一种在Caenorhabditis elegans中进行高通量化学筛选的简单方法

该技术的总体目标是通过高通量检测方法，测试不同化合物对模式生物秀丽隐杆线虫（C.elegans）的影响。该方法有助于回答化学、生物学和衰老研究领域中的关键问题，例如特定的化学结构是否能够延长秀丽隐杆线虫的寿命？该技术的主要优势在于，能够以高效且快速的方式对大量化合物进行筛选。

为大量培养线虫以制备大规模培养皿，在超净工作台中，首先将30毫升60摄氏度的线虫生长培养基琼脂倒入10厘米的培养皿中，过夜凝固。次日早晨，向每块培养皿中加入2毫升浓缩的大肠杆菌（E.coli），倾斜并旋转培养皿，使细菌完全覆盖整个培养皿表面。当大规模培养皿干燥后，将其置于4摄氏度保存，最多可保存两周。

为制备用于筛选的高通量检测培养板，使用自动八通道分液器将 0.15 毫升熔融的线虫生长培养基琼脂加入 96 孔板的每孔中。让琼脂过夜凝固，随后将高通量检测板在 4 摄氏度下保存，最长可保存两周。

为建立秀丽隐杆线虫（C. elegans）培养物，使用线虫挑取工具和解剖显微镜将20个卵转移至每块大量培养板上，并将培养板在20°C条件下孵育六天。第七天时，使用解剖显微镜观察确认子宫内是否存在卵。为收集 gravid 成虫，使用玻璃移液管向每块培养板加入2至3毫升S Basal溶液，并用手轻轻旋转每块培养板使溶液混匀。

使用玻璃移液管将线虫转移至15毫升离心管中，通过离心沉淀线虫。将线虫重悬于10毫升次氯酸盐溶液中，快速上下振荡试管5秒。随后，在室温下孵育5分钟，每2.5分钟振荡一次。

孵育结束后，再次离心线虫。沉淀物应呈黄褐色。弃去上清液，加入10毫升新鲜次氯酸盐溶液，再次剧烈振荡试管。

将线虫再孵育一到三分钟，期间偶尔振荡。当仅剩下卵时，离心试管并吸除上清液。沉淀物应为白色，无褐色着色。

采用无菌操作技术，在无菌超净工作台中打开试管，向每份沉淀中加入 14 毫升 S 基础溶液。用 14 毫升 S 基础溶液将沉淀洗涤三次。经过三次离心洗涤后，将虫卵重悬于 2 至 3 毫升新鲜的 S 基础溶液中。

为制备L1期幼虫阶段的秀丽隐杆线虫（C. elegans），将上清液转移至每根试管对应的无菌玻璃培养皿中，并用2至3毫升S Basal溶液冲洗试管中残留的卵进入各培养皿。向每个培养皿中加入5毫升S Basal溶液以减少拥挤，将培养皿置于20摄氏度、20 rpm条件下在摇床上振荡16至24小时，以促进孵化。由于缺乏食物，所有孵化出的幼虫将在第一幼虫期（L1）发生发育停滞。

使用血清学移液管将L1幼虫转移至15毫升离心管中进行离心。通过反复离心和吸弃上清液，将所有孵化出的L1幼虫收集起来后，用10毫升无菌S Basal溶液重悬幼虫沉淀。然后，取10微升转移至未接种的培养板，计数板上存在的幼虫数量。

重复此步骤10次，以获得溶液中L1的平均密度。使用无菌刻度移液管，测定含有L1的溶液的总体积。接着，利用L1溶液的体积和溶液中L1的密度，计算溶液中L1的总数量。

将线虫接种至96孔高通量检测板时，先在无菌的圆形培养基瓶中用适度缓慢旋转的搅拌子将L1期幼虫悬浮液稀释至每微升含一个L1幼虫，并使检测板恢复至室温。随后，在超净工作台内，向每孔加入5微升浓缩的大肠杆菌（E.coli），再向每孔加入10微升L1悬浮液，使每孔平均含有10条线虫。接种完成后，盖上板盖，于25°C培养两天，使幼虫发育为成虫。

孵育结束后，将冷冻保存的化合物文库板恢复至室温。使用微量板振荡器，在加样前立即以60 rpm轻轻振荡解冻后的文库板1分钟。利用自动化的96孔液体处理设备，从文库板中向检测板转移0.75 µL化合物。

当所有孔均处理完毕后，在超净台中将化合物从板表面风干4至8小时，并在板干燥后立即取出。用透明封膜密封干燥后的板，并盖上盖子。然后在1000 G条件下离心45秒，并将其倒置存放于25摄氏度环境中。

为了检测秀丽隐杆线虫（C. elegans）对目标化合物的反应，可使用阴性对照平板记录总存活率，直至95%的对照组动物死亡，此时可对所有测试平板进行评分。例如，在本研究中，从包含179种化合物的复筛文库中观察到57个阳性结果，表明所测试的复筛化学品总体中有32%呈阳性。对阴性对照孔和测试孔的平均存活百分比进行分组分析表明，测试孔的表现优于对照孔。

也可以进行小规模筛选，如本代表性测试实验所示，其中使用了50微摩尔和100微摩尔浓度的待测化合物。当经阴性对照处理的动物死亡率超过99%时，对这些小规模筛选测试板重新评分的结果表明，阳性对照孔的表现远优于阴性对照孔和测试孔，而测试孔的表现略优于阴性对照孔。在本实验中，由于许多测试孔相对于对照处理显示出毒性迹象，这一简单解释受到了干扰。

一旦掌握，若操作得当，该技术可在两到四周内完成。进行此操作时，重要的是保持检测板的完整性，确保其在使用前处于洁净无瑕的状态。采用该技术后，可进一步回答其他问题，例如，这些化合物中哪一种可诱导线粒体自噬？

对于线粒体自噬检测，应使用线粒体自噬报告基因片段。观看本视频后，您将清楚了解如何利用秀丽隐杆线虫（C. elegans）作为模式生物进行高通量化学筛选。