织匀浆；使用移液器进行磁珠法DNA提取；便携式PCR装置；在笔记本电脑上进行数据分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56891/56891fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1. 用于现场病原体检测的便携式实时PCR系统操作流程。该方案依次包括以下步骤：通过短暂匀浆制备裂解液（A）、基于磁珠的核酸提取（B）、便携式实时PCR扩增（C）以及使用笔记本电脑进行定量数据分析（D）。需要注意的是，所有步骤均可在现场完成。
<img alt="显示 log Cq^-1 与质粒拷贝数关系的常规 PCR 与便携式 PCR 图表，R² 比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56891/56891fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2．便携式 PCR 与常规实验室 PCR 的灵敏度比较。 使用不同浓度的 S. subterranea ITS 基因（106 至 100 拷贝）以及 SsTQ 引物/探针组对病原体 DNA 进行定量。在常规热循环仪（A）和便携式热循环仪（B）上，S. subterranea 质粒 DNA 的对数值与 Cq 值倒数的对数值之间的线性回归分析。<a href="/files/ftp_upload/56891/56891fig2v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="常规PCR与便携式PCR的比较；图表，Log(Cq) 对孢子数量，显示R²值。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56891/56891fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3．人工接种S. subterranea土壤中检测性能的比较。 土壤样品经人工接种不同浓度的S. subterranea孢子囊悬浮液（105至100个孢子囊/克干土）。采用磁珠法从接种土壤样品中提取DNA，并使用SPO引物/探针组对土壤样品进行PCR扩增。通过线性回归分析比较土壤中起始孢子囊数量的对数值与Cq值倒数的对数值之间的关系，分别在常规热循环仪（A）和便携式热循环仪（B）上进行。 <a href="/files/ftp_upload/56891/56891fig3v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="土壤DNA的定量PCR分析，图表显示：log DNA量与[Log(Cq)]⁻¹的相关性。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56891/56891fig4v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4．土壤样品DNA提取起始量的比较。 采用磁珠法从10、20、50和100 mg的土壤样品中提取DNA。使用便携式热循环仪进行实时PCR。标准曲线表示从土壤样品中提取的总DNA量（x轴）与Sss引物/探针组扩增的PCR产物量（y轴）之间的关系。<a href="/files/ftp_upload/56891/56891fig4v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="PCR检测结果：比较便携式与传统PCR在RNA/DNA定量中的图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56891/56891fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图5"> 
图5．其他马铃薯病原体R. solani和PMTV的检测。采用便携式热循环仪和传统热循环仪进行实时PCR。使用RsTq引物和RQP1探针，在从纯培养物中提取的总DNA中检测到R. solani AG3（A）；使用PMTV-D引物/探针组，在PMTV感染的块茎样品中提取的总RNA中检测到PMTV（B）。<a href="/files/ftp_upload/56891/56891fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="病原体评估流程图；形态学/分子鉴定；显微镜、PCR；决策流程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56891/56891fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图6"> 
图6植物病原体诊断流程 流程图展示了一般植物病原体诊断的工作流程。请注意，传统步骤， 例如，如果采用现场分子检测，则可省去目视鉴定，从而使整个诊断过程变得简便快捷。 <a href="/files/ftp_upload/56891/56891fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>便携式实时 PCR</td>
			<td>实时 PCR</td>
			<td>LAMP</td>
			<td>ELISA</td>
			<td>侧向流动</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>每目标反应成本</td>
			<td>$0.60-$8.47</td>
			<td>$0.60</td>
			<td>$0.75</td>
			<td>$0.60</td>
			<td>$4.74</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>灵敏度</td>
			<td>100 拷贝</td>
			<td>10 拷贝</td>
			<td>10 拷贝</td>
			<td>1-10 个孢子囊33 
			1-10 ng/mL（蛋白质）33</td>
			<td>1-10 个孢子囊34 
			5×105 CFU/mL35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>时间消耗</td>
			<td>90 分钟</td>
			<td>80-240 分钟</td>
			<td>50-90 分钟32</td>
			<td>3-24 小时</td>
			<td>10-15 分钟</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>所需准备</td>
			<td>● 核酸提取 
			● 引物设计</td>
			<td>● 核酸提取 
			● 引物/探针设计</td>
			<td>● 核酸提取 
			● 引物设计</td>
			<td>● 蛋白质提取 
			● 抗体</td>
			<td>不适用</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>其他所需材料</td>
			<td>● 便携式热循环仪</td>
			<td>● 常规热循环仪</td>
			<td>● 显色染料 
			● 培养箱</td>
			<td>● 酶标仪 
			● 洗板设备</td>
			<td>不适用</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 植物病原体分子与血清学检测方法比较表
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>引物</td>
			<td colspan="2">序列 (5′–3′)a</td>
			<td>靶标b</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsTQ-F13</td>
			<td colspan="2">CCGGCAGACCCAAAACC</td>
			<td>S. subterranea 中的 ITS1-ITS2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsTQ-R13</td>
			<td colspan="2">CGGGCGTCACCCTTCA</td>
			<td>S. subterranea 中的 ITS1-ITS2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsTQ-P13</td>
			<td colspan="2">[FAM]CAGACAATCGCACCCAGGTTCTCATG[TAM]</td>
			<td>S. subterranea 中的 ITS1-ITS2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genesig S.subterranea 引物/探针</td>
			<td colspan="2">N/A</td>
			<td>S. subterranea 中的肌动蛋白（Actin）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPO1014</td>
			<td colspan="2">GGTCGGTCCATGGCTTGA</td>
			<td>S. subterranea 中的 ITS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPO1114</td>
			<td colspan="2">GGCACGCCAATGGTTAGAGA</td>
			<td>S. subterranea 中的 ITS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPOPRO114</td>
			<td colspan="2">[FAM]CCGGTGCGCGTCTCTGGCTT[TAM]</td>
			<td>S. subterranea 中的 ITS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RsTqF119</td>
			<td colspan="2">AAGAGTTTGGTTGTAGCTGGTCTATTT</td>
			<td>R. solani 中的 ITS1-ITS2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RsTqR119</td>
			<td colspan="2">AATTCCCCAACTGTCTCACAAGTT</td>
			<td>R. solani 中的 ITS1-ITS2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RQP119</td>
			<td colspan="2">[FAM]TTTAGGCATGTGCACACCTCCCTCTTTC[TAM]</td>
			<td>R. solani 中的 ITS1-ITS2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genesig PMTV 引物/探针</td>
			<td colspan="2">N/A</td>
			<td>PMTV 中的 CP-RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMTV-D-F20</td>
			<td colspan="2">AGAATTGRCATCGAAACAGCA</td>
			<td>PMTV 中的 CP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMTV-D-R20</td>
			<td colspan="2">GTCGCGCTCCAATTTCGTT</td>
			<td>PMTV 中的 CP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMTV-D-P20</td>
			<td colspan="2">[FAM]CCACAAACAGACAGGTATGGTCCGGAA[TAM]</td>
			<td>PMTV 中的 CP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">a 寡核苷酸DNA引物经FAM（6-羧基荧光素）或TAM（5-羧基四甲基罗丹明）修饰</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">b ITS：内转录间隔区；CP：外壳蛋白；CP-RT：外壳蛋白通读</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2. 本研究中使用的引物
补充图1. 马铃薯粉痂病原菌检测中不同DNA提取方法的比较。 对六种不同的DNA提取方法（A-F）进行了比较，用于检测土壤样品中的马铃薯粉痂病原菌S. subterranea（B、D、F）。DNA分别采用基于硅胶的试剂盒#1（所有试剂盒名称见材料表）、基于硅胶的试剂盒#2以及基于磁珠的试剂盒进行提取。PCR扩增使用常规实验室PCR扩增仪完成。标准曲线表示从土壤样品中提取的总DNA量与SsTQ引物/探针组扩增出的PCR产物量之间的关系。<a href="/files/ftp_upload/56891/Supplementary_Figure_1.pdf" target="_blank">请点击此处下载该图。</a>
补充图2. 便携式PCR与传统实验室PCR检测限的比较。 采用三种不同的提取方法从土壤样品中分离总DNA：（A, B）Doyle法，（C, D）基于硅胶的试剂盒#2，以及（E, F）基于磁珠的试剂盒。左侧图示为使用便携式热循环仪配合Sss引物/探针组获得的数据，右侧图示为使用传统实验室热循环仪配合SsTQ引物/探针组获得的数据。<a href="/files/ftp_upload/56891/Supplementary_Figure_2.pdf" target="_blank">请点击此处下载该图。</a>

快速准确地在现场检测植物病原体，特别是土传病原体，对于防止田间植物病害的进一步接种体产生和扩散至关重要。本研究开发的基于便携式实时PCR检测系统的方法，能够在田间条件下实现现场诊断。

利用便携式实时PCR系统对土传植物病原体进行现场分子检测

植物病害的现场诊断可为种植者提供有用工具，有助于及时决策，从而尽早实施病害管理措施。

大家好，我叫Joseph DeShields，来自华盛顿州立大学植物病理学系。今天我将向大家展示一种用于在土壤中现场检测土传病害的实验方案。在田间对植物病害进行现场诊断对于有效管理病害至关重要，并最终有助于减少病原体在田间的二次传播。由于土壤环境庞大且复杂，土传病原体尤其难以诊断，这也使得理解土传病害变得困难。聚合酶链式反应（PCR）目前是检测田间植物病原体最广泛认可的高灵敏度和高准确性的方法。以下方案展示了一种灵敏且可在现场操作的土传病原体检测方法，包括基于磁珠的DNA提取、PCR扩增（可使用便携式PCR仪完成）以及数据分析（可通过笔记本电脑远程完成）。基于磁珠的DNA和RNA提取。DNA和RNA提取试剂盒按照制造商说明书进行准备和使用，仅作轻微修改。所有试剂均在室温下保存，配制好的蛋白酶K则保存在20°C。

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Research

科研

JoVE Journal

Environment

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为了实现对Acinetobacter baumannii的快速且精准检测，我们提出了一种结合重组酶聚合酶扩增技术（RPA）与LbaCas12a内切酶的检测方案，用于鉴定A.

基于重组酶聚合酶扩增/Cas12a系统的Acinetobacter baumannii感染快速特异性检测

本方案介绍了一种结合重组酶聚合酶扩增与CRISPR/Cas12a检测技术的方法，用于检测侵入性植物病原菌Fusarium oxysporum f. sp. cubense...

联合重组酶聚合酶扩增与CRISPR/Cas12a检测法用于检测 Fusarium oxysporum 专化型 cubense 热带4号小种

本文介绍一种简单快速的检测蜜蜂病原体（如Lotmaria passim和Nosema...

现场检测锥虫科寄生虫和Nosema ceranae的DNA：基于碱裂解联合RPA/CRISPR/Cas12a系统的方法

可靠且准确的现场可部署DNA分析方法对许多行业至关重要。本文提供了两种用于野外环境微生物分析的方法：1）利用生物提取野外试剂盒从环境样本中分离微生物DNA；2）通过野外qPCR仪进行DNA分析。...

使用生物提取野外试剂盒和野外qPCR仪进行现场微生物DNA分析

学习使用便携式实时PCR系统进行土壤传播植物病原体的现场分子检测方法。该技术结合磁珠DNA提取，可在田间快速诊断病害，有效防止病原体二次传播，为农业生产提供重要的病害管理工具。

利用便携式实时PCR系统对土传植物病原体进行现场分子检测

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