内源生长素与细胞分裂素在吐根节间培养过程中的定量分析

本实验的总体目标是描述在吐根中不定芽形成过程中内源植物激素水平的变化。该方法有助于回答与植物组织培养体系中组织再生相关的关键问题。该技术的主要优势在于，可利用高灵敏度方法简便地分析内源性吲哚-3-乙酸和细胞分裂素的含量。

该技术在植物组织脱分化建立过程中具有重要意义，因为内源性植物激素水平的变化会触发不定芽的形成。首先，准备不含植物激素的B5培养基，并加入0.2%的凝结胶（gellan gum）。然后，对培养基进行高压灭菌处理。

在无菌丙烯酸板上，使用外科手术刀将吐根幼苗切成8毫米长的节间片段，并将其放置于培养基上。随后，在24°C、光照强度为15 µmol/(m²·s)、光周期为14小时光照和10小时黑暗的条件下培养吐根片段5周。培养结束后，鉴定每个片段的区域一至区域四。

每周使用显微镜对每个区域的不定芽数量进行一次计数。首先，将一颗五毫米的氧化锆珠放入四个两毫升的样品管中。然后，在无菌丙烯酸板上使用外科手术刀将吐根段切割为 I 至 IV 区。随后，从每个区域分别收集八个片段，放入一个样品管中。

称取每个样品的质量，并用液氮冷冻。接着使用基于珠子的均质器研磨冷冻样品。使用涡旋振荡器将样品悬浮于1 mL乙腈中，并加入每种内标物（牛源和CKs）各500皮克。

将样品在 4°C 下静置 1 小时。然后在室温下以 3500 ×g 离心 5 分钟。用含 1% 乙酸的 80% 乙腈洗涤沉淀。

然后重复离心步骤，并使用一次性玻璃管合并上清液。向合并的上清液中加入600 µL含1%乙酸的水溶液。随后使用真空浓缩仪蒸发乙腈。

将样品溶液分别加入已平衡的HLB小柱中，用1毫升含1%乙酸的水洗涤小柱。然后用2毫升含1%乙酸的80%乙腈在玻璃试管中洗脱所有激素。

使用真空浓缩仪蒸发乙腈缩醛，得到含1%乙酸的水提取物。将样品溶液加载至各自已平衡的MCX小柱中，并用1毫升含1%乙酸的水洗涤小柱。然后在玻璃试管中用2毫升含1%乙酸的30%乙腈溶液洗脱IAA。

然后用2 mL含1%乙酸的80%乙腈洗涤小柱。接着在通风橱中用2 mL水和1 mL含5%氨水的水溶液洗涤小柱。在通风橱中，用2 mL含5%氨水的60%乙腈将细胞分裂素（CKs）洗脱至玻璃试管中。

然后使用真空浓缩仪蒸发各激素组分中的溶剂。将样品在零下30摄氏度下搅拌，直至进行LC-MS/MS分析。首先，将每份激素提取物溶解于含有600 µL甲醇的离心管中。

然后将溶液转移至螺口总回收瓶中，使用真空浓缩仪蒸发溶剂。将IAA组分溶解于20微升30%乙腈中，将CK组分溶解于20微升含1%乙酸的水中。接着使用配备HPLC系统的三重四极杆质谱仪，在正离子模式下分析样品。

最后，通过非标记与氘标记标准品的比值标准曲线，对CK水平下的内源性IAA进行定量。在本方案中，通过LC-MS/MS对不定芽中内源性氧化型细胞分裂素连续五周进行了测定。在第一周时，尚未形成不定芽，而在第二周时首次出现微小的不定芽。

在第三周和第四周期间，区域一和区域二的芽条数量大多有所增加。第五周时，区域一的芽条数量约为七个，区域二约为五个。培养前，区域一的IAA水平略高于区域二、区域三和区域四。

在培养的第一周，第四区的IAA水平显著升高，而第一、二、三区则略有下降。培养至五周时，IAA浓度梯度逐渐形成，其水平从第一区到第四区依次升高。

培养前，大多数细胞分裂素（CKs）仅处于痕量水平。在第一周，区域二的tZR水平升高至13.8皮克每毫克，区域三则升高至18.1皮克每毫克。

相比之下，tZ、iP 和 iPR 的水平在培养过程中仅发生轻微变化。在进行该操作时，重要的是要记住内源性部分激素是稳定的。该技术在人类中得到发展后，为植物组织培养领域的研究人员开辟了道路。

为了探究其他生物中的不定形成现象。观看本视频后，您应能充分理解如何分析内源性吲哚-3-乙酸和细胞分裂素。