Name: 血小板输血中微粒的常规筛选方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-31T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: 学习使用动态光散射技术筛选血小板浓缩液中的微粒含量，以区分活化与非活化血小板。该方法可优化血液肿瘤患者的输血效果，降低难治性风险，为输血医学提供快速准确的评估工具。

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我们感谢献血者以及加拿大血液服务中心应用开发网络中心的工作人员，感谢他们为本研究收集和制备血小板制品。我们感谢加拿大创新基金会和迈克尔·史密斯健康研究基金会为不列颠哥伦比亚大学血液研究中心提供的基础设施资助。本出版物的资助由ThromboLUX制造商LightIntegra Technology Inc.提供。

以下方案的实施均符合加拿大血液服务中心（CBS）的所有指南。志愿者已签署同意书，允许将其捐献的血液用于开展本研究。血小板浓缩物的制备遵循 CBS 标准操作程序。本文所述的所有性能测试均在加拿大不列颠哥伦比亚大学（University of British Columbia）血液研究中心完成，并已获得机构研究伦理委员会的批准。
1. 质量控制检查
<ol>
	<li>每天至少进行一次质量控制检查，以验证动态光散射（DLS）系统的正常运行。按照制造商的使用说明，检测所提供的标准微球（50 nm 半径）。</li>
	<li>从冷藏环境中取出标准品小瓶，静置 15 分钟使其恢复至室温。使用前微球必须充分平衡至室温。</li>
	<li>在准备样品前开启 DLS 系统，确保在第一个样品准备好检测时，激光预热 15 分钟的过程已经完成。</li>
	<li>控制台启动后，按照触摸屏上的指示登录，并选择“系统测试”选项以测量标准样品。</li>
	<li>将小瓶涡旋混匀 10 秒，以确保样品均匀具有代表性。</li>
	<li>使用测试试剂盒中的 100 µL 固定体积移液器、移液器吸头和毛细管，将标准微球填充至毛细管中。</li>
	<li>测试完成后，请遵循 DLS 系统屏幕上的指示。 
	注意：控制微球测试结果将自动与微球条形码标签中存储的信息进行比对，测试结束后 DLS 系统屏幕上将显示“通过”或“未通过”的提示以及样品信息。</li>
</ol>
2. 从血小板浓缩物中获取样本
注意：这些步骤描述了血小板输注过程中用于常规血小板库存管理的非侵入性取样至DLS检测毛细管的操作流程。流程概述见图1。所需配件：封管器、手动脱管器、剪刀和防溅罩。
<ol>
	<li>从未经检测的库存中取出血小板浓缩液。</li>
	<li>从一个未使用的采样袋（继续执行步骤 2.3）或一段导管（如果为空，则继续执行步骤 2.4；如果非空，则继续执行步骤 2.5）获取血小板产品的样本。 
	要断开采样袋导管或导管段，请使用导管封口机。操作导管封口机时，请遵循制造商的说明。简要步骤如下：将待封口的导管精确地夹在两个加热钳口之间。在手持设备中，将熔融的导管压合，并在高压下冷却，同时按压杠杆（持续时间由绿灯指示），从而形成永久、无泄漏的密封。</li>
	<li>从采样袋中取样
	<ol>
		<li>通过轻柔的水平晃动 5 秒（从一端翻转到另一端共五次），充分混匀血小板袋中的内容物。</li>
		<li>打开通向采样袋的夹子。采样袋为真空状态，会自动充填。无需将采样袋完全充满，因为动态光散射（DLS）检测仅需 100 µL 样本。</li>
		<li>使用导管封口机对连接导管进行热封，将采样袋与血小板袋断开。然后继续执行步骤 3。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从空导管中取样
	<ol>
		<li>确认血小板袋导管已储存为空，且导管阻塞块仍处于原位。目视检查导管，确保其中没有大量血小板浓缩液残留。如果导管非空，请继续执行步骤 2.5。</li>
		<li>尽可能靠近导管阻塞块的位置，通过挤压手柄使滚轮夹紧导管，将导管剥离器夹闭在导管上。</li>
		<li>将血小板袋垂直悬挂，并持续保持剥离器手柄闭合。</li>
		<li>在保持剥离器闭合的同时，移除导管阻塞块。</li>
		<li>在保持剥离器闭合的情况下，缓慢将剥离器沿空导管向下拉动，使导管在剥离器后方缓慢充填。持续操作，直至剥离器下方的导管段完全膨胀，或剥离器距离导管末端约 1 英寸时停止。</li>
		<li>当剥离器到达停止位置后，使用导管封口机在剥离器上方 1 英寸处对导管进行热封。</li>
		<li>松开手动导管剥离器的手柄。</li>
		<li>在前一个封口上方 1 至 2 英寸处再次进行热封，以形成用于检测的导管段。</li>
		<li>将该检测段从血小板单元上剪下。此段将用于动态光散射（DLS）检测。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从非空导管中取样
	<ol>
		<li>将血小板袋垂直悬挂，若导管阻塞块存在，则将其移除。</li>
		<li>目视检查导管，判断是否存在明显的固体凝块。若存在固体凝块，应在凝块上方进行封口，防止其被剥离回血小板袋中。</li>
		<li>尽可能靠近导管已封端的位置，将导管剥离器夹闭在导管上。</li>
		<li>通过挤压手柄使滚轮夹紧导管，并在保持夹紧力的同时，将导管剥离器沿导管向血小板袋方向移动，将导管内容物推入袋中。</li>
		<li>将血小板袋从悬挂钩上取下，在保持剥离器闭合的状态下，通过从一端翻转到另一端共五次，轻柔混匀血小板袋 5 秒。</li>
		<li>将血小板袋重新垂直悬挂，同时保持剥离器闭合。</li>
		<li>缓慢将剥离器沿空导管向下拉动，使导管在剥离器后方缓慢充填。持续操作，直至剥离器下方的导管段完全膨胀，或剥离器距离导管末端约 1 英寸时停止。</li>
		<li>当剥离器到达停止位置后，使用导管封口机在剥离器上方 1 英寸处对导管进行热封。</li>
		<li>松开剥离器。</li>
		<li>在前一个封口上方 1 至 2 英寸处再次进行热封，以形成用于检测的导管段。</li>
		<li>剪下并丢弃导管末端剩余部分。</li>
		<li>将该检测段从血小板单元上剪下。此段将用于动态光散射（DLS）检测。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 将样品填充至DLS检测毛细管中
<ol>
	<li>使用防溅罩和清洁干燥的剪刀，剪开样品袋管路或测试段的一端。 
	注意：用于DLS测试的毛细管应立即填充。</li>
	<li>使用取样工具（由100 µL固定体积移液器、移液器吸头和毛细管组装而成）直接从打开的样品袋或管路段中吸取样品，注入毛细管中以完成填充。</li>
	<li>将装有样品的毛细管轻轻插入毛细管密封剂中，同时施加轻微扭转和压力，以密封毛细管底部。</li>
	<li>将100 µL固定体积移液器及吸头从毛细管上断开，确保毛细管牢固地嵌在毛细管密封剂中。</li>
	<li>从毛细管密封剂托盘中取出毛细管，用异丙醇擦拭垫擦拭，并通过轻轻弹击毛细管底部，确保无气泡残留。</li>
	<li>将毛细管放入DLS系统中。</li>
</ol>
4. 进行DLS测试
<ol>
	<li>选择 MP 检测选项，以启动新的动态光散射（DLS）检测，用于测量血小板样本中的微粒含量。</li>
	<li>使用条形码扫描仪或手动输入样本信息（献血识别编号（ISBT）、采集/生产有效期以及产品代码）。</li>
	<li>若无可用的产品代码供 DLS 系统提取液体介质信息，则需手动选择合适的液体介质（对于大多数血小板浓缩物选择血浆；对于含有血小板添加剂溶液（PAS）的样本，需输入残留血浆的百分比）。 
	注意：PAS 百分比相对于标称值 65% 的微小偏差将导致黏度计算值（由 DLS 系统自动计算）出现轻微误差，这会对计算出的微粒半径产生极小影响，但不影响 %MP 结果。</li>
	<li>根据提示将毛细管插入 DLS 系统并启动检测。</li>
	<li>检测完成后，从毛细管架中取出样本，并根据机构指南妥善处理耗材。从毛细管架中取出样本，并根据机构指南妥善处理耗材。</li>
	<li>根据检测结果用相应颜色标记血小板袋，例如，对于非活化（均一）样本且 %MP ≤ 15% 使用橙色标签，对于活化（异质）样本且 %MP > 15% 使用粉色标签。</li>
</ol>
<img alt="使用DLS进行血液样本分析；图表显示非活化与活化血小板的颗粒大小。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56893/56893fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：方法概述。 医院血库中常规血小板库存管理所需执行步骤的概览：从血小板浓缩液中获取样本，将样本装入毛细管进行DLS测量，执行DLS检测以识别微颗粒，并利用报告的微颗粒含量来鉴定活化血小板。<a href="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56893/56893fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

EMS 是 LightIntegra Technology Inc. 的创始人，该公司是一家医疗器械公司，致力于开发用于微粒和血小板质量检测的 ThromboLUX 系统。其余所有作者均为 LightIntegra Technology 公司员工。本文的制作与免费访问由 LightIntegra Technology Inc. 资助。

本方案描述了一种用于微粒筛选的动态光散射方法，该方法针对血小板浓缩液等生物样本中常见的高颗粒浓度进行了优化。动态光散射（DLS）方法本身具有内在标准化特性，可准确测量颗粒尺寸。如果已知血小板浓度，并以血小板峰面积作为参考峰，则可将微粒的相对浓度转换为绝对浓度19。由于血小板浓度通常通过血液分析仪或流式细胞仪获得，因此这些方法可被视为DLS的配套技术。
通过定期运行标准微球来确保动态光散射（DLS）系统的功能正常。可测量蒸馏水以验证背景噪声处于最低水平。 commercially available 血小板标准品可用于分析微颗粒（MP）阴性对照，加入半径为125 nm的微球后，可作为MP阳性对照。在感兴趣的微颗粒浓度生物学范围内，这些操作步骤作为血库常规工作的一部分，具有实用性和快速性。
与流式细胞术不同，该方法并非基于比较颗粒的散射强度，而是基于其布朗运动的速度。因此，即使外泌体尺寸较小，也能被检测到，并且可与微囊泡（MP）分别报告。
作为一种筛选工具，该方法的局限性在于无法区分不同类型的微颗粒。如果增加额外的分离步骤，该方法仍有改进的空间；例如，可通过抗体偶联磁珠捕获特异性去除微颗粒前后分别对样本进行检测。此外，不能假设所有检测到的微颗粒均来源于细胞，因为在高脂血症中形成的乳糜微粒47,48以及小型细菌或病毒6也会被检测到微颗粒的尺寸范围内。然而，血液供应体系中已存在其他保障措施，以防止高度脂血或受污染的血小板进入医院血库库存。
样本中抗凝剂的选择会影响血小板活化的程度，从而影响微颗粒（MP）含量49。在比较不同产品时，必须考虑这一因素。此外，将血浆置换为无微颗粒的悬浮介质（如PAS）会影响MP含量以及判断异质性的阈值——如果浓缩物中残留血浆内的MP含量仅为原始含量的约三分之一，则相应的较低MP含量阈值即表示与100%血浆中相同水平的血小板活化。MP百分比（%MP）是指MP含量相对于血小板的数量。先前有报道称，PAS产品的平均血小板计数较低，因此平均%MP仍为9.5%19。目前美国批准的PAS处理血小板的%MP阈值设定为10%。
尽管血小板浓缩液中的微颗粒（MP）主要来源于供体，但任何对血小板造成应激的过程都会根据血小板对应激的敏感性而增加MP水平；如果血小板已处于高度活化状态，轻微的应激因素（如延长保存期、病原体灭活、洗涤、辐照或长途运输）都可能导致MP含量显著升高。目前尚无证据表明这些应激因素会显著影响均一的、非活化的血小板19。此外，若样本在制备后未立即检测（即本方案第3步完成后未立即测试），应注意毛细管内样本成分可能发生的变化。
本方案的重点是确定血小板输注中所含颗粒的组成，并利用微颗粒作为血小板活化的生物标志物。根据15%的微颗粒百分比阈值，将血小板输注标记为非活化型（橙色）或活化型（粉色）。在100%血浆条件下，血小板微颗粒阈值15%是通过实验确定的平均值66th 来自多个位点的百分位数。
基于常规动态光散射（DLS）微粒检测的血小板库存管理目标在于通过预防非免疫性血小板输注无效来改善患者护理并提高成本效益。实施DLS系统对血小板袋进行筛查，可使使用者将未活化的血小板优先分配给最易发生血小板输注无效的高危患者群体。

人们对微粒的兴趣主要集中在其参与细胞间通讯和生物学过程中的作用。1,2,3 近年来，微粒还因其作为自身免疫性疾病和心血管疾病潜在早期诊断标志物的价值而受到关注。4,5 微粒也被称为细胞外囊泡或外泌体，已通过流式细胞术得到广泛研究。然而，尽管人们已努力对传统流式细胞术方案进行标准化，但关于应采用的最佳方案仍无共识。6,7,8,9,10
尽管传统的流式细胞术能够表征特定的微囊泡亚群11，但已有若干报道指出其存在局限性11,12,13,14。其中部分局限性已通过采用更高功率的激光器和检测器得到改善，即所谓的&#34;小颗粒检测选项&#34;15,16，并结合15°–25°前向散射角检测以及调整鞘液压力等方法17,18。然而，仍亟需一种快速且易于使用的筛查方法，可与这些复杂技术联合应用，以推动微囊泡作为早期诊断标志物的临床利用。约三分之一的健康献血者血液中可检测到升高的微囊泡水平19，这可能提示存在亚临床状态。因此，献血血液制品中微囊泡水平过高可能对易感受者造成不相容风险20。
在进行血小板输注时，存在发生非免疫性输注无效的风险——这是一种患者机体排斥连续输注、导致大部分血小板无法在循环中有效存留的状况。21,22 非免疫性输注无效可能导致输注浪费、患者健康并发症以及住院时间延长。23 含有高浓度微粒的血小板输注制品可能是导致血液肿瘤科易感患者发生非免疫性输注无效的因素之一。20 通过检测微粒含量，根据血小板输注制品的成分管理血小板库存，有可能降低易感患者的风险。然而，大多数微粒检测方法需要将微粒从血小板中分离出来5,12，或操作极为耗时费力24,25，因此难以在医院血库中常规开展。
本文所述技术采用动态光散射（DLS），也称为光子相关光谱或准弹性光散射。数十年来，动态光散射在制药行业中被广泛用于表征粒径处于亚微米范围的脂质体药物制剂或乳剂。26,27 然而，为这些应用开发的工具并未针对血液制品的筛查进行优化。为此，研究人员开发了一种新型DLS系统，以克服技术局限，使动态光散射可用于血小板输注的筛查。28
通过用激光照射悬浮颗粒并分析散射光强度随时间的变化，可进行动态光散射（DLS）测量，这种强度变化是由颗粒在悬浮液中的运动引起的。该方法进一步利用颗粒运动速度与粒径之间的反比关系——小颗粒运动快，大颗粒运动慢——从而提供样品组分的粒径分布及相对浓度信息。利用DLS可定量测定微粒组分的平均微粒含量和平均半径。血液制品中微粒的含量以%MP表示，其数值基于粒径在50–550 nm范围内测量直方图的面积。尽管DLS能够检测到半径小于50 nm的颗粒并由DLS系统报告，但这些颗粒不计入%MP。该方法并非将微粒从血小板中分离，而是根据样品中微粒与血小板的相对含量来评估血小板输注产品的异质性。事实上，当已知血小板计数时，可通过血小板峰与微粒峰的比值计算微粒的绝对浓度。19
DLS 系统可为医疗专业人员提供有关源自人血或血液制品样本中微粒的定性和定量信息。与流式细胞术、电子显微镜29、纳米颗粒追踪分析30 或可调电阻脉冲传感31 等其他技术相比，所述 DLS 技术的主要优势在于样品制备：血小板浓缩物的等分试样可直接测量，无需将微粒从血小板中分离、稀释样品或进行其他处理9,17。此外，DLS 是一种绝对粒径测量方法，不存在因缺乏具有合适折射率的校准微球而带来的问题14,32。
血小板活化与微粒含量之间的相关性此前已通过显微镜观察得到证实33,20 并且可以从病理条件下MP含量的增加推断出来15,34,35,36 以及在……之下 体外 已知可激活血小板的条件。19,37,38 然而，仍需进一步研究以充分理解DLS测量的微颗粒含量与血小板活化之间的关系。根据目前的认知，活化的血小板含有大量微颗粒，因此最适合用于正在出血患者的治疗。39而血液肿瘤学患者则受益于未活化的血小板，其微颗粒含量为零或处于低水平20最近有报道称 体外 供体血小板的反应性对接受单次输注的病情稳定、多数无出血的血液肿瘤科患者的血小板恢复和存活率无显著影响40由此发现可以推断，通过高MP含量所识别的血小板活化在患者的预防性治疗中同样未发挥显著作用。然而，由于患者选择范围较窄，本研究未涉及发热（已被排除在研究之外）、病情不稳定且接受远不止一次血小板输注的复杂患者中供者因素的影响。如何降低这些复杂病例的复杂性——这一有望减少输注无效性的关键问题——仍未得到解答。
微颗粒是炎症41,42,43,44和血小板活化的早期标志物45，因此在许多健康供者中均可检测到19。因此，血小板捐献物中存在活化的血小板和微颗粒。可以合理假设，发热患者（即先天免疫系统完全激活者）无法耐受输注活化血小板所带来的额外刺激。然而，仍需开展研究以验证这一假设。微颗粒筛查有助于消除当前对血小板输注成分的不确定性，并降低患者治疗的复杂性。
医院血库中活化血小板与非活化血小板的比例主要取决于献血人群，而运输、辐照、病原体灭活及其他可能增加血小板浓缩物中血小板活化水平的处理过程对其影响较小19。来自美国主要医院血库的数据表明，血小板库存的平均组成为49%活化血小板和51%非活化血小板（活化血小板比例范围：38–62%，个人交流）。如果血液制品供应机构或医院血库希望了解其生产或接收的活化与非活化血小板浓缩物的数量，并希望根据微粒含量所反映的血小板活化状态来管理库存，本方案可能适用于他们。
根据血小板的组成，医院血库将能够将非活化、均一的血小板用于预防性输注，而将活化、异质性的血小板用于治疗性输注。血小板筛查可使医院最大限度地利用现有库存，从而改善患者护理并降低成本。本方案适用于熟悉血液制品基本操作与处理的实验室人员。
本文介绍了一种可用于血小板输注中微粒筛查的方法，可常规应用于医院血库库存管理，尤其适用于根据微粒含量筛选血小板制品的情况。本方案的目的是阐述动态光散射技术（DLS）在献血血小板筛查中的实施与评估方法。所述方案解决了无创取样、检测流程与血库工作流程的整合以及性能特征等常见问题。

<table><tbody><tr><td>ThromboLUX-M</td><td>LightIntegra Technology Inc.&amp;nbsp;</td><td>LPN120</td><td>DLS 系统</td></tr><tr><td>ThromboSight 软件</td><td>LightIntegra Technology Inc.&amp;nbsp;</td><td>LPN124</td><td>DLS 分析软件</td></tr><tr><td>毛细管</td><td>LightIntegra Technology Inc.（包含在测试试剂盒中，供应商为 Optinova MLE）</td><td>LPN065</td><td>定制挤出的非激活性、非双折射塑料管，经过检测和辐照处理</td></tr><tr><td>MiniPet&amp;nbsp;</td><td>LightIntegra Technology Inc.（包含在测试试剂盒中，供应商为 TriContinent Scientific）</td><td>LPN082</td><td>100 &amp;micro;L 固定体积移液器，用于取样&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>MicroFlex 1-200 &amp;micro;L 移液器吸头</td><td>LightIntegra Technology Inc.（包含在测试试剂盒中，供应商为 ESBE Scientific）</td><td>LPN080</td><td>用于取样的移液器吸头</td></tr><tr><td>Critoseal&amp;nbsp;</td><td>LightIntegra Technology Inc.（包含在测试试剂盒中，供应商为 Fisher Scientific）</td><td>LPN075</td><td>毛细管密封剂</td></tr><tr><td>Dukal 酒精垫或等效产品</td><td>LightIntegra Technology Inc.（包含在测试试剂盒中，供应商为 Dukal Corp.）</td><td>LPN085</td><td>异丙醇垫（含70%异丙醇）</td></tr><tr><td>对照微球，50 nm 半径</td><td>LightIntegra Technology Inc.（包含在测试试剂盒中，供应商为 PolySciences Inc.）</td><td>LPN128</td><td>对照微球</td></tr><tr><td>Microbead NIST 可溯源粒径标准品，3 &amp;micro;m</td><td>PolySciences Inc.</td><td>64060</td><td>标准微球：1.5 &amp;micro;m 半径的聚苯乙烯微球；粒径范围 1.43–1.58 &amp;micro;m；去离子水中 1% 固体悬浮液</td></tr><tr><td>Nanobead NIST 可溯源粒径标准品，250 nm</td><td>PolySciences Inc.</td><td>64014-15</td><td>标准纳米微球：125 nm 半径的聚苯乙烯微球；粒径范围 120–130 nm；去离子水中 1% 固体悬浮液</td></tr><tr><td>Genesis BPS RapidSeal II 或等效设备</td><td>Genesis BPS</td><td>428-SE640</td><td>管路封口机</td></tr><tr><td>Fresenius Kabi 管路剥离器或等效设备</td><td>Fresenius Kabi</td><td>6R4452</td><td>手动管路剥离器</td></tr><tr><td>Biohazard Shield - 细胞计数器或等效设备</td><td>CardinalHealth</td><td>S1389-75</td><td>防溅罩</td></tr><tr><td>Corning LSE 涡旋混合器或等效设备</td><td>Corning Incorporated</td><td>6775</td><td>涡旋混合器</td></tr><tr><td>FACSCanto II 流式细胞仪&amp;nbsp; 配备 FACSDiva 软件 6.1.3 版本或等效设备</td><td>BD Biosciences</td><td>338960</td><td>流式细胞仪</td></tr></tbody></table>

血小板输注中微颗粒的常规筛查方法

Routine Screening Method for Microparticles in Platelet Transfusions

基于检测血小板浓缩液中微粒含量的血小板库存管理，是医院输血科在质量改进方面的一项新举措。当细胞受到应激时，会释放出微粒（MP）。血液及血液成分可能含有来自多种细胞的细胞碎片，其中最显著的是活化血小板所释放的微粒。血小板在发挥其作为天然免疫细胞以及凝血和止血过程主要参与者的作用时，会发生形态改变并产生微粒。通过基于动态光散射（DLS）技术的微粒检测方法，可在输注前区分活化（高微粒含量）与非活化（低微粒含量）的血小板，从而优化这种稀缺血液制品的使用。既往研究表明，在血液肿瘤患者中预防性输注非活化血小板，可能降低患者产生输注无效的风险，并改善临床护理效果。该筛查方法的目标是常规性地区分活化与非活化血小板。本文所述方法详细说明了在医院输血科进行常规血小板库存管理所需的操作步骤：从血小板输注袋中采集样本，将样本加载至毛细管中用于DLS检测，执行DLS测试以识别微粒，并根据报告的微粒含量判断血小板是否处于活化状态。

平均准备时间 
使用动态光散射（DLS）系统进行血小板筛选的过程如图1所示。从血液供应机构收到血小板后，立即使用DLS系统进行检测。如表1所述，经过培训的用户平均准备时间为2分23秒，清洁和检测后处理时间分别为14秒和46秒。总计，每次检测的平均实际操作时间为3分23秒。
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>操作</td>
			<td>主动操作时间</td>
			<td>无需看管的检测时间</td>
			<td>总计</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>准备DLS系统</td>
			<td>14 s</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>组装采样工具</td>
			<td>28 s</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>获取样本片段</td>
			<td>52 s</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>填充毛细管并启动检测</td>
			<td>49 s</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5 min</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>清理</td>
			<td>14 s</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>标记并登记血小板袋</td>
			<td>46 s</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>每份样本所需总时间</td>
			<td>3 min 23 s</td>
			<td>5 min</td>
			<td>8 min 23 s</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：主动测试时间分解。 测试本身为可离开式测试，平均持续时间为5分钟。普通用户按照本方案准备DLS系统、获取并测试样本，以及标记血小板袋，平均耗时3分23秒。
精密度 
通过三个微粒水平（0-7%、12-25% 和 28-75%）评估了DLS系统的精密度。%MP的临床相关范围为3-75%。两名操作人员在16个操作日内，使用两套DLS系统平行检测了低、中、高三种质控样本。每个样本在每天以随机顺序重复检测两次。
表2总结了DLS测量相对于血小板的微粒百分比（%MP）的设备内精密度。
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">微粒含量</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>低</td>
			<td>中</td>
			<td>高</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>平均微粒比例 (%)</td>
			<td>4.4</td>
			<td>19.5</td>
			<td>53.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>标准差 (%)</td>
			<td>1.8</td>
			<td>2.6</td>
			<td>5.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>变异系数 (CV, %)</td>
			<td>40.4</td>
			<td>13.2</td>
			<td>10.6</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：微颗粒百分比（%MP）的设备内精密度。 在微颗粒含量极低的情况下，小型血小板可能对%MP产生贡献，导致低微颗粒含量样本的变异性增加。
表3显示了DLS测量在50-550 nm平均微粒半径范围内的设备内精密度。
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">微粒含量</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>低</td>
			<td>中</td>
			<td>高</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>平均半径 (nm)</td>
			<td>331</td>
			<td>161</td>
			<td>188</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>标准差 (mm)</td>
			<td>133</td>
			<td>41</td>
			<td>25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>变异系数 (%)</td>
			<td>40.1</td>
			<td>25.2</td>
			<td>13.5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3：微粒半径的设备内精密度。 在微粒含量极低时，小型血小板可能对微粒百分比（%MP）产生贡献，导致低微粒含量样本的变异性增加。
表4展示了微颗粒百分比（%MP）的动态光散射（DLS）测量结果的重复性。
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">微粒含量</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>低</td>
			<td>中</td>
			<td>高</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>平均微粒百分比 (%)</td>
			<td>4.4</td>
			<td>29.2</td>
			<td>53.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>重复性 (%)</td>
			<td>1.5</td>
			<td>2.3</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>变异系数 (CV, %)</td>
			<td>35</td>
			<td>11.8</td>
			<td>9.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表4：动态光散射（DLS）测量微粒百分比（%MP）的重复性。
线性度 
图2 表明DLS结果呈线性， 即，根据样品的指定值拟合一条直线。制备了七种不同微粒含量的样品。高微粒含量（MP7）和低（MP1) 微粒含量与相匹配的血小板浓度被制备并以不同比例混合，以制备中间样品（MPx). 样品采用前述方法进行流式细胞术检测19 将各浓度下的DLS和%MP结果分别作为输入和输出进行绘图。测定系数为0.985。低和高微粒含量的DLS直方图示例如下所示。 图3A. DLS 结果通过流式细胞术确认（图3B).
<img alt="流式细胞术与DLS图谱对比；分析颗粒大小相关性；带趋势线的散点图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56893/56893fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：流式细胞术与DLS结果的比较。 通过流式细胞术（输入）和DLS（输出）测定的微粒百分比（%MP）之间的线性关系，两个样本的原始DLS数据以空心符号 ○ 标出，详见图 3。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56893/56893fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="粒径分布、散点图分析、强度/对数半径图、数据拟合结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56893/56893fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：微粒含量用于区分活化与非活化血小板。（A） 活化血小板（虚线）的微粒含量DLS检测结果为57%，而非活化血小板（实线）仅为4%。检测条件为测量温度37 °C、血浆黏度设定为1.06 ×10-3 Pa·s，总强度设定在200–600 kHz之间。（B） 与（A）中相同样本的流式细胞术结果（按先前所述方法获得19）；前向散射直方图中，P1和P2分别代表微粒门和血小板门；对于活化血小板（左图），76%的事件落入微粒门，而非活化血小板（右图）仅为6%。线性回归线表明，背景噪声对流式细胞术测定的微粒百分比具有恒定的相对贡献，导致结果 consistently 偏高。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56893/56893fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
特异性/干扰 
国际标准化组织（ISO）将分析特异性定义为：在样本中存在其他物质时，检测或测量程序仅检测或测量目标被测物的能力。微颗粒（MP）检测的分析特异性可能受到红细胞（RBC）的影响。动态光散射法（DLS）测量的是相对于血小板含量的MP含量。RBC可能产生干扰，因为RBC的散射贡献被包含在血小板的散射信号中，从而降低了MP的相对散射贡献。对于血液制品中允许的RBC含量，存在相应的监管限值；根据美国血库协会（AABB）推荐的血小板浓缩物中允许RBC浓度的阈值（每单位血小板中不超过2 mL压积RBC）进行保守换算，相当于8.0×1010 个细胞/L（假设：单个RBC体积为8.5×10-14 L，压积RBC的红细胞压积为68%，每单位血小板体积为200 mL）。文献报道的不同血液制品中残留RBC浓度均远低于此限值46。
三位不同的捐献者在两个不同的日期分别捐献了血小板和红细胞（RBC），共进行了三次独立实验。通过血细胞计数仪测定，血小板浓缩液（参考样本）中初始红细胞含量为 0.05 - 0.15 ×109 cells/L。通过向血小板浓缩液分装样本中加入已知数量的红细胞，制备了另外五个样本；这些样本中红细胞的目标浓度分别为 1.0、5.0、10、40 和 80 ×109 cells/L。
红细胞的干扰阈值约为 1.0 × 1010 个细胞/L（图 4），该数值也与红细胞在视觉上可被观察到的水平相对应（图 5）。超过此水平时，微颗粒百分比（%MP）会被低估，这意味着在外观呈红色的样本中（含有红细胞而非游离血红蛋白），所报告的微颗粒含量将偏低。
<img alt="流变学图，红细胞浓度与%MP（DLS）的关系，数据分析，线性回归结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56893/56893fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4：%MP（DLS）与红细胞浓度（cells/L）之间的线性关系。 来自3次独立实验的红细胞浓度依次增加，分别为 0.1 ×109、1.0 ×109、5.0 ×109、1.0 ×1010、4.0 ×1010 和 8.0 ×1010 cells/L（从左至右）（○ 实验1，● 实验2，□ 实验3，每组实验均显示线性回归线）。当红细胞浓度高于 1.0 ×1010 cells/L 时，%MP 会被低估。含红细胞样品的视觉外观见图5。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56893/56893fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="比色反应结果的分光光度实验，显示试管中的颜色梯度。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56893/56893fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图5"> 
图5：含红细胞样品的外观表现。 从左至右分别为血小板样品中红细胞浓度为 0.1 ×109、1.0 ×109、5.0 ×109、1.0 ×1010、4.0 ×1010 和 8.0 ×1010 cells/L 时的红色程度。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56893/56893fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
准确度 
准确度定义为单次测量结果与分配给样品的真值之间的差异。这种测量误差包括由测量偏倚估计的系统性分量，以及由标准偏差估计的随机分量。因此，测量结果的准确度是正确度和精密度的综合体现。
采用微球标准品以确定动态光散射（DLS）检测的准确性。在检测的临床相关浓度范围（3 - 75% MP）内的两个浓度水平评估准确性。由于参考微球具有已知的粒径和浓度，因此使用参考微球混合物制备已知浓度的样本。由此，可通过混合参考微球获得具有目标粒径和浓度的样本。
采用半径为125 nm的标准聚苯乙烯微珠代表微粒，半径为1.5 µm的微珠代表血小板。通过含有约20%和50%微粒成分的微珠混合物评估微粒检测方法的准确性。将测得的微珠半径与标准微珠分析证书上记录的微珠半径进行比较，如表5所示。
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">125 nm 微球</td>
			<td colspan="3">1.5 µm 微球</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2"></td>
			<td>分析证书</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>分析证书</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>20% MP</td>
			<td>50% MP</td>
			<td></td>
			<td>20% MP</td>
			<td>50% MP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>平均半径</td>
			<td>122.0</td>
			<td>113.8</td>
			<td>124.4</td>
			<td>1.5</td>
			<td>1.6</td>
			<td>1.60</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>标准偏差</td>
			<td>4.5</td>
			<td>2.83</td>
			<td>3.6</td>
			<td>0.035</td>
			<td>0.06</td>
			<td>0.07</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>变异系数 (CV)</td>
			<td>3.60%</td>
			<td>2.48%</td>
			<td>2.89%</td>
			<td>2.20%</td>
			<td>3.74%</td>
			<td>4.05%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>准确度</td>
			<td></td>
			<td>6.70%</td>
			<td>2.00%</td>
			<td></td>
			<td>6.50%</td>
			<td>6.30%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表5：动态光散射（DLS）测量的准确性。 对于混合物中半径为125 nm和1.5 µm的微球，DLS结果与分析证书中的尺寸对比。

基于检测血小板浓缩液中微粒含量的血小板库存管理，是医院输血科一项新的质量改进举措。其目标是区分活化与非活化血小板，以优化血小板的使用。向血液肿瘤科患者提供非活化血小板可能降低其发生难治性的高风险。

基于检测血小板浓缩液中微粒含量的血小板库存管理是医院输血医学领域的一项新型质量改进举措。

本方法的总体目标是通过在献血中心或医院血库中可常规开展的检测，对血小板输注进行表征，以优化这些血液制品在出血或血液肿瘤患者中的使用。该方法有助于回答输血医学中的关键问题，例如，血小板输注液中所含的是活化血小板还是非活化血小板。该技术的主要优势在于，它能够快速、准确地检测微颗粒含量，而微颗粒含量是血小板活化的可靠指标。对于刚接触该方法的人员，需要学习如何从血袋的管段中采集样本，因为目前尚未常规开展此项操作。我们最初产生该方法的想法，是由于观察到不同供体的血小板在活化状态上存在较大差异，且这种差异似乎对患者产生了影响。目前有三种方法可从血小板浓缩物中获取样本。采集袋中样品时，将血小板袋内容物通过轻柔的水平移动充分混匀，持续5秒，并首尾颠倒倾斜5次。打开通向采样袋的夹子，采样袋为负压状态，会自动充满液体。无需将采样袋完全充满，因为动态光散射（DLS）检测仅需100微升样品。使用管路封口机通过热封将连接管路封口，从而将血袋中的血小板分离袋与主袋断开。若需从空管路中取样，请确认血小板袋的管路已处于排空状态，且管路阻塞块仍处于原位。目视检查管路，确认其中无血小板浓缩物残留。尽可能靠近导管块的位置，通过按压手柄使滚轮夹紧导管，将导管剥离器夹闭在导管上，并保持剥离器处于闭合状态，然后松开导管块。缓慢将剥离器沿无液导管向下拉动，使导管在剥离器后方逐渐充满液体。持续操作，直至剥离器下方的导管段完全膨胀，或剥离器距离导管末端约2.5厘米时为止。必须用力捏紧管剥离器的手柄，并缓慢将剥离器沿导管向下拉动。当剥离器到达止停位置时，使用管密封器在剥离器上方一英寸处对导管进行热封。然后，松开手动管剥离器的手柄。再次热封，在前一个封口上方一到两英寸处进行，以形成测试段。然后，将测试段从血小板单位上剪下。该测试段将用于动态光散射（DLS）测试。当从非空的管路中取样时，将采样袋垂直悬挂，并松开管路夹（如果存在）。目视检查管路，判断是否存在明显的固体团块。若存在固体团块，应在团块上方进行封口，防止其被挤压进入采样袋中。接下来，将导管剥离器夹紧在导管上，位置应尽量靠近导管的封闭端。通过按压手柄，使滚轮挤压导管，将导管内的内容物排入袋中。在保持夹紧力的同时，沿导管朝向袋子的方向移动导管剥离器。将血小板袋从悬挂钩上取下，保持分离器关闭状态，通过将袋子头尾翻转五次，轻柔混匀五秒钟。保持分离器关闭，将袋子垂直悬挂。缓慢向下拉动分离器，使其沿空的管路移动，使管路在分离器后方缓慢充满液体。继续操作，直到剥离器下方的管段完全膨胀，或剥离器距离管路末端约一英寸时为止。当剥离器到达停止位置后，在剥离器上方一英寸处使用管路封口器进行热封。松开剥离器后，在上一个封口上方一至两英寸处再次进行热封，以形成待测管段。剪下并丢弃管路的最后一段。然后，从血小板单元上剪下用于检测的管段。该管段将用于动态光散射（DLS）检测。使用防溅罩和洁净、干燥的剪刀，剪开样品袋管路或测试段的一端。立即使用取样工具将样品从打开的样品袋或管路段直接吸入毛细管中。将装有样品的毛细管轻轻插入毛细管封口剂中，同时施加轻微扭转和压力，以密封毛细管底部。然后，将100微升固定体积移液器及其吸头从毛细管上断开，确保毛细管仍牢固地嵌入毛细管管封胶中。将毛细管从毛细管管封胶托盘中取出，并用异丙醇擦拭垫擦拭。轻轻弹击毛细管底部，确保无气泡残留。最后，将毛细管放入DLS系统中。首先，启动控制台，按照触摸屏上的提示登录，并选择微粒或MP检测选项，以启动新的DLS检测，用于测量血小板样本中的微粒含量。使用条形码扫描仪输入样本信息，或手动输入。根据提示将毛细管放入动态光散射（DLS）系统并开始测试。测试完成后，从毛细管架中取出样品，并根据机构指南妥善处理一次性耗材。根据检测结果，使用对应颜色标记血小板袋。例如，未活化状态用橙色表示，活化状态用粉色表示。动态光散射通过测量颗粒在悬浮液中由布朗运动引起的速度来表征颗粒大小。根据运动速度的不同，小颗粒移动较快，而大颗粒移动较慢。该技术可测定样品的粒径分布。基于微粒含量低于15%，动态光散射（DLS）确定该输注液中含有非活化血小板。确实如此。显微镜下可见的主要是盘状血小板，微粒极少。然而，另一种血小板输注制剂，尽管肉眼观察与第一袋完全相同，但根据其微粒含量超过15%，被判定为含有已活化血小板。在该样本中，显微镜下可见多种血小板形态、少量聚集物以及大量微粒。观看本视频后，您应能够充分理解如何非侵入性地从血小板袋中取样、填充毛细管，并检测样本中的微粒含量，从而实现对血小板库存的优化使用。在进行该操作时，充分混匀样本袋以获得具有良好代表性的样品非常重要。完成此操作后，可采用其他方法（如流式细胞术）进一步探究微颗粒的细胞来源问题。一旦掌握，该技术可在约两分半钟内完成。结合五分钟检测，可在不到八分钟内完成血小板输注的表征。该技术问世后，使医院血库能够筛查其血小板库存，仅向血液病/肿瘤科患者输注未活化的血小板，并观察到血小板输注使用量的减少。正如我们所说，最安全的输注就是不进行输注。尽管该方法可为输注前血小板的表征提供见解，也可用于直接检测供体的富血小板血浆。该技术的应用意义延伸至血液癌症患者的治疗，因为这类患者受益于非活化血小板的输注，从而降低产生难治性的风险。

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