使用 Macroarrays 的转移 rna 的代谢标记和剖面分析

该程序的总体目标是通过将体内代谢标记与宏阵列分析相结合，同时测量生物样品中所有转移 RNA 的细胞水平。长期以来，转移 RNA 被认为是缺乏调节功能的看家分子。然而，越来越多的证据表明，细胞 tRNA 水平会随着细胞类型、环境和压力等不同条件而波动。

tRNA 表达的波动直接影响基因翻译，有利于或抑制特定蛋白质的表达。理解蛋白质合成的动力学需要能够提供高质量 tRNA 谱的方法。我们在这里介绍了一种可靠且直接的技术，可以快速、精确地定量实验室培养生物体中的转移 RNA 水平。

首先，使用 18 号针头，在无菌 1.5 毫升微量离心管的盖子中心放置一个孔，以便适当通气。然后，用来自过夜发酵剂培养物的 5 微升耻垢分枝杆菌接种 500 微升补充的无菌 7H9 肉汤。按照标准的辐射防护实践，在培养基中加入每毫升 20 微居里磷酸磷-32 标记的正磷酸盐。

在 37 摄氏度和 1， 200 rpm 的摇床培养箱中培养细菌，培养箱放置在 9 毫米厚的丙烯酸防护罩后面。在对数中期，将整个培养物转移到 2 毫升螺旋盖管中，并在室温下以 10， 000 倍重力离心 2 分钟，沉淀放射性细菌。将含有未掺入的放射性正磷酸盐的上清液收集在适当的废液容器中。

要制备总 RNA，请在沉淀中加入 1 毫升市售 RNA 提取试剂和大约 200 微升玻璃珠。盖紧试管，并在最大搅拌下在均质器中破坏细菌 2 分钟。将样品以 12， 000 倍重力和 4 摄氏度离心 10 分钟。

然后，将上清液转移到新的 2 mL 试管中，并适当丢弃珠子。加入 0.2 毫升氯仿，用手用力摇晃试管 15 秒。然后，将样品在 12， 000 倍重力和 4 摄氏度下离心 15 分钟。

将试管倾斜 45 度，将样品的水相收集到新试管中。避免绘制任何界面层或有机层。向水相中加入 2 微升有色沉淀剂和 0.5 毫升 100% 异丙醇。

用手用力摇晃试管 5 秒钟，然后再次离心。从试管中取出上清液，并适当丢弃，因为液体馏分可能含有微量放射性。然后，将沉淀物风干 5 分钟后，将其重悬于 200 μL 2X SSC 中，每体积 SDS 重量为 0.1%。

使用基因组 tRNA 数据库，首先检索 tRNA 序列或 tRNA 编码基因来设计 DNA 探针。在修剪保守的三引生末端 CCA 后（如果编码并生成反向互补），根据前 70 个核苷酸对探针进行排序。要进行阵列打印，请在室温下解冻 96 孔板。

用金刚石笔标记涂有胺涂层的载玻片。然后，将玻片放入索引单元中。按照网格放置，小心地将复制器引脚浸入池中。

使用最小的压力，轻轻地将阵列打印在载玻片上。继续打印而不清洁阵列仪，直到完成块状 A.It 需要一些练习才能始终如一地打印。我们建议每个会话打印的阵列不超过 8 到 10 个。

每个数组计数 10 到 15 分钟。很容易忘记打印图案顺序，因此请将全部注意力投入到任务中并关闭所有干扰。当准备好继续下一个块时，将复制器浸入 5% 漂白剂中并轻轻摇晃。

将复制器压入吸水纸中。然后，将复制器浸入蒸馏水中，轻轻摇晃，然后按压到纸上。重复此步骤一次。

接下来，将复制器浸入异丙醇中，轻轻摇晃，然后将其压入纸张中。将风扇上的复制器干燥约 20 秒，然后移至 96 孔板的下一个模块。继续进行所需的打印次数。

然后，让载玻片干燥。将干燥的玻片正面朝上放在 254 纳米 UV 交联剂中的干净表面上。将能量水平设置为 999， 990 微焦耳/平方厘米，然后按开始。

将阵列转移到 450 mL 封闭溶液中，并在室温下在磁力搅拌器上缓慢搅拌孵育过夜。在室温下用 500 毫升蒸馏水洗涤玻片，2 次，每次 5 分钟。在微阵列芯片离心机中，在室温下离心 10 秒，干燥玻片。

将阵列贴片存放在干燥避光处长达六个月。杂交前，用沸水冲洗载玻片并通过离心干燥。将阵列置于杂交盒中，并加载放射性标记的 RNA 样品。

根据文本方案，在自动杂交清洗站上运行样品，以获得最大的重现性。运行结束时，通过离心干燥载玻片。用薄塑料包裹载玻片。

然后，使用盖革计数器在其最灵敏的设置上检查载玻片的放射性信号。根据信号强度，在室温下将玻片暴露在曝光盒中的存储荧光屏上 10 至 90 小时。可以持续几个小时到几天的曝光时间直接取决于阵列信号。

一些练习才能将 Geiger 计数器上的计数转换为曝光时间。使用磷光成像仪以 50 微米的分辨率扫描载玻片。使用升级为微阵列分析器的免费 ImageJ 软件量化和减去每个探针点的放射性强度。

根据文本协议生成热图。这里显示的是扫描的细菌、小鼠和人类大阵列芯片。M.smegmatis 阵列仅使用 43 个探针，而不是用于小鼠和人的 48 个探针。

因此，细菌阵列显示 40 个与背景混合的空点。三个独立的生物学重复表明，在测试的生长条件下，所有耻垢分枝杆菌 tRNA 的表达水平都高于背景水平。在这个特定的实验中，每个探针的观察到的标准偏差在 2% 精氨酸 TCT 和 22% 半胱氨酸 GCA 之间，中位数为 5%此外，该实验表明 tRNA 同工受体的表达并不均匀。

例如，所有丙氨酸同工受体的表达水平相似，而接受最高和最低精氨酸的 tRNA 相差 3 倍。一旦掌握，如果作得当并且现场信号足够，这项技术可以在大约 24 小时内完成。我们的方法适用于其基因组可用于探针设计的任何生物体。

在体外生长的模式生物是代谢标记的理想候选者。此处介绍的方案针对耻垢分枝杆菌进行了优化，但它也已成功用于分析大肠杆菌、酵母、小鼠和人培养细胞中的 tRNA。我们的技术是可重复的和特异性的。

其动态范围大，阈值易于调节，只需延长阵列曝光时间，即可分析低丰度物种，例如与多核糖体相关的 tRNA。