Name: 人类成人皮肤成纤维细胞诱导神经元高产培养的简单生成 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: 了解如何利用慢病毒载体将成人皮肤成纤维细胞高效重编程为诱导神经元，仅需25天即可获得高产率培养物。该方法保留供体细胞年龄特征，为神经退行性疾病建模和药物筛选提供患者特异性模型。

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感谢Marie Persson Vejgården提供的技术协助。本研究工作获得了以下机构的资助：纽约干细胞基金会；欧洲研究理事会根据欧盟第七框架计划（FP/2007-2013）资助的“神经干细胞修复”项目（编号602278）及ERC基金协议编号30971；瑞典研究理事会（基金协议编号521-2012-5624、2016-00873和70862601/ Bagadilico）；瑞典帕金森基金会（Parkinsonfonden）；以及隆德大学战略研究领域项目Multipark（帕金森病多学科研究）。Janelle Drouin-Ouellet由加拿大卫生研究院（CIHR）博士后奖学金（编号#358492）支持；Roger Barker由英国国家健康研究所（NIHR）生物医学研究中心向剑桥大学/阿登布鲁克医院颁发的基金支持。Malin Parmar是纽约干细胞基金会Robertson研究员。Shelby Shrigley由欧盟“地平线2020”计划（H2020-MSCA-ITN-2015）下玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里创新培训网络资助，基金协议编号为676408。

成年真皮成纤维细胞来自英国剑桥约翰·范吉斯特脑修复中心的帕金森病研究和亨廷顿病门诊，在当地伦理批准（REC 09/H0311/88）下使用。有关皮肤活检取样步骤的详细信息，请参见参考文献8.
1. 重编程用皮肤成纤维细胞的制备
<ol>
	<li>使用自动细胞解冻系统或37 °C水浴，解冻成人人类真皮成纤维细胞（aHDFs），并在T75培养瓶中每瓶接种200,000个细胞（使用自动细胞计数器计数），加入10 mL成纤维细胞培养基（见表1），于37 °C、5% CO2条件下培养。</li>
	<li>次日更换全部成纤维细胞培养基。</li>
	<li>每3–4天更换一次成纤维细胞培养基，直至细胞达到95%融合度。 
	注意：一个融合的培养瓶将含有约1,000,000个细胞。aHDFs可冻存以建立细胞系库存（第2节），或直接重新接种用于重编程（第3节）。</li>
</ol>
2. 皮肤成纤维细胞的冻存
<ol>
	<li>将程序降温盒置于装有冰块的容器中或4 °C冰箱中。</li>
	<li>用0.05%胰蛋白酶（每T75培养瓶1.5 mL）在37 °C消化细胞3–5分钟。</li>
	<li>加入成纤维细胞培养基（含胎牛血清（FBS））以中和胰蛋白酶（每冲洗一次加入3 mL，每T75培养瓶冲洗两次），通过两次冲洗将脱落的细胞收集至15 mL离心管中。</li>
	<li>使用自动细胞计数仪计数细胞；（建议）每支冻存管冻存约500,000个aHDFs。</li>
	<li>在400 × g条件下离心5分钟，沉淀细胞。</li>
	<li>用1 mL冻存液重悬细胞沉淀（见表1），转移至冻存管中。将冻存管直接放入程序降温盒中。</li>
	<li>将程序降温盒于-80 °C过夜保存。次日，将冻存管转移至-140 °C超低温冰箱中，长期保存备用。</li>
</ol>
3. 重编程铺板（第 −1 天）
注意：建议在短期实验（不超过30天）中使用明胶包被；而对于长期实验，则建议使用多聚-L-鸟氨酸、纤连蛋白和层粘连蛋白（PFL）包被。
<ol>
	<li>在接种aHDFs进行重编程前60分钟，用0.1%明胶（250 µL/孔）包被24孔板，并在37 °C下孵育。</li>
	<li>吸除aHDFs上的成纤维细胞培养基，用DPBS洗涤一次。加入0.05%胰蛋白酶（每T75培养瓶1.5 mL），在37 °C下消化3–5分钟以解离细胞。</li>
	<li>加入成纤维细胞培养基以中和胰蛋白酶（每T75培养瓶冲洗3 mL），通过冲洗培养瓶两次收集脱落的细胞至15 mL离心管中。</li>
	<li>在400 × g下离心5分钟，弃上清，将细胞沉淀重悬于1 mL成纤维细胞培养基中。</li>
	<li>使用自动细胞计数仪对细胞进行计数（为确保良好的转化效率，应通过台盼蓝染色检测确认细胞活力高于90%）。</li>
	<li>对于完整的24孔板，将1,320,000个细胞重悬于13.2 mL成纤维细胞培养基中，配制成每毫升培养基含100,000个细胞的悬液（或根据所需孔数，每孔55,000个细胞加入550 µL成纤维细胞培养基）。</li>
	<li>吸除孔板中的明胶溶液，用DPBS洗涤两次。每孔加入500 µL细胞悬液，于含5% CO2的环境中37 °C过夜培养。</li>
</ol>
4. 病毒转导（第0天）
注意：操作慢病毒颗粒需要使用二级防护设备，并使用中和病毒的试剂。强烈建议佩戴两副手套。
<ol>
	<li>将13.2 mL成纤维细胞培养基预热至37 °C。</li>
	<li>在室温下解冻含有转录因子Ascl1和Brn2以及两条靶向REST的短发夹RNA（shRNA）的慢病毒载体。 
	注意：参见参考文献8；该构建体可在质粒文库中获得。有关慢病毒制备方法的详细信息，请参见参考文献9。</li>
	<li>向培养基中加入适量体积的慢病毒，以感染aHDFs，感染复数（MOI）为20，无需添加任何转导增强剂。 
	<img alt="方程" src="/files/ftp_upload/56904/56904eq1v2.jpg" /></li>
	<li>用含慢病毒载体的成纤维细胞培养基（每孔500 µL）替换24孔板中的原有培养基，并在37 °C、5% CO2条件下孵育过夜。</li>
	<li>次日，将孔板中的培养基更换为不含慢病毒载体的新鲜成纤维细胞培养基。 
	注意：该培养基在7天内具有感染性，因此在病毒转导后的第一周内应采取适当的防护和操作措施。</li>
</ol>
5. 转化细胞的维持
注意：一旦开始转化，细胞容易脱落；更换培养基时应小心将培养板倾斜，并使用1,000 µL移液器，以避免细胞脱离。
<ol>
	<li>第3天，移除成纤维细胞培养基，并加入500 µL早期神经元转化培养基（见表1）。</li>
	<li>每周两到三次，从孔中移除225 µL旧培养基，并加入250 µL新鲜的早期神经元转化培养基。</li>
	<li>第18天，移除每孔中的全部培养基，更换为500 µL晚期神经元转化培养基（见表1）。</li>
	<li>此后每2–3天更换一半培养基，使用晚期神经元转化培养基，持续至第25天或实验终点（图1A）。 
	注意：若实验未在每孔中接种细胞，请在空孔中加入PBS或水，以防止培养基过度蒸发，并减少孔间差异。</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>储存浓度</td>
			<td>工作浓度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">成纤维细胞培养基</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>基础培养基</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>青霉素/链霉素</td>
			<td>10,000 U/mL</td>
			<td>100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>N/A</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">冻存液</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>成纤维细胞培养基</td>
			<td>N/A</td>
			<td>45%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>N/A</td>
			<td>45%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>N/A</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">早期神经元转化培养基 (ENM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>神经分化培养基&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>青霉素/链霉素</td>
			<td>10,000 U/mL</td>
			<td>100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>2 µM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB-431542</td>
			<td>20 mM</td>
			<td>10 µM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>100 µg/mL</td>
			<td>0.5 µg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDN-1931189</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>0.5 µM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VPA</td>
			<td>1 M</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LM-22A4</td>
			<td>20 mM</td>
			<td>2 µM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>20 µg/mL</td>
			<td>2 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NT3</td>
			<td>10 µg/mL</td>
			<td>10 ng/µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>db-cAMP</td>
			<td>50 mM</td>
			<td>0.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">晚期神经元转化培养基 (LNM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>神经分化培养基&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>青霉素/链霉素</td>
			<td>10,000 U/mL</td>
			<td>100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LM-22A4</td>
			<td>20 mM</td>
			<td>2 µM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>20 µg/mL</td>
			<td>2 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NT3</td>
			<td>10 µg/mL</td>
			<td>10 ng/µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>db-cAMP</td>
			<td>50 mM</td>
			<td>0.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">FACS 缓冲液</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 1x [-钙, -镁, -酚红]</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>N/A</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA酶</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.05%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：所用不同培养基的成分。 本方案中所需所有培养基的完整成分说明，包括成纤维细胞培养基、冻存培养基、早期神经元转化培养基、晚期神经元转化培养基以及FACS缓冲液。
6. 用于电生理记录的玻璃盖玻片
注意：建议穿戴实验服、护目镜、双层手套，并在通风橱内完成所有操作。本方案改编自10。
<ol>
	<li>将玻璃盖玻片平铺于玻璃培养皿底部，确保无重叠。</li>
	<li>加入通用实验室清洗剂，使盖玻片完全浸没，同时避免振荡时溢出（约30 mL）。置于摇床中，低速振荡2小时。</li>
	<li>用高压灭菌的去离子水清洗六次，每次30分钟。</li>
	<li>加入95%乙醇处理2小时。</li>
	<li>去除乙醇，静置至盖玻片完全干燥。</li>
	<li>干燥后，将盖玻片转移至玻璃烧杯中，加入70%硝酸，确保盖玻片完全浸没。</li>
	<li>将烧杯放入超声波清洗仪中，超声处理60分钟。</li>
	<li>去除硝酸，并用高压灭菌的去离子水清洗三次。 
	注意：配制酸溶液时，务必始终将酸缓慢加入水中，切勿反向操作，以免引发剧烈反应。</li>
	<li>尽可能去除烧杯中的水分，加入浓盐酸（HCl），直至盖玻片完全浸没；轻轻摇动烧杯，并用石蜡膜封口。</li>
	<li>超声处理60分钟（频率50–60 Hz，功率30 W）。</li>
	<li>尽可能去除盖玻片上的HCl，并将其倒入指定废液容器中。用高压灭菌的去离子水冲洗两次。</li>
	<li>将盖玻片从通风橱中取出，用高压灭菌的去离子水冲洗20次或更多，直至完全去除残留HCl。</li>
	<li>干燥后，将盖玻片放入无菌的24孔板中。</li>
	<li>将24孔板置于紫外光（UV）下照射过夜。次日，盖玻片即可使用。 
	注：若使用玻璃盖玻片，建议采用PFL包被。只需用无菌镊子将一张盖玻片放入24孔板的每个孔中，并按以下方案操作即可。</li>
</ol>
7. 长期培养的PFL包被
<ol>
	<li>用多聚-L-鸟氨酸（500 µL/孔）包被24孔板，于37 °C、5% CO2条件下孵育过夜。</li>
	<li>吸除多聚-L-鸟氨酸，等待至其干燥至表面可形成液滴的程度。</li>
	<li>在每孔中央加入一滴层粘连蛋白（约60 µL），并铺展以覆盖盖玻片整个表面。于37 °C、5% CO2条件下孵育2小时45分钟。</li>
	<li>用DPBS洗涤三次。</li>
	<li>加入纤连蛋白（500 µL/孔），于37 °C、5% CO2条件下孵育过夜。</li>
	<li>接种细胞前用DPBS洗涤一次。 
	注意：PFL包被可用于诱导神经元（iNs）的长期培养（超过100天），但自第30天起可预期出现渐进性细胞死亡。</li>
</ol>
8. 流式细胞术
注意：在进行 FACS 分选后重新接种细胞时，需提前 48 小时准备 PFL 包被的培养板。自转导后的第 20 天起，可使用神经细胞黏附分子（NCAM）抗体对细胞进行分选。
<ol>
	<li>使用 1,000 µL 移液器吸除培养基（不要洗涤，以免细胞脱落）。</li>
	<li>加入细胞解离试剂（250 µL/孔），孵育 10–20 分钟，直至细胞脱离并以单细胞形式悬浮。</li>
	<li>在此期间，配制 FACS 缓冲液。</li>
	<li>用 1,000 µL 移液器轻轻吹打。若仍有细胞团块，可延长孵育时间。</li>
	<li>获得单细胞悬液后，将其从孔中转移至 1.5 mL 离心管中。</li>
	<li>用晚期神经元转化培养基冲洗孔两次，并将冲洗液加入同一 1.5 mL 离心管中。</li>
	<li>在 400 × g 条件下离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于 200 µL FACS 缓冲液中。</li>
	<li>在 400 × g 条件下离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>重复步骤 8.8 和 8.9 两次。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于 50 µL 含人 CD56（NCAM）抗体（稀释比例为 1:50）的 FACS 缓冲液中，冰上孵育 15 分钟，避光。</li>
	<li>在 400 × g 条件下离心 5 分钟。</li>
	<li>加入 200 µL FACS 缓冲液重悬细胞以进行洗涤，并在 400 × g 条件下离心 5 分钟。</li>
	<li>重复步骤 8.13。</li>
	<li>将细胞重悬于含碘化丙啶（PI；10 µg/mL）的 200 µL FACS 缓冲液中。通过门控未用 NCAM 抗体或 PI 染色的对照样品的荧光强度水平，使用 FACS 分选 NCAM 阳性（iNs）且 PI 阴性（活细胞）的细胞。</li>
	<li>将 NCAM 阳性细胞收集至含有晚期神经元转化培养基的离心管中。</li>
	<li>使用自动细胞计数仪计数细胞，并以高密度（50,000 个细胞/cm2）将细胞重新接种至 PFL 包被的培养皿中，加入晚期神经元转化培养基。</li>
	<li>每周更换 2–3 次半量培养基（使用晚期神经元转化培养基），持续至实验终点（图 1A）。</li>
</ol>

<ol><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
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<li>Pfisterer, U., Wood, J., Nihlberg, K., Hallgren, O., Bjermer, L., Westergren -Thorsson, G., Lindvall, O., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+induction+of+functional+neurons+from+adult+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Efficient induction of functional neurons from adult human fibroblasts.</a> Cell Cycle. 10, 3311-3316 (2011).</li>
<li>Caiazzo, M., Dell'Anno, M. T., Dvoretskova, E., Lazarevic, D., Taverna, S., Leo, D., Sotnikova, T. D., Menegon, A., Roncaglia, P., Colciago, G., Russo, G., Carninci, P., Pezzoli, G., Gainetdinov, R. R., Gustincich, S., Dityatev, A., Broccoli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+generation+of+functional+dopaminergic+neurons+from+mouse+and+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts.</a> Nature. 476, 224-227 (2011).</li>
<li>Masserdotti, G., Gascón, S., Götz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+neuronal+reprogramming%3A+learning+from+and+for+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Direct neuronal reprogramming: learning from and for development.</a> Development. 143, 2494-2510 (2016).</li>
<li>Pereira, M., Pfisterer, U., Rylander, D., Torper, O., Lau, S., Lundblad, M., Grealish, S., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+generation+of+induced+neurons+from+human+fibroblasts+that+transplantation+into+the+adult+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Highly efficient generation of induced neurons from human fibroblasts that transplantation into the adult rat brain.</a> Sci Rep. 4, 6330(2014).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

这种一步法/单载体重编程方法为从人类成体成纤维细胞获得诱导性神经元（iNs）提供了一种高效途径。人类成体成纤维细胞通常比胎儿成纤维细胞更难转化，此前仅有少量研究报道其转化效率约为5–10%12,13然而，采用这一新方案，神经元产量（以MAP2+细胞计）可达到约50%8此外，我们的方案可用于已传代多次的真皮成纤维细胞，且不会降低转化效率。迄今为止，我们已使用传代多达14次的细胞，未检测到转化效率有任何下降。同时，在我们实验中，来自52至87岁供体的成纤维细胞在重编程效率方面无显著差异。有关使用该载体测试的其他细胞系的供体年龄及疾病状况的更多细节，请参见参考文献。8其他研究也报道，使用基于慢病毒并结合小分子增强的方案，在0至89岁供体间未观察到转化效率的差异。4此外，已有报道称，基于miRNA的神经元重编程在所有年龄段（供体年龄范围为0至86岁）的成纤维细胞中均具有一致的适用性。7通过该途径，可在大约12至15周内获得成熟神经元 体外 移植后约8周 体内8这种方法的优势在于可以从易于获取的组织中获得具有疾病特异性和患者特异性的人源iNs。尽管该方案效率较高，但仍无法实现100%的神经元得率，因此需要通过FACS等方法进行纯化步骤。
本方案中最关键的步骤是病毒转导（方案第4部分）。必须确保病毒滴度准确，并且接种用于转化的aHDF细胞数量精确。本方案推荐使用的病毒滴度范围为4 × 108至4 × 109。不建议使用低于1 × 108的滴度，因为添加大体积的病毒会导致细胞毒性。此外，当成纤维细胞开始转化为iN细胞时，其会变得更加脆弱，容易从培养皿表面脱落。因此，在更换培养基时务必操作轻柔，避免过度扰动细胞。可通过使用1,000 µL移液器缓慢吸除液体来实现。最后，在进行重编程接种时（方案第3部分），实验开始前必须确保成纤维细胞群体处于健康状态；这通常表现为台盼蓝染色检测的细胞活力高于90%。aHDF细胞应在达到95%融合度之前始终进行传代。
如果在病毒转导前已观察到明显的细胞死亡，则不应开始转化：需仔细检查细胞活力是否高于90%，并确认培养板包被过程中无任何问题。病毒转导后出现少量细胞死亡是正常现象，但不应十分显著。此时，应确认每孔接种了准确数量的50,000个aHDF细胞，并检查病毒滴度。若在转化过程中各孔之间存在明显不一致，首先应检查每孔是否含有等量培养基，并确认边缘孔是否存在明显的蒸发现象（如有必要，可向边缘孔补充额外培养基）。另外，请检查步骤4.4，确保在转导时充分混匀以获得均一的细胞悬液。关键是要先将慢病毒加入培养基中，再将混合液加入各孔。直接将慢病毒加入孔中会增加孔间差异，并可能对细胞产生毒性。最后，务必在添加至细胞前将培养基预热至37 °C。
本方案包含用于iNs长期培养的包被条件以及通过FACS分选提高神经元纯度的可选步骤。对于希望研究iNs功能特性的实验，还提供了用于电生理学的玻璃盖玻片制备方案。此处的转化方案适用于24孔板；如需要，可调整为6孔、12孔、48孔、96孔板或培养瓶。在此情况下，请根据所用板或培养瓶的表面积调整所有体积。
本方案采用单一载体，共同包装Ascl1和Brn2的强制性表达以及REST基因的敲低8，以生成具有泛神经元表型的诱导性神经元（iNs）。然而，该方法是否能够生成任何胶质细胞亚型尚未得到评估。因此，若要获得特定亚型的神经元，需对该方法进行修改，并结合其他重编程因子使用。既往直接重编程研究已证实，可生成运动神经元、感觉神经元、光感受器、纹状体中型棘状神经元以及多巴胺能神经元10,14。此类技术在研究特定神经元亚型易受累的神经系统疾病时将具有重要意义，例如帕金森病与多巴胺能神经元的研究。
直到最近，直接神经重编程技术尚无法以标准化且高效的方式生成诱导性神经元（iNs），其效率难以满足大规模毒理学和药物筛选实验的需求。这一新方法具有很高的效率，且可应用于多次传代的成纤维细胞，从而突破了以往的技术限制，为开展广泛的研究打开了大门，不仅适用于人类神经系统研究，还可实现患者特异性的个体化研究。该方法操作简便，使得任何希望在本实验室开展类似研究的科研团队均可便捷地应用iN技术，不仅可用于药物筛选和毒理学检测等大规模生物医学应用，还可用于支持来自动物模型和人类研究的数据验证。 死后 组织样本

由于难以获取活体人脑细胞用于机制研究和功能检测，神经系统疾病有效治疗方法的开发一直受到限制。大约十年前，随着诱导性多能干细胞（iPSCs）技术的出现1,2，这一局面发生了根本性改变。结合对人类正常发育过程中神经分化机制的深入理解，研究人员现已能够利用患者来源及疾病特异性的材料，生成特定且多样化的神经元亚型。利用此类材料，目前可以研究神经系统疾病的细胞内致病机制，以及不同化合物缓解这些病理特征的潜力3。
尽管诱导多能干细胞（iPSCs）对神经科学领域产生了革命性影响，但这类细胞的一个主要缺点是在重编程过程中其衰老特征被清除，导致再生的神经元无法保留与衰老相关的易损性4,5,6。对于所生成的神经元而言，这一特定特性可能在重现细胞内致病级联反应的多个方面时至关重要，尤其是在老年为重要风险因素的疾病中更是如此。
直接神经重编程是一种将体细胞直接转化为诱导性神经元（iN）的技术，无需经过多能性中间阶段。该技术能够快速在体外生成具有患者特异性和疾病特异性的入类神经元。in vitro 直接重编程的一个显著特征是供体细胞的起始年龄得以保留，因而其对衰老过程的易感性也随之保留，例如氧化应激水平升高等现象4,7。因此，来自患有与衰老相关神经系统疾病（如阿尔茨海默病和帕金森病）患者的iN细胞非常适合用于广泛的生物医学应用，包括疾病建模、药物筛选实验以及毒理学研究。
阻碍神经退行性疾病患者来源的诱导神经元（iNs）被广泛应用的主要问题是，这些细胞难以重编程，且成纤维细胞扩增后这一困难进一步加剧。因此，直到最近才实现为这类应用所需数量的iN细胞的生成8。我们现已开发出一种简便的方法，能够以极高效率对任何年龄段供体的成纤维细胞进行重编程。该方法结合了神经元转录因子 Ascl1 和 Brn2 的强制性表达，并利用单一载体对抑制蛋白RE1沉默转录因子（REST）进行敲低。本文中，我们描述了由老年供体皮肤活检取得的成纤维细胞转化为诱导神经元（iNs）的各个步骤。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;细胞系&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>成人人类皮肤成纤维细胞&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>[C2 通道 #7] 供体为一名67岁女性。细胞来源于帕金森病患者&amp;rsquo;亨廷顿病研究与亨廷顿&amp;rsquo;英国剑桥约翰·范·吉斯特脑修复中心的 s 病诊所。</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;成纤维细胞培养、转导与转化所需试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）[-CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, -MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;]</td><td>Gibco</td><td>14190094</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA [0.5%]</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td>用DPBS稀释至0.05%。</td></tr><tr><td>Virkon（用于灭活病毒的试剂）</td><td>Viroderm</td><td>7511&amp;nbsp;</td><td>用温水稀释至1%溶液。</td></tr><tr><td>Milli-Q 水</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;基础培养基&lt;/strong&gt; - 达尔伯克&amp;rsquo;s 改良伊格尔培养基（DMEM）+ GlutaMax</td><td>Gibco</td><td>61965059</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素 [10,000 U/mL]</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>CryoMACS&amp;reg;&amp;nbsp;二甲基亚砜（DMSO）10</td><td>Miltenyi</td><td>170-076-303</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;神经分化培养基&lt;/strong&gt; - NDiff 227</td><td>Takara-Clontech</td><td>Y40002</td><td></td></tr><tr><td>LM-22A4&amp;nbsp;</td><td>Tocris</td><td>4607</td><td>将10 mg稀释于1450中 &amp;micro;L DMSO &lt;强&gt;储备浓度：20 mM&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）［重组人］</td><td>R&amp;amp;D系统</td><td>212-GD-010</td><td>将10 ug稀释至500 &amp;micro;L 0.1% BSA 在 DPBS 中。 &lt;强&gt;储存浓度：20 &amp;micro;g/mL&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>NT3［重组人］</td><td>R&amp;amp;D系统</td><td>267-N3-025</td><td>稀释25 &amp;micro;2.5 mL 0.1% BSA 的 DPBS 中溶解至 g &lt;强&gt;储存浓度：10 &amp;micro;g/mL&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>db-cAMP&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D0627</td><td>将1 g溶于40.7 mL Milli-Q水中。过滤后定容至500 mL &amp;micro;10 mL 的等分试样或储备管。 &lt;强&gt;储备浓度：50 mM&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>轴突</td><td>1386</td><td>稀释2 &amp;micro;g 在 429,8 &amp;micro;L DMSO &lt;强&gt;储存浓度：10 mM&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>SB-431542</td><td>轴突</td><td>1661</td><td>将5 mg稀释于595中 &amp;micro;L DMSO &lt;强&gt;储存液浓度：20 mM&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Noggin [重组人]</td><td>Miltenyi</td><td>130-103-456</td><td>稀释100倍 &amp;micro;100 克中的克 &amp;micro;L 毫米Q水 + 900 &amp;micro;L 0.1% BSA in DPBS. &lt;强&gt;储备浓度：100 &amp;micro;g/mL&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>LDN-193189</td><td>轴突</td><td>1509</td><td>将2 mg稀释于360中 &amp;micro;L DMSO &lt;强&gt;储存浓度：10 mM&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>丙戊酸钠盐（VPA）</td><td>默克密理博</td><td>676380</td><td>将5 g溶于Milli-Q水中以达到所需体积 &lt;强&gt;1 M 的储存浓度。注意：&lt;/strong&gt; 避免吞食、皮肤接触及吸入粉尘。</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;涂层用试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>明胶&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G2500</td><td>用 Milli-Q 水稀释至 0.1%。</td></tr><tr><td>聚-L-鸟氨酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3655</td><td>用超纯水溶解。 &lt;强&gt;15时使用&amp;micro;g/mL&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>纤连蛋白</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>33010-018</td><td>2 mL Milli-Q 水 + 70 &amp;micro;0.25 M NaOH溶液 &lt;强&gt;5时使用 &amp;micro;g/mL&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>层粘连蛋白</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>23017-015</td><td>-80 保存&amp;deg;C. 冰上解冻，保持低温，并分装成30份 &amp;micro;L. &lt;强&gt;5时使用 &amp;micro;g/mL&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;荧光激活细胞分选试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞解离试剂 - Accutase (Stem Pro)</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' 平衡盐溶液 (HBSS) 1X [-钙, -镁, -酚红]</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>14175-046</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td>使用1%浓度的抗人CD56（NCAM）抗体。</td></tr><tr><td>DNA酶</td><td>Sigma Aldrich</td><td>DN-25</td><td>使用浓度为0.05%。</td></tr><tr><td>抗人 CD56（NCAM）抗体［小鼠］</td><td>BD Pharmingen</td><td>555518</td><td>使用比例为 1 : 50。</td></tr><tr><td>碘化丙啶</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4170</td><td>用 PBS 稀释至 1 mg/mL，并保持无菌。 &lt;强&gt;以1:1000的比例使用，以达到10的浓度&amp;micro;g/mL&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;盖玻片用试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>高压灭菌去离子水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alconox 洗涤剂</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z273228</td><td></td></tr><tr><td>乙醇 95%</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>硝酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>438073-M</td><td>&lt;强&gt;注意：&lt;/strong&gt; 浓硝酸具有强腐蚀性，其蒸气可能有害。</td></tr><tr><td>浓盐酸（HCl）</td><td></td><td></td><td>&lt;强&gt;警告：&lt;/strong&gt; 浓盐酸具有强腐蚀性，其蒸气可能有害。</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;免疫细胞化学试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛（PFA）</td><td>默克密理博</td><td>1040051000</td><td>使用浓度为4%。 &lt;强&gt;警告：&lt;/strong&gt; PFA 是一种强效固定剂，避免摄入和接触皮肤</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>10254640</td><td>使用浓度为0.1%。</td></tr><tr><td>血清 [驴]</td><td>默克密理博</td><td>S30-100ML</td><td></td></tr><tr><td>抗MAP2抗体[鸡]</td><td>Abcam</td><td>ab5392</td><td>使用浓度为 1 : 5,000。</td></tr><tr><td>Tau HT7 单克隆抗体 [小鼠]</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>MN1000</td><td>使用浓度为 1 : 500。</td></tr><tr><td>Cy3 抗鸡抗体[驴]</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>703-165-155</td><td>使用浓度为 1 : 400。</td></tr><tr><td>Alexa Fluor488 驴抗小鼠抗体</td><td>杰克逊免疫研究实验室</td><td>715-545-150</td><td>使用浓度为 1 : 400。</td></tr><tr><td>4&amp;prime;,6-二脒基-2&amp;prime;-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td>将粉末用 Milli-Q 水重悬至 1 mg/mL。分装后于 -20 ℃ 保存&amp;deg;C, &lt;强&gt;光敏感&lt;/strong&gt;使用浓度为 1 : 500。</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T75 培养瓶 [Nunclon Delta Surface]</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>156499</td><td></td></tr><tr><td>24孔板 [Nunc]</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>142485</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 聚丙烯管</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z336769</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管&amp;nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管&amp;nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>CryoPure管 1.6 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.380</td><td></td></tr><tr><td>移液控制器</td><td></td><td></td><td>用于移取1-25 mL体积。</td></tr><tr><td>无菌刻度吸管：5、10 和 25 mL&amp;nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>86.1253.001, 86.1254.001, 86.1685.001</td><td></td></tr><tr><td>可调体积移液器：5、20、200 和 1,000 &amp;micro;L&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌移液器吸头</td><td></td><td></td><td>用于移液量程为 0.5 - 1,000 &amp;micro;L.</td></tr><tr><td>玻璃盖玻片</td><td>NeuVitro</td><td>GG-12-1.5-oz</td><td>#1.5 厚度，12 mm 直径，0.5 oz，CE 认证，适配 24 孔板。</td></tr><tr><td>玻璃培养皿</td><td></td><td></td><td>约150毫米直径。</td></tr><tr><td>玻璃烧杯</td><td></td><td></td><td>确保准备一个大小合适的烧杯用于超声波清洗槽。超声波清洗槽中的水不应溢出到玻璃烧杯中。</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ThawSTAR 自动化细胞解冻系统</td><td>BioCision</td><td>BCS-601</td><td></td></tr><tr><td>Countess II 自动细胞计数仪</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>细胞计数板［50 片］和台盼蓝［0.4%］</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>C10228</td><td>适用于Countess II全自动细胞计数仪。</td></tr><tr><td>CoolCell Cell LX 程控降温冻存容器</td><td>Biocision</td><td>BCS-405</td><td></td></tr><tr><td>层流罩</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>加湿的5% CO₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 37 &amp;deg;C孵箱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心</td><td></td><td></td><td>适用于 1、5、15 和 50 mL 离心管。</td></tr><tr><td>轨道摇床</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>超声波破碎仪 - Bransonic B200 型清洗器</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z305359</td><td>频率 = 50-60 Hz，振幅 = 30 瓦特</td></tr><tr><td>FACS Aria III 细胞分选仪</td><td>BD Pharmingen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>相差显微镜</td><td>Olympus</td><td>CKX31</td><td></td></tr><tr><td>倒置荧光显微镜</td><td>Leica</td><td>DMI6000 B</td><td></td></tr></tbody></table>

由成人皮肤成纤维细胞简单高效地生成诱导神经元的高产率培养方法

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

诱导神经元（iNs）是通过将体细胞直接转化为神经元而获得的产物，这种方法能够从易于获取的组织中获得患者来源的神经元。通过该途径，可在数周内获得成熟的神经元。本文介绍了一种简单、快速的单步方案，用于从成人供体皮肤活检样本中获得的真皮成纤维细胞诱导生成iNs。我们详细说明了该过程的每一步操作，包括真皮成纤维细胞的培养维持、建立细胞系冻存的冷冻程序、用于重编程的细胞接种，以及转化过程中的培养条件。此外，我们还描述了用于电生理记录的玻璃盖玻片的制备、长期包被条件以及荧光激活细胞分选（FACS）的操作方法。同时展示了预期结果的示例。本文所述方案操作简便，适用于来自不同诊断类型和年龄患者的皮肤活检所获得的人源成纤维细胞。该方案可产生足够数量的iNs，广泛应用于多种生物医学研究，包括疾病建模、药物筛选和靶点验证。

从第5天开始，应可观察到细胞形态的明显变化（图1B）。病毒转导后可能会出现一定程度的细胞死亡，但通常不显著。在24孔板中，每个孔在第25天时预计可获得20,000–40,000个细胞，其中约一半应已转化为神经元。需要注意的是，细胞系、疾病状态以及病毒批次的不同均可能导致细胞产量和纯度的差异。
在第25天，细胞将表达大多数标准的神经元标志物，包括MAP2和TAU（图1C），并表现出成熟的神经元形态。可通过基于NCAM标志物的流式细胞分选（FACS）获得纯化的诱导神经元（iN）群体（参见文献8,11）。此后，细胞可重新接种至PFL三联包被培养基（参见文献10），或直接冻存用于生物分子分析。
如果未对细胞进行分选，则应使用 MAP2 或 TAU 进行免疫荧光标记，以鉴定成功转化的细胞，并与目的蛋白进行共标记。
<img alt="图1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56904/56904fig1.jpg" /> 
图1：iN细胞转化过程随时间的演变。（A）实验时间线及包装在慢病毒中用于重编程成人人类皮肤成纤维细胞的构建体图谱。每条黑色箭头代表一次培养基更换。（B）代表性相差显微镜图像，显示细胞从第0天到第22天转化过程中形态的变化（各图像右上角标注了对应时间点）。图像使用10倍物镜在相差显微镜下拍摄。（C）转导后第35天TAU与MAP2双染的免疫荧光图像。细胞用4%多聚甲醛固定，0.1% Triton DPBS溶液透化10分钟。用含5%血清的DPBS溶液封闭30分钟。一抗用封闭液稀释后，4 °C孵育过夜。荧光标记的二抗用封闭液稀释后室温孵育2小时。细胞用DAPI复染15分钟，随后用DPBS洗涤3次。图像使用20倍物镜在倒置荧光显微镜下拍摄。比例尺 = 100 µm（B, C）。缩写：ENM：早期神经元培养基；LNM：晚期神经元培养基。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56904/56904fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

直接神经元重编程生成的神经元可保持起始体细胞的年龄特征。本文介绍了一种基于单载体的方法，用于从成年人类供体获取的皮肤成纤维细胞中诱导生成神经元。

诱导性神经元（iNs）是通过将体细胞直接转化为神经元而获得的产物，是一种从易于获取的组织中获得患者来源神经元的方法……

本方案的总体目标是从人类成体皮肤成纤维细胞中高效地获得高产量的诱导神经元培养物。该方法有助于回答神经疾病领域中的关键问题，因为它能够建立基于患者、且保留细胞年龄特征的神经系统的退变模型。该方法的主要优势在于，可在仅25天内以高度标准化和高效的方式，从任何年龄段的个体中生成诱导神经元。它可用于多种生物医学应用，包括疾病建模、毒理学、诊断以及大规模的药物筛选检测。本实验操作将由本单位脑训练项目中的博士研究生 Shelby，以及我们实验室的 Karlonia 演示。首先，使用自动细胞解冻系统解冻成人人类皮肤成纤维细胞。使用自动细胞计数仪计数细胞数量后，将二十万个细胞接种至含有10毫升成纤维细胞培养基的T-75培养瓶中。于37摄氏度及5%二氧化碳条件下培养。次日，弃去旧培养基，更换为新鲜的成纤维细胞培养基。每隔三到四天更换一次成纤维细胞培养基，直至细胞达到95%融合度。在将重编程的人类成人真皮成纤维细胞接种前一小时，用250微升0.1%明胶对24孔板的每个孔进行包被。将培养板置于37°C孵育。吸去培养瓶中的成纤维细胞培养基，用杜氏磷酸盐缓冲液洗涤一次。洗涤后，在37摄氏度条件下，每T-75培养瓶加入1.5毫升0.05%胰蛋白酶溶液裂解细胞，作用3分钟。然后，每瓶加入3毫升成纤维细胞培养基以中和胰蛋白酶溶液。将细胞从培养瓶中冲洗两次，收集至15毫升离心管中并冷却。随后在400 ×g下离心5分钟。弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于1毫升成纤维细胞培养基中。然后，将 1,320,000 个细胞重悬于 13.2 毫升成纤维细胞培养基中，以获得每毫升培养基含 100,000 个细胞的细胞悬液。吸除培养板中的明胶后，用杜氏磷酸盐缓冲液洗涤培养板两次。随后，向每个孔中加入 500 微升细胞悬液，并在 37 摄氏度下孵育过夜。将13.2毫升成纤维细胞培养基预热至37摄氏度。随后，在室温下的超净工作台中解冻慢病毒载体。将感染复数为20所需的慢病毒体积加入培养基中，用于感染成人人类皮肤成纤维细胞，不添加任何转导增强剂。然后将培养基更换为500微升含有慢病毒载体的成纤维细胞培养基，在37摄氏度下孵育过夜。次日，将含有慢病毒的培养基更换为不含慢病毒载体的新鲜成纤维细胞培养基。病毒转导后的第三天，移除成纤维细胞培养基，并加入500微升早期神经元转化培养基。每周两到三次，从每个孔中更换225微升旧培养基，并加入250微升新鲜的早期神经元转化培养基。病毒转导后的第18天，移除早期神经元转化培养基，更换为500微升晚期神经元转化培养基。每两到三天更换一次培养基，直至第25天或达到实验终点。使用1000微升移液器吸除培养基。然后向每个孔中加入两份250微升的细胞解离试剂，将培养板置于培养箱中孵育10至20分钟，直至细胞解离并以单细胞形式悬浮。同时，配制 FACS 缓冲液。使用 1000 微升移液器进行吹打。如果仍有细胞团块存在，可延长孵育时间。将获得的单细胞悬液转移至1.5毫升离心管中。用晚期神经元转化培养基冲洗细胞孔两次，并将冲洗液转移至同一1.5毫升离心管中。随后，在400 ×g条件下离心5分钟，弃去上清液。接下来，将细胞沉淀重悬于200微升FACS缓冲液中。再次在400 ×g下离心5分钟，弃去上清液。用FACS缓冲液重悬细胞并进行离心。重复两次。然后，将细胞沉淀重悬于 50 微升含有 CD56 抗体（人源，1:50 稀释浓度）的 FACS 缓冲液中，冰上避光孵育 15 分钟。以 400 × g 离心 5 分钟，弃上清，将细胞沉淀重悬于 200 微升 FACS 缓冲液中以洗涤细胞。再次以400 G离心细胞5分钟。用FACS缓冲液洗涤两次，每次洗涤后均进行离心。最后，将细胞重悬于200微升含有10微克/毫升碘化丙啶的FACS缓冲液中。根据未用NCAM抗体或碘化丙啶染色的对照样本的荧光强度水平设门，分选NCAM阳性且碘化丙啶阴性的细胞。使用自动细胞计数仪计数细胞数量，并以每平方厘米50,000个细胞的密度将细胞接种至预先包被多聚-L-鸟氨酸、纤连蛋白和层粘连蛋白的培养板中，加入晚期神经元转化培养基。每周更换两次至三次半量的培养基，均使用晚期神经元转化培养基，直至达到实验终点。代表性相差显微图像显示了细胞在转化期间的形态学变化。从第5天起，细胞形态发生显著转变。到第22天时，约有一半的细胞已转化为神经元。代表性氨基酸荧光图像显示细胞中存在标准的神经元标志物。至第25天，细胞呈现出神经元形态，并表达MAP2和TAU等神经元标志物。细胞核经DAPI染色。 观看本视频后，您应能充分掌握如何从成人人类成纤维细胞诱导生成神经元，其中包括用于重编程的细胞接种、病毒转导、细胞培养维护，以及通过FACS分选进行纯化。该技术的发展为神经疾病领域的研究人员提供了研究疾病相关特征及潜在治疗方法的重要途径。而这可以在不仅限于人类神经系统，而且能够针对特定患者和特定疾病的系统中实现。

simple-generation-high-yield-culture-induced-neurons-from-human-adult

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

人类成人皮肤成纤维细胞诱导神经元高产培养的简单生成

我们已建立一种在特定条件下利用小分子直接从多能性人胚胎干细胞诱导生成神经母细胞的方案，该方法能够大量获得发育中中枢神经系统所需的神经前体细胞和神经元细胞类型，用于神经修复。...

利用小分子诱导高效地从多能性人胚胎干细胞分化获得人神经前体细胞与神经元

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在多孔板格式中快速高效地从人类多能干细胞生成神经元

本视频演示了一种分离由成人人类成纤维细胞衍生的诱导性神经前体细胞（iNPCs）的技术。该方法概述了分离iNPC克隆并将其培养于经层粘连蛋白包被的多孔板孔中的步骤，同时使用适宜的培养基，以促进iNPC群体的持续增殖与扩增。...

分离由成人人类成纤维细胞衍生的诱导性神经前体细胞克隆

该视频展示了如何从成人人类皮肤成纤维细胞（aHDFs）生成神经元。通过使用携带神经元转录因子基因和短发夹RNA（shRNAs）的慢病毒载体对aHDFs进行重编程。shRNAs可抑制神经元转录抑制因子的表达，而神经元转录因子则激活相关基因，促使aHDFs分化为神经元。这些重编程后的aHDFs在早期和晚期神经元转化培养基中进行培养，以生成成熟的神经元。...

通过重编程人皮肤成纤维细胞生成神经元

本视频介绍了一种制备包被多聚鸟氨酸和层粘连蛋白的玻璃盖玻片的方法，以增强神经干细胞的黏附和生长。该技术包括依次进行的孵育和洗涤步骤，有助于形成支持性基质，促进神经元细胞的生长与分化，模拟神经元中天然存在的结构。...

由人类神经干细胞生成皮层锥体神经元

我们报道了一种从原代人成纤维细胞培养物中分离出原始多能皮肤来源前体（SKP）细胞的方法。我们证明，这些源自成纤维细胞培养物的SKP细胞与直接从人皮肤活检组织中获得的SKP细胞具有相似的干细胞特性。这些细胞表达神经嵴标志物nestin，以及OCT4和Nanog等多能性标志物。...

从原代人成纤维细胞培养物中分离未分化的成体干细胞

诱导多能干细胞的生成为自体移植的获取提供了广阔的前景。然而，经历多能性状态以及繁琐的再分化过程仍然阻碍着其临床转化。本文描述了成人人类成纤维细胞的获取及其直接转化为诱导性神经前体细胞，并进一步分化为神经谱系细胞的方法。...

成年成人成纤维细胞的分离及其直接转化为可扩增的神经前体细胞

锥体神经元的树突棘是哺乳动物大脑皮层中大多数兴奋性突触的所在部位。本方法描述了对来源于诱导 多能干细胞的人类皮层锥体谷氨酸能神经元的树突棘形态进行三维定量分析。...

源自人诱导性多能干细胞的锥体神经元树突棘三维定量分析

通过使用非整合型仙台病毒（SeV）载体介导的皮肤成纤维细胞重编程，成功实现了人诱导性多能干细胞（hiPS细胞）的高效获得。hiPS细胞的维持和克隆扩增采用无异源成分且化学成分明确的培养条件，使用重组人源层粘连蛋白521（LN-521）基质和Essential...

使用层粘连蛋白521基质无整合方法建立人诱导多能干细胞

细胞重编程需要导入关键基因，这些基因调控并维持多能细胞状态。本方案描述了一种非病毒、非整合的方法，通过使用未修饰RNA（NM-RNA）并结合免疫逃逸因子以降低细胞防御机制，从而实现由人皮肤成纤维细胞生成诱导性多能干细胞（iPSCs）克隆。...

从腹部皮肤分离成人人类真皮成纤维细胞及使用非整合方法生成诱导性多能干细胞

我们描述了一种将人皮肤来源的成纤维细胞重编程为诱导性神经前体细胞（iNPCs），并进一步将其分化为诱导性星形胶质细胞（iAs）的实验方案。该方法可快速、可重复地大量生成iNPCs和iAs。...

利用成纤维细胞直接转化为神经祖细胞并分化为星形胶质细胞的体外神经疾病建模

了解如何利用慢病毒载体将成人皮肤成纤维细胞高效重编程为诱导神经元，仅需25天即可获得高产率培养物。该方法保留供体细胞年龄特征，为神经退行性疾病建模和药物筛选提供患者特异性模型。

由成人皮肤成纤维细胞简单高效地生成诱导神经元的高产率培养方法

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