Name: 一种简单的高通量化学筛选方法在秀丽线虫中的应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: 学习在秀丽线虫中进行高通量化学筛选的方法，用于衰老研究和寿命延长化合物的快速检测。该方法可在96孔板中高效培养Caenorhabditis elegans，实现大规模表型筛选。

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感谢Dipa Bhaumik、Aaron Miller和Bob Hughes提供的技术支持。菌株由CGC提供，CGC由美国国立卫生研究院（NIH）研究基础设施项目办公室资助（P40 OD010440）。我们感谢Georgia Woods以及Lithgow、Kapahi和Melov实验室成员的有益讨论。M.L.得到了美国国立卫生研究院（NIH）培训基金T32 AG000266以及艾里森医学基金会/美国衰老研究联合会博士后奖学金的支持。本研究得到了BioAge Labs的资助、Larry L. Hillblom基金会资助，以及美国国立卫生研究院基金UL1024917（支持衰老科学跨学科研究联盟）和1R01AG029631-01A1（资助给G.J.L.）的支持。

1. 缓冲液的配制
<ol>
	<li>LB肉汤
	<ol>
		<li>使用预混颗粒（参见材料表），并按照生产商的说明进行配制。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>线虫生长培养基（NGM）琼脂
	<ol>
		<li>将23 g琼脂、3 g NaCl、2.5 g胰蛋白胨与去离子水混合至0.972 L。高压灭菌后冷却至60 °C，然后加入25 mL 1 M磷酸钾（KPO4）缓冲液（pH 6.0）、1 mL 1 M硫酸镁（MgSO4）、1 mL 1 M氯化钙（CaCl2）和1 mL 5 mg/mL胆固醇（溶于乙醇）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>次氯酸盐溶液
	<ol>
		<li>将5 mL 5 M KOH、4 mL次氯酸钠溶液（6%）和去离子H2O混合至总体积为50 mL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>S基础培养基
	<ol>
		<li>将5 g NaCl、1 g K2HPO4、6 g KH2PO4与去离子水混合至1 L，然后高压灭菌。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 浓缩液的制备 E. coli OP50
注意：此步骤将 1 L 饱和的大肠杆菌溶液浓缩至 25 mL S 基础缓冲液中。
<ol>
	<li>取5 mL已高压灭菌的LB液体培养基（步骤1.1），接种一单个大肠杆菌（E. coli）菌落（菌株OP50），于37 °C、250 rpm振荡培养4–6小时。取0.1 mL该菌液接种至2 L锥形瓶中的1 L LB培养基中。将1 L培养瓶于37 °C、250 rpm振荡条件下过夜培养（12–16小时）。</li>
	<li>将1 L过夜培养物分装至500 mL离心瓶中，于10,000 × g、4 °C离心5分钟，收集菌体沉淀，并弃去上清液。用25 mL S Basal缓冲液（步骤1.4）重悬菌体沉淀。4 °C保存备用。</li>
</ol>
3. NGM 培养平板的制备
<ol>
	<li>对于用于大量培养线虫的培养板，在超净工作台中使用自动液体分配装置或血清移液管，将30 mL熔融状态（60 °C）的NGM琼脂（步骤1.2）加入10 cm培养板中。静置过夜使其干燥。</li>
	<li>向每个10 cm培养板中加入2 mL浓缩的OP50菌液，通过倾斜和旋转培养板使菌液完全覆盖琼脂表面，然后让培养板自然干燥。将培养板置于4 °C保存，最多可保存2周。</li>
	<li>对于用于高通量筛选实验的培养板，在超净工作台中使用自动八通道分配器，将0.15 mL熔融NGM琼脂加入96孔板的每个孔中。操作时需注意确保各孔中无气泡残留，因为气泡会导致线虫钻入其中，从而影响该孔的实验结果。静置过夜使其干燥。将培养板置于4 °C保存，最多可保存2周。</li>
</ol>
4. 温度敏感型（ts）无菌 C. elegans 大量培养的制备
<ol>
	<li>开始培养时，在解剖显微镜下使用“线虫挑取工具”（带铂金丝的玻璃移液管或商品化线虫挑取工具），将20个卵（菌株TJ1060：spe-9(hc88)I; rrf-3(b26)II）转移至按步骤3.1制备好的大量培养板上。随后，将培养板在20 °C下孵育6天（允许多代生长，因目标是收集最初转移的20个卵的后代）。</li>
	<li>在解剖显微镜下目视确认存在产卵成虫（子宫内可见卵）。用玻璃移液管向培养板中加入2–3 mL S基础液，手动轻轻旋转液体使成虫悬浮，然后用玻璃移液管将液体收集至15 mL离心管中。</li>
	<li>将离心管以1,000 × g离心1.5分钟（20 °C），使线虫沉淀；吸除上清液。向线虫沉淀中加入10 mL次氯酸盐溶液（步骤1.3），用手上下快速振荡试管5秒。孵育5分钟，每2.5分钟振荡一次。</li>
	<li>再次将离心管以1,000 × g离心1.5分钟；沉淀应呈黄褐色。吸除上清液。向卵沉淀中加入10 mL次氯酸盐溶液，并剧烈振荡试管。孵育1–3分钟，期间偶尔振荡，并在解剖显微镜下观察形态变化。需目视确认仅剩卵存在后，方可进行下一步。</li>
	<li>将离心管以1,000 × g离心1.5分钟，吸除上清液。此时沉淀应为白色，无任何褐色残留。 
	注意：去除次氯酸盐溶液后，必须采用无菌操作技术和无菌缓冲液，因为污染（尤其是细菌和真菌污染）可能破坏实验，造成宝贵时间和试剂的浪费。本研究使用经过滤的层流洁净柜，并仅使用无菌移液管和枪头进行液体操作。</li>
	<li>在无菌环境中打开离心管。用S基础液清洗沉淀3次，每次均以1,000 × g离心1.5分钟，并吸除上清液。将卵沉淀重悬于2–3 mL S基础液中。这些卵现在可用于缓冲液中过夜孵化，以收集L1幼虫（步骤5）。</li>
</ol>
5. 在缓冲液中孵化 C. Elegans 卵以获得同步培养物（制备 L1 期幼虫 C. Elegans）
<ol>
	<li>将卵沉淀和缓冲液倾倒至带盖的无菌玻璃培养皿中。使用移液管吸取2-3 mL S基础培养基，将管内残留的卵冲洗入培养皿。加入5 mL S基础培养基以降低密度，过度密集可能促进孵化，轻度振荡（使用腹舞者型摇床，20 rpm）亦可促进孵化。于20 °C孵育过夜（16-24 h），以使卵有足够时间孵化。由于缺乏食物，所有孵化出的幼虫将停滞在1龄幼虫阶段（L1）。 
	注意：经验性证据表明，新鲜制备的L1幼虫（卵收集后16-36 h内）可获得同步性最高的成虫群体。</li>
	<li>使用移液管将L1幼虫收集至15 mL离心管中。在离心机中离心（1,000 × g，1.5 min），吸除上清液，并重复此步骤，直至从孵化培养皿中收集全部L1幼虫，最后保留10 mL S基础培养基用于下一步。</li>
	<li>从含有L1幼虫的离心管中，充分混匀后立即用微量移液器吸取0.01 mL样品，滴加至未接种（无E. coli）的NGM平板上。计数平板上的L1幼虫数量。重复该操作10次，计算每份0.01 mL样品中L1幼虫的平均数量。通常情况下，每µL可含有1-3条L1幼虫（起始培养物为一个含20个卵的大量培养平板时）。</li>
	<li>使用移液管测定含有L1幼虫的S基础培养基总体积，再根据上一步获得的每0.01 mL中L1幼虫的平均数量，推算出L1幼虫的总数。通常情况下，每块含20个卵的大量培养平板可获得10,000-30,000条L1幼虫。</li>
	<li>若将此培养物用于96孔板检测，需在无菌圆形培养瓶中将L1悬浮液稀释至每µL含1条L1幼虫，随后进行第7步操作。若该培养物用于扩增更多的C. elegans大量培养物，则直接进入第6步。</li>
</ol>
6. 大规模同步培养物的制备
注意：L1 溶液可用于快速增加线虫种群数量。
<ol>
	<li>为了获得大量L1期线虫，将最多5,000条L1期幼虫分别接种到所需数量的大规模培养板上。在20 °C条件下培养2.5天后，按照步骤4.1–4.2所述方法收集产卵期成虫，并进入步骤4.3以收集卵。</li>
	<li>据非正式观察表明，反复使用次氯酸盐处理会对种群造成应激。因此，在对剩余种群进行次氯酸盐处理前，应先通过挑取卵的方式分离出部分种群用于后续传代培养，以避免同一谱系的种群连续多代反复暴露于次氯酸盐溶液中。</li>
</ol>
7. 96孔检测板的设置
<ol>
	<li>将检测板（在步骤 3.3 中制备）恢复至室温。然后在超净工作台中，使用自动八通道分液器向每孔加入 5 µL 浓缩的 OP50 菌液（在步骤 2.2 中制备）。</li>
	<li>使用自动八通道分液器向每孔加入 10 µL L1 蚴悬液。由于悬液中 L1 蚴的浓度为每 µL 含 1 条 L1 蚴，因此每孔平均可获得 10 条线虫。为促进悬液中 L1 蚴均匀分布，应将 L1 蚴悬液置于圆形培养瓶中，并使用转速适中的磁力搅拌器持续混匀，再从此瓶中进行分液。</li>
	<li>盖上培养板盖，将多块培养板装入盒中，于 25 °C 培养 2 天。</li>
</ol>
8. 处理 1 st 成年日 秀丽隐杆线虫 使用化学品
<ol>
	<li>从冰箱中取出化合物文库板，待其升至室温后再进行后续操作。 
	注意：此处所述的化合物文库板为96孔板，每孔含有独立的化合物，所有化合物浓度相同且溶解于DMSO中。这些文库不使用外周列孔，因此每块板最多含有80种不同的化合物。在本方案中，文库化合物浓度为10 mM。需注意溶剂对表型的影响。尽管本研究在0.5% DMSO浓度下进行筛选，但在这些寿命测定以及低通量实验中，从未超过该浓度；在选择化合物储备液浓度时更有可能超出此限。本方案中DMSO浓度不超过0.25%，该浓度下不会引起寿命改变16，至少在N2品系中如此。</li>
	<li>使用微孔板振荡器，在使用前以60 rpm轻轻振荡1分钟。</li>
	<li>使用自动化的96孔液体处理仪，将0.75 µL的化合物（或DMSO）从文库板转移至检测板。在向检测板加液时，需精确控制移液深度，确保液体处理仪的吸头将0.75 µL液体加入到琼脂表面约15 µL的液滴中（含步骤7.1–7.2中的线虫和浓缩OP50），且不刺破孔内的琼脂表面。除极小规模筛选（&#60;10块板）外，不得使用手动8通道或12通道移液器，因其可能增加误差，并常导致琼脂表面被刺穿，从而影响实验结果。</li>
	<li>若待测文库以DMSO（二甲基亚砜）作为溶剂，则需制备含DMSO的化合物文库阴性对照板。每5块测试板配制1块阴性对照板，最多不超过10块阴性对照板。如条件允许，还可制备阳性对照板（NP11，20 mM，最终检测浓度为0.1 mM，适用于此目的；参见代表性结果部分）。请勿将任何化学物质（测试物或对照物）添加至板的两个外周列孔，因其特别容易发生干燥。</li>
</ol>
9. 培养物的干燥
<ol>
	<li>为去除琼脂表面的液体，将平板置于超净工作台中干燥 4–8 小时。关键是要将这些平板彻底干燥，但不能使其脱水。由于不同平板的干燥时间可能不同，需密切观察所有平板，并在干燥后立即取出。通过仔细目视检查平板的各个孔来确认干燥程度。 
	注意：具体干燥时间取决于包括工作台排气速率在内的多种因素，需通过实验确定。对于装满的整个工作台，此干燥步骤可能需要约 4–8 小时。</li>
	<li>用透明封膜密封平板，然后盖上平板盖。</li>
	<li>将 96 孔检测板在 1,000 × g 条件下离心 45 秒。</li>
	<li>将平板倒置，于 25 °C 保存。</li>
</ol>
10. 线虫（C. Elegans）培养物的寿命评分
<ol>
	<li>监测阴性对照孔板，直至观察到&#62;95%的死亡率。前两周每周检查一次孔板，之后每日检查。相同品系和物种的Caenorhabditis群体在不同实验中可能表现出显著不同的寿命17。 
	注意：对于本实验中所述的寿命测定，TJ1060动物在25 °C下培养时，这些群体在成虫第16至20天之间已达到95%的死亡率。</li>
	<li>当阴性对照孔被认为已达到&#62;95%死亡率时，将所有96孔测定板置于配备微孔板转子的台式离心机中，以250 × g、20 °C离心45秒。</li>
	<li>对所有对照孔板中的孔进行评分。方法是计数并记录每个孔中存活和死亡的线虫数量。死亡线虫与存活线虫可通过其是否完全无运动来区分。可通过将96孔板从约7 cm高度反复跌落至解剖显微镜台面上，同时通过目镜观察是否引发运动反应，以判断线虫是否存活。死亡线虫不会产生反应，但需注意重复跌落可能产生噪音，影响周围实验人员。</li>
	<li>对于测试孔板，仅需计数并记录含有存活线虫的孔。当观察到存活线虫时，应计数该孔中所有存活和死亡个体的数量，并记录孔的位置及对应的孔板编号。 
	注意：通常在阴性对照线虫死亡率达到&#62;99%后重新评分孔板较为有利。在大规模筛选实验中，这可能是进行首次评分的最佳时机。无论何种情况，均应按照上述方法进行评分或重新评分。</li>
</ol>
11. 重新测试化合物
<ol>
	<li>当测试的候选化合物数量较少（&#60;320 种化合物）时，例如进行复测或候选物筛选（参见代表性结果），应将检测限制在培养板中央的 32 个孔内，以尽量减少可能的板间效应。这样可使最靠近板边缘的 2 个孔保持未处理状态，但仍含有琼脂、食物和线虫。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明，支持本工作的资助机构对数据收集、结果分析或发表决定均无任何影响。

本文介绍了一种在96孔板中培养C. elegans的简单方法。我们描述了该培养方法在化学筛选和寿命测定中的应用，但它也可用于多种类型的实验分析。尽管此前已有报道使用多孔板进行化学筛选的培养条件8，包括用于寿命分析的方法10，但本文所述的实验方法在多个方面有所不同。本方法中的寿命测定采用96孔板，依赖无菌突变体（而非化学法灭菌），使用琼脂培养条件，通过简单的液体操作转移线虫，并在实验终点进行人工评分。本实验所采用的不同策略可能对需要在上述条件下开展筛选研究的科研人员有所帮助。
该实验方案的关键要素主要集中在为检测所制备的培养皿质量上。首先，在制备培养皿时，必须确保琼脂表面无气泡及其他缺陷。琼脂表面的这些不平整几乎总是导致线虫钻入琼脂，从而造成孔穴消失。其次，本方案依赖于在加样和加药阶段所加入液体的充分干燥。关键在于，这些液体必须完全去除，但琼脂又不能过度干燥。据经验观察，未完全干燥（孔中残留液体，使线虫处于“游泳”状态）的孔中线虫存活时间往往比完全干燥的孔更长；而培养皿过度干燥则会导致琼脂脱水开裂，进而引起线虫钻入琼脂并丢失。本方案的另一个关键要素是维持无菌条件。与任何寿命检测实验一样，该实验的培养皿制备过程涉及大量操作，存在较多污染机会和较长时间窗口，可能导致污染在培养皿上定植并生长，从而破坏实验结果。
尽管本文所述的寿命测定方法适用于在线虫C. elegans中筛选化合物，但其应用局限于特定的遗传背景，因为该方法依赖于一种温度敏感（ts）的不育品系；我们使用的是TJ1060，该品系具有较高的不育渗透性。这限制了可用于此方法筛选的品系范围。替代方案包括将ts不育突变导入目标遗传背景，或采用化学方法进行不育处理。我们尚未在此测定中尝试化学不育法，但理论上是可行的。可能面临的挑战包括在正确的发育阶段以适当的剂量对线虫施加不育剂。本文所述方案使用了一种快速的液体分配仪，但该仪器似乎无法有效分配成虫。因此，这些线虫会在培养板上继续发育，必须在板上对其进行化学不育处理。确定最佳剂量和处理时机对实验成功至关重要。其他策略包括采用能够转移成虫的分配方法。过去我们发现，能够识别并分选成虫的设备通常远比简单的液体处理仪慢，后者可快速分配悬浮幼虫的均一悬液。
通常，我们使用该方法快速筛选对寿命具有显著正向效应的化学物质和处理方式。当采用多个剂量、较高的重复数，并对始终维持且穿插于测试培养板之间的阴性对照进行密切监测时，该方法尤为有效。在设计和实施本文所述的筛选实验时，阳性对照也具有重要参考价值。然而，要成为有效的阳性对照，该对照物质需具备较强的效应和/或高度的可重复性。在最初开展筛选时，未能鉴定出具有足够强效且稳定的化合物。目前，在“衰老”领域的文献中已有大量关于可能适用于本文所述筛选实验的阳性对照候选物的报道。如本文预期结果部分的候选物筛选小节以及图2和表1所述，化合物NP1是本筛选实验中有效的阳性对照。我们通常会通过在3 mm培养板上进行标准寿命测定实验，来验证这些筛选中获得的阳性结果。

本文描述了一种为高通量筛选化学化合物对Caenorhabditis elegans寿命影响而开发的实验方案。该方案本身可轻松适用于其他表型筛选，包括利用报告基因C. elegans品系的研究。本方案已成功用于鉴定一种新型生物活性化合物NP1（硝基苯基哌嗪1），该化合物通过饮食限制机制显著延长C. elegans的寿命。NP1及其对寿命影响的表征，包括相关遗传通路的描述，已在其他文献中报道1。该文献还包含了大规模实施该筛选所得结果的描述。本文则更为详细地阐述了筛选方法本身的技术细节与实验设置，该方法可适用于小规模和大规模应用，并具有良好的可扩展性。
制定本方案的初衷是开发一种 秀丽隐杆线虫 一种培养平台，可实现对大型化合物库进行快速筛选，以发现新的生物活性化合物。尽管在本方案建立之前已有化学筛选的报道，但这些筛选主要为小规模和/或基于候选分子的策略2,3事实上，实验室中对数十种化合物进行的筛选大多采用了应激抗性检测，并对筛选出的阳性化合物进一步检验其对寿命的影响4本研究旨在直接筛选对寿命的影响。值得注意的是，当时科学文献中关于大规模化学筛选的描述极少 秀丽隐杆线虫。事实上，与其他类型的筛选相比5,6,7大规模化学筛选使用 秀丽隐杆线虫 似乎未被充分使用。
已有两项关于在C. elegans中开展大规模化学筛选的研究，本方法的建立即以此为基础。其中第一项研究来自Peter Roy实验室，该研究通过化学筛选鉴定出能够干扰动物发育的化合物，并进一步采用正向诱变筛选来确定这些化合物的遗传靶点8。该研究所描述的实验方案使用24孔板，但这一设计无法满足本研究的具体需求（化合物文库中样品量有限，且可用的培养箱空间受限）。第二项研究是Michael Petrascheck实验室开展的一项创新且宏大的小分子筛选，旨在寻找延长寿命的化学物质9,10。该研究采用384孔板和液体培养体系。该筛选的另一个主要特点是使用FUDR（5-氟脱氧尿苷）来化学抑制后代的产生。在充分评估该研究所描述的方案后，本研究避免了使用化学去繁殖方法以及C. elegans的液体培养体系。
尽管 FUDR 广泛用于 C. elegans 寿命实验，但人们一直担心 FUDR 可能引起未预料的药物相互作用，或 FUDR 本身可能对寿命产生一定影响。最近，至少在某些浓度下，特别是在 25 °C 时，后一种担忧已得到证实11。为避免子代污染的问题，本研究采用了 C. elegans 菌株 TJ1060，该菌株携带两个独立的温度敏感突变（spe-9(hc88)I；rrf-3(b26)II），可阻断精子生成，并已被证明适用于同步群体的大规模培养12。该菌株在 25 °C 下完全不育，但在 15–20 °C 下培养时可产生后代。本研究采用常规培养条件，即线虫在琼脂表面爬行，因为液体培养获得的结果在常规琼脂平板上并不总是可重复。尽管这一现象尚未完全阐明，但已有研究表明，在液体培养中生长的线虫对限制饮食（DR）的反应与在标准培养基上生长的线虫不同13,14。因此，液体培养基可能会掩盖某些本可在筛选中被识别的限制饮食模拟物。
在确定了琼脂培养条件后，我们考虑了对该实验中各孔表现进行评分的不同方案。尽管存在多种基于自动化或成像的检测方法，但这些方法需要购置和使用技术上较为复杂的设备，其中大多数成本过高而难以承受。在评估这些选项时，参考以往各类寿命筛选实验的研究至关重要。最终，本研究采用了一种改编自Siu Sylvia Lee实验室全基因组RNAi寿命表型筛选的评分方法15。具体而言，所有寿命测定平板均以相同方式制备，但仅对阴性对照组进行监测。一旦确认阴性对照平板接近完全死亡，即通过人工对测试平板进行评分。在此项大规模筛选中，阳性结果通过使用新配制的化合物进行复测予以确认，并对初筛阳性样本设置三个重复组进行验证。

<table><tbody><tr><td>LB 肉汤 Miller 颗粒</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Unispense&amp;nbsp;</td><td>Wheaton Science Products</td><td></td><td>自动液体分液装置</td></tr><tr><td>96 孔检测板；COSTAR 3370</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multidrop 384；自动化 8 通道分液器</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>定制线虫挑取工具</td><td>Genesee Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Belly Dancer 轨道摇床</td><td>Stovall Life Science inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微孔板摇床；MTS 2/4 Digital</td><td>IKA Works, inc.&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>自动化 96 孔液体处理仪；Biomek FX Liquid Handler</td><td>&amp;nbsp;Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>自动化 96 孔液体处理仪；Bench Top Pipettor&amp;nbsp;</td><td>Sorenson Bioscience, inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>手动 8 或 12 通道多通道移液器</td><td>我们使用 Rainin&amp;hellip;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>透明 96 孔薄膜盖；TempPlate RT Optical Film&amp;nbsp;</td><td>USA Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>台式离心机；Centrifuge 5810 R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

一种在caenorhabditis elegans中进行高通量化学筛选的简单方法

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans 是一种用于检测化学物质对生理影响的有用模式生物。以完整生物体为基础的小分子筛选在鉴定能够调控复杂表型（如寿命）的生物活性化学结构方面具有显著优势。本文描述了一种简便的实验方案，可用于制备数百个96孔培养板，使每个孔中的 C. elegans 数量相对一致。随后，我们详细说明了如何利用这些培养物对数千种化合物进行筛选，以评估其对线虫 C. elegans 寿命的影响。该方案利用温度敏感型的不育品系、琼脂平板培养条件以及简单的动物操作方法，从而实现同步化动物培养物的快速、高通量制备，便于开展大规模筛选。

我们首先考察采用本方案进行96孔寿命测定所获得的代表性结果。在第一个示例中，该方法被用于筛选30,000种化合物，成功鉴定出能够延长C. elegans寿命的化合物，并包含了对表现最佳化合物采用相同方案进行后续复测的结果。这些结果此前已有描述1。第二个示例则使用相同方案对候选化合物进行小规模筛选。
大规模筛选与重复验证：对 30,000 种化合物进行的大规模筛选以单剂量、双重复的方式进行。因此，每种化合物在两个孔中进行测试，预期每个孔中的动物总数为 20。为完成该筛选，将三组独立的 10,000 种化合物（每组双重复）在约 3 个月的时间内依次完成，以覆盖全部 30,000 种化合物。部分原因是为确保在实验结束时手动评分的工作量可控，每组筛选共需 260 块 96 孔检测板。在文库储存板中，仅有 80 个孔含有化合物；一组 10,000 种化合物的重复将使用 125 块检测板。本研究每组使用两个重复，并包含 10 块阴性对照板。为提高通量，当评估阴性对照组群的死亡率达到约 99% 时即进行板读评分，随后检查所有测试孔中是否存在存活的蠕虫。
含有一个活体线虫的孔中的化合物被称为“命中”。含有一个以上活体线虫的孔中的化合物也被视为“命中”，并额外统计该孔中所有线虫（包括活体和死亡个体）的数量，以生成一个简单的评分（存活率评分；即活体线虫数量除以死亡线虫数量）。因此，文库中的每种化合物可能被两次判定为“命中”，而这些“命中”可能但不一定都附带评分。在30,000种化合物的筛选中，共有512种不同的化合物至少被判定为一次“命中”。本次筛选旨在鉴定具有强效和/或稳健（可重复）促长寿效应的化合物。这两种不同性质可能产生不同的影响：强效化合物可能显著延长寿命，此时我们预期该化合物孔中存活线虫的比例较高；而对于稳健化合物，两个重复孔中均应观察到活体线虫。因此，“命中”列表依据上述标准进行排序。其中有179种化合物获得了较高的存活率评分，或在两个重复实验中均被判定为“命中”，因而被选中进行复筛。其余未被选中复筛的“命中”化合物大多仅在一个重复孔中检测到单个活体线虫。
对初筛命中化合物进行了复测，方法与初筛类似，但设置3个重复（预期总动物数量为30只），并对未处理对照组平板中的动物寿命进行了仔细的定量分析。这些调整有助于更准确地比较测试组与对照组。共重新订购了179种命中化合物，将其稀释至10 mM，并转移至96孔板中。复测实验仅使用板内侧的24个孔（当前版本的方案会使用内侧32个孔，如复测筛选方案部分所述），化合物以3个重复进行测试，同时设置6个经DMSO溶剂处理的阴性对照板。其中一个阴性对照板定期记录总体存活情况（图1A）。当约95%的对照组动物死亡时，对所有平板完成最终评分（统计所有处理组中存活和死亡的线虫数量）。
为从复测结果中确定阳性信号，设定阴性对照的平均存活率加2个标准差（SD）作为阈值。对于测试孔，其平均存活率（在评分时间点）通过计算每个孔三个重复的存活率平均值得出。在本项特定实验中，阴性对照孔的平均存活率是基于48个孔（2块三重复阴性对照板）的三个重复值计算所得。用于从复测化合物集中确定阳性信号的标准差（SD），是基于48个阴性对照孔的平均存活率计算所得。采用该策略，本研究在179种化合物的复测文库中发现了57个阳性信号，表明复测化合物中总计有32%呈阳性结果（图1B）。对阴性对照孔和测试孔的平均存活率进行区间分布分析表明，测试孔的表现优于对照孔（图1C）。
候选化合物筛选：小规模筛选可采用与上述复测类似的方法进行。本文描述了一项包含139种化合物的候选化合物筛选结果。这些候选化合物的结构被认为可能具有促进长寿的潜力。在本次筛选中，我们对两种不同浓度（50 µM 和 100 µM）的测试平板各进行了5次重复实验。此外，我们使用了8块阴性对照平板，以及一块含有两种不同浓度（50 µM 和 100 µM）的阳性对照（NP1）平板。
阴性对照组平板持续监测至约 90% 的动物死亡。此时，通过计数所有对照孔以及含有存活线虫的测试孔中的活虫与死虫数量进行评分。以评分时的存活百分比计算每孔的平均存活率。对于阴性对照组，32 个孔的存活率数据来自 8 个重复。对于阳性对照组，每个剂量的 4 个孔评分取 4 个重复的平均值。当某孔的平均存活率大于阴性对照组平均存活率加 2 倍标准差（+2 SD）时，判定为阳性结果。该阈值从候选筛选中筛选出 14 个阳性结果，同时排除了所有阴性对照孔。该阈值还包含了所有在 100 µM 浓度下处理的阳性对照孔，以及 50% 在 50 µM 浓度下处理的阳性对照孔。这些结果以分组的平均存活百分比形式展示，分别对应 50 µM（图 2A）和 100 µM（图 2B）的测试筛选结果。
最后，所有培养板在较晚的时间点重新进行了评分，此时超过99%的阴性对照处理的动物已经死亡。结果显示，阳性对照孔的表现远优于阴性对照孔和测试孔（图2C），而测试孔的表现仅略优于阴性对照孔。后一结果可能受到以下情况的偏倚影响：许多测试孔相对于对照处理表现出毒性迹象（表1），从而干扰了这一简单的解释。这一情况在意料之中，因为候选化合物库是对生物活性未知的化学物质在 C. elegans 中进行的真实筛选，而复测筛选实质上已预先排除了具有毒性的化合物。由于本次初筛的目标是延长寿命的化合物，因此显著有毒的化学物质不应出现在复测集合中。
<img alt="生存曲线与分箱评分结果；TJ1060 的复测筛选；图表与表格分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56892/56892fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1：高通量筛选及复测的代表性结果 
（A）复测实验中使用的代表性阴性对照板的生存曲线。该曲线基于在18天实验期间，对本实验所用的24个孔中所有活体和死亡线虫进行4次评分的结果绘制而成。在成虫第18天时，对照组的生存率评估约为5%，随后对所有对照测试板也进行了评分。（B）总结筛选与复测结果的表格。（C）复测筛选中对照组和测试组各孔平均存活百分比评分的分箱结果。对照组数据来自48个孔，每个孔为3个重复的平均值；测试组结果来自179个孔，每个孔为三个重复的平均评分值。图 1 改编自先前发表的研究1。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56892/56892fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="小规模筛选结果按分组评分；柱状图；测试孔的生存分析；数据表格。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56892/56892fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2候选筛选的代表性结果 
(A结果的分箱处理 50 µM 候选筛选。139个测试孔的结果来自5个重复的平均存活率得分。32个阴性对照结果来自8个重复的平均存活率得分。4个阳性对照结果来自4个重复的平均存活率得分（共16个孔含有NP1） 50 µM). (B结果的分箱处理 100 µM 候选筛选。所有条件与 (A) 相同，唯测试孔和阳性对照组在 100 µM 浓度。相同的阴性对照平板在（A 和 B). (C在相对较晚的极端时间点重新评分平板的代表性结果。若仅根据此时间点含有活体线虫的孔百分比进行评估，则阳性对照组的表现显著优于所有其他组，但如正文所述，这种评估方式会对测试孔产生偏差。 表1. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56892/56892fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="6">平均存活率评分的分组</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>分组评分</td>
			<td>全部死亡 (0)</td>
			<td>1-10</td>
			<td>11-20</td>
			<td>21-30</td>
			<td>31-40</td>
			<td>&gt;41</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>重新测试</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td># 阴性对照孔数</td>
			<td>16</td>
			<td>31</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td># 测试孔数 (50µM)</td>
			<td>46</td>
			<td>69</td>
			<td>50</td>
			<td>8</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>候选化合物筛选</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td># 阴性对照孔数</td>
			<td>0</td>
			<td>11</td>
			<td>21</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td># 阳性对照孔数 (50µM)</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td># 阳性对照孔数 (100µM)</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td># 测试孔数 (50µM)</td>
			<td>94</td>
			<td>22</td>
			<td>21</td>
			<td>2</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td># 测试孔数 (100µM)</td>
			<td>86</td>
			<td>25</td>
			<td>21</td>
			<td>6</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：不同筛选实验分组结果的代表性数据 
本文展示了两次筛选实验（复测和候选化合物）的平均存活率得分的分组结果。在复测筛选中，峰值与阴性对照相似，但在表格右侧（长寿侧），复测组的表现显著优于阴性对照，表明复测化合物集合中存在多种具有促长寿作用的化合物。在候选化合物筛选中，我们观察到峰值位于全部死亡类别中，但表格右侧也显示出明显的信号，这表明候选化合物集合中存在促长寿化合物，同时也提示该化合物集合中具有显著的毒性作用。

本文介绍一种简单的方法，可快速制备数百个线虫生长培养基琼脂96孔培养板，每孔中秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）数量一致。这些培养体系适用于整只生物体的表型筛选。本文重点介绍利用这些培养体系筛选具有促长寿作用的化学物质。

一种在Caenorhabditis elegans中进行高通量化学筛选的简单方法

秀丽隐杆线虫是检测化学物质对生理功能影响的有用生物模型。全生物小分子筛选具有显著优势……

该技术的总体目标是通过高通量检测方法，测试不同化合物对模式生物秀丽隐杆线虫（C.elegans）的影响。该方法有助于回答化学、生物学和衰老研究领域中的关键问题，例如特定的化学结构是否能够延长秀丽隐杆线虫的寿命？该技术的主要优势在于，能够以高效且快速的方式对大量化合物进行筛选。为大量培养线虫以制备大规模培养皿，在超净工作台中，首先将30毫升60摄氏度的线虫生长培养基琼脂倒入10厘米的培养皿中，过夜凝固。次日早晨，向每块培养皿中加入2毫升浓缩的大肠杆菌（E.coli），倾斜并旋转培养皿，使细菌完全覆盖整个培养皿表面。当大规模培养皿干燥后，将其置于4摄氏度保存，最多可保存两周。为制备用于筛选的高通量检测培养板，使用自动八通道分液器将 0.15 毫升熔融的线虫生长培养基琼脂加入 96 孔板的每孔中。让琼脂过夜凝固，随后将高通量检测板在 4 摄氏度下保存，最长可保存两周。为建立秀丽隐杆线虫（C. elegans）培养物，使用线虫挑取工具和解剖显微镜将20个卵转移至每块大量培养板上，并将培养板在20°C条件下孵育六天。第七天时，使用解剖显微镜观察确认子宫内是否存在卵。为收集 gravid 成虫，使用玻璃移液管向每块培养板加入2至3毫升S Basal溶液，并用手轻轻旋转每块培养板使溶液混匀。使用玻璃移液管将线虫转移至15毫升离心管中，通过离心沉淀线虫。将线虫重悬于10毫升次氯酸盐溶液中，快速上下振荡试管5秒。随后，在室温下孵育5分钟，每2.5分钟振荡一次。孵育结束后，再次离心线虫。沉淀物应呈黄褐色。弃去上清液，加入10毫升新鲜次氯酸盐溶液，再次剧烈振荡试管。将线虫再孵育一到三分钟，期间偶尔振荡。当仅剩下卵时，离心试管并吸除上清液。沉淀物应为白色，无褐色着色。采用无菌操作技术，在无菌超净工作台中打开试管，向每份沉淀中加入 14 毫升 S 基础溶液。用 14 毫升 S 基础溶液将沉淀洗涤三次。经过三次离心洗涤后，将虫卵重悬于 2 至 3 毫升新鲜的 S 基础溶液中。为制备L1期幼虫阶段的秀丽隐杆线虫（C. elegans），将上清液转移至每根试管对应的无菌玻璃培养皿中，并用2至3毫升S Basal溶液冲洗试管中残留的卵进入各培养皿。向每个培养皿中加入5毫升S Basal溶液以减少拥挤，将培养皿置于20摄氏度、20 rpm条件下在摇床上振荡16至24小时，以促进孵化。由于缺乏食物，所有孵化出的幼虫将在第一幼虫期（L1）发生发育停滞。使用血清学移液管将L1幼虫转移至15毫升离心管中进行离心。通过反复离心和吸弃上清液，将所有孵化出的L1幼虫收集起来后，用10毫升无菌S Basal溶液重悬幼虫沉淀。然后，取10微升转移至未接种的培养板，计数板上存在的幼虫数量。重复此步骤10次，以获得溶液中L1的平均密度。使用无菌刻度移液管，测定含有L1的溶液的总体积。接着，利用L1溶液的体积和溶液中L1的密度，计算溶液中L1的总数量。将线虫接种至96孔高通量检测板时，先在无菌的圆形培养基瓶中用适度缓慢旋转的搅拌子将L1期幼虫悬浮液稀释至每微升含一个L1幼虫，并使检测板恢复至室温。随后，在超净工作台内，向每孔加入5微升浓缩的大肠杆菌（E.coli），再向每孔加入10微升L1悬浮液，使每孔平均含有10条线虫。接种完成后，盖上板盖，于25°C培养两天，使幼虫发育为成虫。孵育结束后，将冷冻保存的化合物文库板恢复至室温。使用微量板振荡器，在加样前立即以60 rpm轻轻振荡解冻后的文库板1分钟。利用自动化的96孔液体处理设备，从文库板中向检测板转移0.75 µL化合物。当所有孔均处理完毕后，在超净台中将化合物从板表面风干4至8小时，并在板干燥后立即取出。用透明封膜密封干燥后的板，并盖上盖子。然后在1000 G条件下离心45秒，并将其倒置存放于25摄氏度环境中。为了检测秀丽隐杆线虫（C. elegans）对目标化合物的反应，可使用阴性对照平板记录总存活率，直至95%的对照组动物死亡，此时可对所有测试平板进行评分。例如，在本研究中，从包含179种化合物的复筛文库中观察到57个阳性结果，表明所测试的复筛化学品总体中有32%呈阳性。对阴性对照孔和测试孔的平均存活百分比进行分组分析表明，测试孔的表现优于对照孔。也可以进行小规模筛选，如本代表性测试实验所示，其中使用了50微摩尔和100微摩尔浓度的待测化合物。当经阴性对照处理的动物死亡率超过99%时，对这些小规模筛选测试板重新评分的结果表明，阳性对照孔的表现远优于阴性对照孔和测试孔，而测试孔的表现略优于阴性对照孔。在本实验中，由于许多测试孔相对于对照处理显示出毒性迹象，这一简单解释受到了干扰。一旦掌握，若操作得当，该技术可在两到四周内完成。进行此操作时，重要的是保持检测板的完整性，确保其在使用前处于洁净无瑕的状态。采用该技术后，可进一步回答其他问题，例如，这些化合物中哪一种可诱导线粒体自噬？对于线粒体自噬检测，应使用线粒体自噬报告基因片段。观看本视频后，您将清楚了解如何利用秀丽隐杆线虫（C. elegans）作为模式生物进行高通量化学筛选。

a-simple-method-for-high-throughput-chemical-screening-caenorhabditis

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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C. elegans 中的定量自动化高通量全基因组 RNAi 筛选

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