Name: 比率钙显像对单个神经元的行为线虫线虫 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: 学习比率钙成像技术，用于研究秀丽隐杆线虫HSN神经元活动与行为变化的关系。该方法结合遗传编码钙指示剂GCaMP5和mCherry，实现高信噪比记录神经活动与行为同步追踪。

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本研究由美国国立神经疾病与中风研究所（NINDS）向 KMC 提供的资助（R01 NS086932）支持。LMN 由美国国立普通医学科学研究所（NIGMS）IMSD 项目资助（R25 GM076419）。本研究使用的线虫菌株来自 C. elegans 遗传中心（C. elegans Genetics Center），该中心由美国国立卫生研究院研究基础设施项目（NIH Office of Research Infrastructure Programs，P40 OD010440）资助。我们感谢 James Baker 和 Mason Klein 的有益讨论。

1. 菌株、培养基与动物固定
<ol>
	<li>培养 秀丽隐杆线虫 蠕虫在 20 &#176;C 在接种了OP50的标准60-mm线虫生长培养基（NGM）琼脂平板上 E. coli 细菌食物19.</li>
	<li>为每个感兴趣的细胞特异性启动子准备两种质粒：一种驱动GCaMP5表达以记录细胞内Ca²⁺，另一种共表达mCherry作为荧光对照。2+，第二个用于驱动 mCherry 表达，以实现对 GCaMP5 荧光变化的比率定量，并简化目标定位与测量。 
	注意：GCaMP5:mCherry 比值成像可校正因焦距变化和动物运动引起的 GCaMP5 荧光波动，而非细胞内 Ca²⁺ 的真实变化2+.</li>
	<li>将表达 GCaMP5 和 mCherry 的质粒与 pL15EK 可见拯救标记质粒共同注射到 LX1832 的性腺中 lite-1(ce314)，lin-15(n765ts) X突变型动物并筛选非多子宫阴门突变体 lin-15(+) 表达高拷贝数转基因 GCaMP5 和 mCherry 的动物20,21,22. 使用 lite-1 突变背景以减少蓝光回避行为23,24.</li>
	<li>将转基因整合到染色体以减少嵌合性并简化复合突变品系的构建25. 
	注意：此处描述的LX2004品系携带一个整合的高拷贝转基因，可在HSN中表达GCaMP5和mCherry nlp-3 启动子（参见 材料清单)26,27,28,29。该 nlp-3 启动子在晚期L4和成虫期动物的HSNs中驱动强烈表达，且与所测试的其他启动子相比，未引起HSN发育或产卵行为的显著缺陷（例如，tph-1, egl-6，以及 unc-86）。该品系以及在腹神经索（VC）运动神经元、阴门肌和uv1神经内分泌细胞中表达GCaMP5和mCherry的其他品系可从 秀丽隐杆线虫 基因中心及其构建细节已有描述27.</li>
	<li>从接种了OP50细菌的NGM琼脂平板上，用铂金线虫挑取器底部蘸取细菌食物，用于转移约20只表达GCaMP5和mCherry的晚期L4阶段LX2004线虫（HSNs中表达），从原培养板至 nlp-3 启动子。确保在体视显微镜下观察到发育中的外阴呈现为一个清晰的暗斑，周围环绕着新月形的亮白色区域。将动物在 20 &#176;C 24–40 小时。</li>
	<li>孵育后，用挑虫针蘸取 OP50，转移约 3 条线虫至未接种的 NGM 平板，保留少量食物供成像期间线虫取食。确保食物量适中，食物过少会导致线虫离开平板中心，而食物过多会增加背景荧光并引起缺氧。</li>
	<li>使用扁平的刮铲从培养板上切下一小块约 20 mm × 20 mm 的琼脂块，并将带有线虫的一面朝下转移至一片洁净的 24 mm × 60 mm 的 #1.5 盖玻片中央图1从一侧开始操作，以避免气泡被困在盖玻片下而干扰成像。将一块22 mm × 22 mm的#1盖玻片覆盖在样品块顶部，以减少粘连和蒸发。</li>
</ol>
2. 硬件与仪器设置
<ol>
	<li>将准备好的转基因线虫置于倒置显微镜载物台上，显微镜需配备数值孔径≥0.7的20倍平场复消色差物镜、可通过操纵杆控制的电动XY载物台、图像分光器、用于同时激发和收集GCaMP5与mCherry荧光的滤光片组、用于荧光和红外明场成像的相机，以及可触发式发光二极管（LED）照明系统（图2A）。 
	&#8203;注：80/20分光器将80%的图像信号发送至荧光相机，20%发送至明场相机。也可使用正置显微镜，但在此情况下，应将线虫生长培养基（NGM）琼脂块置于载玻片与大盖玻片之间。
	<ol>
		<li>使用双目目镜选择待成像的线虫。选定动物后，将红外滤光片滑入聚光镜上方的位置。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>晶体管-晶体管逻辑（TTL）触发信号
	<ol>
		<li>连接来自荧光相机三个TTL触发输出线的同轴电缆。将第一个输出连接到LED照明系统的BNC输入端口#3。</li>
		<li>将第二个输出连接至一个BNC“香蕉头”适配器，该适配器引出绿线和棕线，分别连接到8针GPIO连接器的GPIO输入#3（引脚4）和红外相机的地线（引脚5）。</li>
		<li>将第三个输出连接至另一个BNC“香蕉头”适配器，该适配器通过跳线连接到数据采集设备的数字输入端口#8和地线（图2B）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数据采集设备（DAQ）
	<ol>
		<li>通过USB线缆将DAQ微控制器板（参见材料表）连接到PC。使用标准Firmata协议（参见材料表）更新固件，并将USB端口配置为以57600波特率通信。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>LED
	<ol>
		<li>运行LED控制器软件（参见材料表）。将触发模式从“连续”切换为“门控”，并为470 nm和590 nm LED均选择触发通道“3”。</li>
		<li>打开并输入每个LED的功率（例如，将470 nm LED设为20%，590 nm LED设为40%）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在Bonsai中运行串口载物台通信脚本“XY-stage-final”（参见材料表）30。点击灰色的“CsvWriter”节点，选择一个文件夹来保存记录的X和Y载物台位置信息（图3）。按下工具栏中的绿色箭头以初始化DAQ。 
	注：当荧光相机发送TTL信号时，脚本将开始记录X和Y载物台位置。该脚本输出四列数据：帧号、X位置（µm）、Y位置（µm）以及帧间间隔（s）。</li>
	<li>在红外相机录制软件（参见材料表）的“自定义视频模式”下，选择“模式1”（2 x 2合并像素；1,024 x 1,024像素）和“像素格式Raw 8”。在“触发/选通”下，将触发输入线（GPIO）设置为“3”，极性设置为“高”，“模式”设置为“14”。切换“启用”选项，使帧采集在收到TTL触发信号前停止。
	<ol>
		<li>保持该窗口打开，点击主相机视图工具栏上的红色“录制”按钮。选择保存图像序列的文件夹。选择“缓冲”录制模式，并以JPEG格式保存“图像”。点击“开始录制”以初始化采集。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>荧光相机与图像分光器 
	注：必须同时采集GCaMP5和mCherry荧光通道，以确保比例定量所需的图像配准正确。图像分光器允许将GCaMP5和mCherry荧光双通道采集到一个传感器上。
	<ol>
		<li>在图像采集软件（参见材料表）的“采集”选项卡中，将曝光时间设置为10 ms，像素合并设置为4x，图像深度设置为16位。选择一个居中的相机子阵列，宽512像素，高256像素。点击“显示输出触发选项”，将所有触发设置为“正极性”。 
		&#8203;注：如果TTL触发信号为10 ms或更短，DAQ偶尔可能会错过触发。</li>
		<li>确保“触发1”和“触发2”设置为“曝光”，而“触发3”设置为“可编程”，其“周期”为25 ms。在“序列”选项卡下，选择“延时拍摄”，并将“场延迟1”设置为50 ms，以20 Hz频率采集图像。选择“保存到临时缓冲区”。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>三通道共聚焦成像期间的PMT增益与激光强度
	<ol>
		<li>设置PMT增益，使背景荧光水平略高于最小值（黑电平）。增加561 nm（绿光）激光功率，直到在mCherry通道的突触前末梢观察到一个饱和的12位或16位像素。</li>
		<li>调整488 nm（蓝光）激光强度，使GCaMP5荧光在突触前末梢刚好在背景之上可见。此低强度设置可防止在响应强Ca2+瞬变导致荧光增强时，GCaMP5像素饱和。将共聚焦针孔完全打开以最大化光收集。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 比值法钙成像2+ 成像与行为记录
<ol>
	<li>在荧光采集软件的“Sequence”选项卡下，点击“Start”开始记录。使用操纵杆跟踪线虫，使感兴趣的细胞和突触保持在视野（FOV）中央并处于清晰对焦状态。点击直方图窗口中的“Stats”按钮，以显示各通道的像素统计信息。</li>
	<li>调节LED光源功率，确保在突触前末端处单像素的mCherry荧光强度达到至少8,000计数（约4,000个光电子），从而在背景信号（约100个光电子）之上提供约12位的动态范围。在静息（低）Ca2+状态下，突触前末端的GCaMP5信号应约为2,500计数，略高于背景水平即可分辨。</li>
	<li>持续记录直至进入一次产卵活跃状态；通常在野生型线虫中每20–30分钟发生一次7。保存一段10分钟的子集数据（共12,001帧），包含产卵事件首次发生前后各6,000帧（以第6,001帧为事件帧）。务必同时保存对应时间段的明场行为图像以及XY载物台位置的时间点数据，否则将导致多通道数据流无法精确同步。</li>
	<li>使用ImageJ及BioFormats插件（参见材料表）将图像序列转换为图像细胞计量标准格式（.ics），以便导入比率定量分析软件中进行处理。</li>
</ol>
4. 图像分割与定量分析
<ol>
	<li>将图像序列导入比率定量软件（参见 材料清单）。在“工具”菜单中点击“自动对比度”，并调整每个通道的对比度，以设定合适的黑色水平（约 1,800）和白色水平（10,000）。选择“更改颜色”&#8230;在“工具”菜单中单击“确认”，以确保 mCherry 和 GCaMP5 通道的颜色分配正确（图 4A - C).
	<ol>
		<li>在“序列”选项卡中右键单击时间序列，将其设置为 20 帧/秒 1.25 &#181;m/pixe1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从“工具”菜单中选择“比率” &#34;GCaMP5&#34; 用于“通道A”和 &#34;mCherry&#34; 用于“通道B”。点击 &#34;计算&#34; 在“阈值”旁边选择以从每个图像序列中减去背景。 &#34;对比例通道应用彩虹色查找表（LUT）&#34;. 
	注意：对于平均基线比值为 0.3（低 Ca²⁺）的记录，光漂白校正斜率应小于 0.0005 比值单位/分钟。2+）以及2-3的最大比值（高Ca2+），合适的查找表应为从 0（蓝色）到 1（红色）。</li>
	<li>使用 mCherry 通道生成强度调制比值通道（图4D强度调制比率通道是一种将比率颜色映射到 mCherry 通道亮度上的百万色彩图像。</li>
	<li>在“测量”选项卡下，通过将“使用强度查找对象”工具拖到“协议”窗格中，创建一个对象查找协议。单击“齿轮”图标以设置 mCherry 强度值的窗口并查找对象。
	<ol>
		<li>选择强度值 ≥ 背景以上 2 个标准差（SD）例如， 下限约为 2,500，上限为 65,535。确保检测到突触前末端，并从“测量”菜单中选择“自动更新反馈”。 
		注意：该软件还可以通过“标准差强度”（SD Intensity）相关协议，依据物体与背景的标准差来识别物体。然而，如果有特别明亮的物体进入视野（FOV），可能会显著改变这些时间点的平均强度，从而影响用于识别HSN的强度阈值。若使用原始强度值来识别物体，则不会出现此类变异。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>添加仅针对 mCherry 通道的额外滤镜（大小、最大强度， 等等。如有必要，排除不需要的物体（如头部、尾部和肠道荧光）。从“测量”菜单中选择“创建测量项”，并选择“所有时间点”。 
	注意：这将执行实验方案，将所有测量值写入一个逗号分隔值（.csv）文件中，该文件应通过文件菜单中的“export”命令导出。</li>
	<li>打开 exported.csv 文件，复制时间点、面积（&#181;m2），平均值（比率通道），质心 X（&#181;m）和质心 Y（&#181;m) 数据导入新工作表。导出无列标题的 .csv 文件。比率定量软件可能将一个感兴趣细胞在每个时间点分类为一个或多个对象。
	<ol>
		<li>要重组这些对象，请使用自定义脚本 'AnalzyeGCaMP_2017.m'。 
		注意：该脚本还可识别 Ca2+ （比率）峰值，并保存包含这些峰值的时间点、峰值幅度和峰值宽度的 .csv 文件。同时生成原始比率轨迹及标注后比率轨迹的 Postscript 文件。利用这些信息，Ca2+ 应确定瞬时幅度和瞬时间隔。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将每个荧光物体的输出X和Y质心值与Bonsai中XY-stage脚本记录的X和Y值相加。利用净XY位置生成线虫运动轨迹，并计算伴随不同行为状态的细胞位移和速度。31.</li>
	<li>将记录的明场图像作为虚拟堆栈导入 ImageJ。标注产卵事件及其他行为。将这些事件的时间与 Ca2+ 比率轨迹中的峰</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争利益。

转基因：
由于通过密码子优化和内含子插入已改善了 mCherry 的表达（而大多数现有的 GCaMP 报告基因尚未如此），因此需注射约 4 倍量的表达 GCaMP5 的质粒，以确保在强 Ca2+ 瞬变期间 GCaMP5 荧光水平相当。lin-15(n765ts) 突变的挽救可方便地获得转基因动物，同时对产卵及其他行为的影响最小35。应将转基因整合到基因组中，以确保不同动物之间表达和成像条件的一致性25。可选择的标记物包括抗生素抗性36,37 和温度敏感致死突变的挽救38，这些标记也应可行，但由于非转基因动物已死亡，与呈现可见表型的标记相比，验证转基因整合和纯合性更为困难25。应避免使用干扰正常运动并降低适应性的显性标记，例如 rol-6(dm)39。在 lite-1 突变背景下成像对于减少成像过程中蓝光引发的逃避反应至关重要23,40,41。进一步突变与 lite-1 并行作用的 gur-3 可能进一步最小化蓝光引起的残余行为和生理变化42。方便的是，gur-3、lite-1 和 lin-15 均位于 X 染色体的右半部分，这将简化用于 Ca2+ 成像和光遗传学实验的新品系的构建。
由于曝光时间较短且图像采集频率为 20 Hz，GCaMP5 和 mCherry 信号必须足够明亮。导致钙信号噪声最可能的原因是2+ 记录过程中遇到的一个问题是报告基因表达较弱导致荧光信号微弱。所选用的启动子应对成像区域具有合理的特异性。由于HSN细胞体及其向阴门肌发出的突触位于虫体中央，若在其他部位出现额外表达，则可能干扰成像结果。 nlp-3 启动子在头部和尾部的表达通常位于视野之外，可通过Ratiometric Quantitation软件中的额外滤镜排除。为确保观察到的GCaMP5荧光变化确实源于细胞内Ca²⁺的实际变化2+，应独立制备和分析表达 GFP 而非 GCaMP5 的对照转基因品系26. 更新的 Ca2+ 具有不同钙敏感性的报告分子2+ 灵敏度、动力学特性和颜色的多样化拓展了可用成像工具的选择范围，但每种新的报告分子都应使用 Ca 进行验证2+-不敏感的荧光变体14,16.
培养基：
用于成像的 NGM 平板应使用高质量琼脂制备。低质量琼脂在高压灭菌时无法完全溶解，会留下微小颗粒，在成像过程中散射光线并增加背景荧光。可改用分子生物学级琼脂糖，但应减少添加量以保持平板硬度一致。
与其他固定方法的比较：
以往对产卵行为神经环路活动的成像研究通常使用胶水将线虫固定在琼脂糖垫上。在这种条件下，除非降低培养基的渗透压，否则不利于神经环路活动和产卵行为的发生8,10,44,45。最近的研究表明，多种线虫行为受到运动状态的调控，这引发了一个问题：在固定动物中观察到的细胞活动是否能真实反映自由活动动物中的情况。我们近期的研究发现，产卵环路的活动出乎意料地与运动节律相位相关26,27。类似地，RIA中间神经元中的区室化Ca2+信号在觅食运动过程中整合了感觉神经元和头部运动神经元的输入活动46。排便行为也伴随着精确且刻板的运动模式改变，使动物能够在排出废物前离开其觅食位置47。这些结果共同表明，从固定动物中获得的短暂神经环路活动记录可能与自由活动动物中的实际情况存在本质差异。
尽管线虫直接位于盖玻片下方，其行为仍与在标准NGM平板上观察到的相似。产出的卵能够正常孵化，且少量的食物残留足以支持L1幼虫发育为成虫（数据未显示）。较大的琼脂块有助于实现合理的气体交换并抵抗脱水，但食物过多会增加背景荧光。该方法最适合成虫成像，但也可用于L4期幼虫的观察。然而，由于琼脂块与盖玻片之间的水层厚度较大，较小的幼虫在爬行时存在困难，常会被移动的成虫带动而困于其后。
这种固定技术的一个局限性在于，难以对身体的特定区域进行直接的机械或化学刺激。近年来，图案化照明技术的发展使得能够分别激活头部或尾部表达的微生物视蛋白，同时在身体中部独立进行GCaMP/mCherry荧光的照明与检测48,49。因此，有可能通过光遗传学方法克服这一问题。
与其他 Ca2+ 成像方法的比较：
该方法在记录细胞质 Ca²⁺ 变化方面效果良好2+ 来自单个分离细胞及其突触区域。最近通过利用细胞核的位置来鉴定细胞，并定量核浆钙的变化，已实现了对头部神经元的实时三维成像。50,51,52细胞核与突触钙信号之间的关系2+ 仍不明确。我们的数据表明，HSN细胞内Ca²⁺最显著的变化2+ 发生在远离细胞胞体的突触前末梢图 4DHSN 和 VC 神经元的轴突末梢嵌入于突触后的阴门肌中26在Z轴方向上，即使采用转盘或光片技术，其分辨率是否足以确定突触前Ca2+ 无需依赖体细胞钙信号进行细胞鉴定，即可将信号特异性地传递至特定细胞。采用此处所述技术，每次10分钟、包含12,001帧256 × 256像素16位TIFF图像的双通道记录数据量约为4 GB。经比率化处理及强度调制的比率通道使文件大小增加一倍，达约8 GB。一项典型实验需记录两种基因型（野生型与实验组）各10只动物，将产生近150 GB的原始数据，数据采集与分析耗时约20小时。若进行体积成像分析，每时间点包含10层Z轴切片，则所需数据量与分析时间将增加一个数量级，这解释了为何迄今完成的此类研究极为有限。
硬件：
我们在配备高性能双处理器的工作站上记录和分析图像序列例如， 游戏）显卡、64 GB 内存和高性能固态硬盘（参见 材料清单)。数据应存储在网络连接的独立磁盘冗余阵列（RAID）上，并在异地数据中心进行云端备份。
我们建议使用高功率准直LED进行脉冲荧光激发，而非金属卤化物或汞基光源。目前市面上有多种多色LED系统可供选择。尽管其中一些LED系统的前期成本较高，但其使用寿命长（> 20,000 小时），可同时激发四种或更多不同的荧光染料，并可通过串行和/或TTL接口实现精确的时间控制，延迟低（开关时间为10–300 µs）。触发控制可确保仅在实际采集数据时对样品进行照明。我们通常每50 ms进行一次10 ms的曝光（占空比为20%）。这可以减少光毒性以及图像采集过程中的运动模糊，正如先前报道的那样43。
我们采用 sCMOS 相机，因其具备高速度以及大量小型且高灵敏度的像素。EM-CCD 相机是一种成本更高的替代方案，但“溢出”效应可能导致采集的光电子扩散至相邻像素。新型背照式 sCMOS 相机在显著降低成本的同时，实现了与 EM-CCD 相当的光敏感度。无论使用何种传感器，都必须同时获取 GCaMP5 和 mCherry 通道的信号。在运动中的线虫上进行顺序采集会导致图像配准不良，无法用于比率定量分析。在使用图像分光器（图 2）将通道分离后，可将双通道成像投射至单台相机上实现，也可使用两台相同的相机完成。为实现准确的比率定量分析，建议采用 16 位图像而非 8 位图像的动态范围。对于线虫行为的明场图像，我们使用 1 英寸 4.1 MP 近红外 USB3 相机，在 JPEG 压缩后采集大尺寸 2 × 2 二乘二合并的 1,024 × 1,024 8 位图像序列。新型显微镜型号提供的更大视场，使得成年线虫在 0.63 倍缩小倍率下以 20 倍物镜观察时，仅产生轻微晕影即可实现清晰成像（图 4E）。
我们建议使用标准的TTL电压信号来同步照明和帧捕获。由于不同软件程序可能存在延迟，建议用户将荧光相机配置为主控设备，通过其TTL输出信号触发所有其他设备。这样，每次Ca2+测量时都将同步采集明场图像和载物台位置信息。
在共享共聚焦显微镜平台中常见的狭缝式或共振点扫描共聚焦显微镜在进行比例式 Ca2+ 成像时同样表现出优异性能。此类仪器可用于同时采集两个或更多荧光通道以及明场图像24。在此情况下，应将共聚焦针孔调至最大直径，并使用光谱探测器分离 GCaMP5、mCherry 和红外明场信号。这样可在采集较厚（约 20 µm）样本的光信号时最大化光收集效率，同时仍能有效排除离焦荧光干扰。其缺点是视场较小，且在硬件和软件定制方面存在更多限制。
软件：
大多数制造商在运输和安装相机与显微镜时会附带专有软件，包括触发输入和输出的配置。该软件在记录过程中的功能和性能可能有所不同。由于快速移动的线虫追踪难度较高，记录期间的图像显示需在 20 Hz 下保持流畅且稳定。为提高性能，图像序列可临时保存在内存中，并在实验结束时将与行为相关的子集数据保存下来。这两个通道的图像序列文件可转换为开放的图像细胞计量标准格式（.ics），以便导入到比率定量分析软件中。OME-TIFF 是一种较新的开源图像格式，但不同的系统安装可能无法保存超过 4 GB 的 TIFF 图像序列。
定量分析流程的一个关键特征是生成比值通道，然后利用 mCherry 荧光进行无偏图像分割以识别目标细胞。对于每个识别出的对象，计算其对象大小、XY 平面质心位置，以及各通道（包括比值通道）的最小、平均和最大荧光强度值。这些数值共同用于量化记录过程中每个时间点细胞内 Ca2+ 的变化。每个时间点的对象测量结果随后被导出为 .csv 文件，供后续分析使用。
本文所述方案的一个主要局限在于需要通过一系列不同的软件产品以多种格式传输数据。另一个令人困扰的问题是，其中部分软件为开源且免费，而其他软件则为闭源、昂贵且更新不均衡。一个重要的改进方向是使用或开发一款软件（理想情况下为开源软件），使其从数据采集到分析均能提供相似的性能水平和易用性。如上所述，比率分析会使实验所需的数据文件大小和完成时间均增加一倍。若能开发可集成到用户可定制框架（如 Bonsai）中的相机驱动程序，将可实现图像及其他数据流的实时采集与分析，从而显著提高实验通量。
未来展望：
尽管我们通常手动追踪线虫的运动，但通过红外明场或暗场记录中检测到的线虫质心进行追踪，应可实现额外的图像处理节点，以提供显微镜载物台位置的闭环调节和自动追踪（图3，数据未显示）。采用该方法获得的大部分荧光记录为无信号的黑暗区域，不包含具有生物学意义的数据。若采用传感器上或实时的图像后处理技术，将图像序列裁剪至目标对象区域，则可提高空间分辨率，并加快数据分析流程，特别是在每个时间点采集额外Z层切片以可视化神经回路中所有突触前和突触后细胞活动的情况下。

神经科学的一个核心目标是理解神经元如何通过神经回路中的相互作用来驱动动物行为。神经回路整合多种多样的感觉信号，从而改变回路活动，促使动物产生必要的行为变化以响应其周围环境。C. elegans（秀丽隐杆线虫）具有一个结构简单的神经系统，仅包含302个神经元，且其突触连接已被完全绘制1。此外，编码参与神经传递相关蛋白的基因在C. elegans与哺乳动物之间高度保守2。尽管其神经系统在解剖结构上较为简单，但它表现出一系列复杂且保守的行为模式，为研究神经元如何调控行为提供了理想的平台3。
秀丽隐杆线虫 适用于多种方法的应用，如基因操作、激光细胞消融、电生理技术等 在体 光学成像4,5近期研究已绘制出主要神经递质信号系统的详细图谱 秀丽隐杆线虫 包括胆碱能和GABA能神经网络。这些研究，以及正在进行的关于绘制所有神经元G蛋白偶联受体表达图谱的研究，使该模型处于独特地位，能够利用高度详细的神经元结构与功能连接图谱，全面理解这些不同的神经递质如何通过不同受体和时间尺度介导动物行为的各个方面。
为了研究任何系统中神经元活动的动态模式，一个基本前提是要建立可靠的方法，以记录行为过程中单个神经元或完整神经回路的活动。尤为重要的是，这类光学方法能够可视化驱动突触囊泡融合的突触前活动。快速且高灵敏度的细胞内 Ca2+ 荧光报告系统，结合日益普及的高灵敏度光电探测器，已彻底改变了在清醒、活体动物行为期间对细胞和突触活动的记录方式。由于突触电活动的主要效应之一是调控 Ca2+ 通道，细胞内 Ca2+ 的变化被认为能够忠实地反映与行为相关的细胞活动变化。
本研究中，我们介绍了一种对C. elegans中促进产卵行为的5-羟色胺能HSN运动神经元进行比率式Ca2+成像的方法6,7。该方法在先前研究的基础上发展而来，旨在行为过程中可视化C. elegans及其产卵神经回路中的Ca2+活动5,8,9,10,11。该技术能够将观察到的细胞/回路活动变化与产卵事件以及动物运动状态的变化同时关联起来。尽管我们使用该方法研究成年线虫的神经活动，但本实验室未发表的研究表明，该方法同样可应用于第四幼虫期（L4期）的幼年个体。该技术很可能也适用于研究C. elegans中参与其他不同神经回路与行为的神经元活动。结合其他近期开发的具有非重叠发射光谱的快速Ca2+指示剂12,13,14,15,16、光遗传学工具17以及基因编码的膜电位光学探针18，我们将能够深入开展“全光学”研究，揭示神经回路活动变化如何驱动不同的行为状态。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;em&gt;秀丽隐杆线虫&lt;/em&gt; 生长、培养与制备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;大肠杆菌&lt;/em&gt; 细菌菌株 OP50</td><td>秀丽隐杆线虫遗传中心</td><td>OP50</td><td>秀丽隐杆线虫食物。尿嘧啶营养缺陷型。大肠杆菌B型。生物安全等级1</td></tr><tr><td>HSN GCaMP5+mCherry 蚯蚓品系</td><td>秀丽隐杆线虫遗传中心</td><td>LX2004</td><td>使用整合型转基因 &lt;em&gt;nlp-3&lt;/em&gt; 使用启动子驱动 HSN 中 GCaMP5 和 mCherry 的表达。&amp;nbsp; 完整基因型：&amp;nbsp;&lt;em&gt; vsIs183&lt;/em&gt; &lt;em&gt;[nlp-3p::GCaMP5::nlp-3 3'UTR + nlp-3p::mCherry::nlp-3 3'UTR + lin-15(+)], lite-1(ce314), lin-15(n765ts)&lt;/em&gt; X</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;lite-1(ce314), lin-15(n765ts)&lt;/em&gt; 用于转基因制备的突变品系</td><td>作者</td><td>LX1832</td><td>用于在显微注射 pL15EK 后回收高拷贝转基因的菌株&lt;em&gt; lin-15(n765ts)&lt;/em&gt; 救援质粒。还带有连接的&lt;em&gt; lite-1(ce314)&lt;/em&gt; 可向作者索取降低蓝光敏感性的突变体</td></tr><tr><td>pL15EK&lt;em&gt; lin-15a/b&lt;/em&gt; 基因组拯救质粒</td><td>作者</td><td>pL15EK</td><td>LX1832 转基因动物注射后用于回收的拯救质粒 &lt;em&gt;lite-1(ce314)&lt;/em&gt;,&lt;em&gt; lin-15(n765ts)&lt;/em&gt; X 品系。可向作者索取</td></tr><tr><td>pKMC299 质粒</td><td>作者</td><td>pKMC299</td><td>HSNs中表达mCherry的质粒 &lt;em&gt;nlp-3&lt;/em&gt; 启动子。Has&lt;em&gt; nlp-3&lt;/em&gt; 3'非翻译区</td></tr><tr><td>pKMC300 质粒</td><td>作者</td><td>pKMC300</td><td>HSNs 中表达 GCaMP5 的质粒 &lt;em&gt;nlp-3&lt;/em&gt; 启动子。Has &lt;em&gt;nlp-3&lt;/em&gt; 3'非翻译区</td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Sigma</td><td>P8281</td><td>NGM 平板的制备</td></tr><tr><td>磷酸氢二钾</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>NGM平板的制备</td></tr><tr><td>七水硫酸镁</td><td>Amresco</td><td>0662</td><td>NGM 平板的制备</td></tr><tr><td>二水合氯化钙</td><td>Alfa Aesar</td><td>12312</td><td>NGM 平板的制备</td></tr><tr><td>蛋白胨</td><td>Becton Dickinson</td><td>211820</td><td>NGM 平板的制备</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Amresco</td><td>0241</td><td>NGM 平板的制备</td></tr><tr><td>胆固醇</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11470</td><td>NGM 平板的制备</td></tr><tr><td>琼脂，细菌级 A 型，超纯</td><td>Affymetrix</td><td>10906</td><td>NGM 平板的制备</td></tr><tr><td>60 mm 培养皿</td><td>VWR</td><td>25384-164&amp;nbsp;</td><td>NGM 平板的制备</td></tr><tr><td>24 x 60 mm 微型盖玻片，#1.5</td><td>VWR</td><td>48393-251</td><td>用于成像线虫的盖玻片</td></tr><tr><td>22 x 22 mm 微型盖玻片，#1</td><td>VWR</td><td>48366-067</td><td>覆盖琼脂块顶部的盖玻片</td></tr><tr><td>带透射光源底座的立体显微镜</td><td>Leica</td><td>M50</td><td>用于线虫品系维护、分期和制备的解剖显微镜</td></tr><tr><td>铂铱合金丝（80:20），0.2 mm</td><td>ALFA AESAR</td><td>AA39526-BW</td><td>用于线虫转移</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;钙成像显微镜&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>防振气浮台</td><td>TMC</td><td>63-544</td><td>微型重力实验室桌 30&quot; × 48&quot; 带有4个的防震台&quot; 25毫米顶面 CleanTop M6</td></tr><tr><td>倒置复合显微镜</td><td>Zeiss</td><td>431007-9902-000</td><td>Axio Observer.Z1 倒置显微镜</td></tr><tr><td>侧端口 L80/R100（3 位）</td><td>Zeiss</td><td>425165-0000-000</td><td>将20%的输出导向明场（CMOS）相机，80%导向荧光（sCMOS）相机</td></tr><tr><td>倾斜背光照明载板</td><td>Zeiss</td><td>423920-0000-000</td><td>用于红外/行为成像</td></tr><tr><td>Lamphousing 12V/100W w/ Collector</td><td>Zeiss</td><td>423000-9901-000</td><td>用于红外/行为成像</td></tr><tr><td>卤素灯 12V/100W</td><td>Zeiss</td><td>380059-1660-000</td><td>用于红外/行为成像。白光LED不发射显著的红外光，因此在使用红外带通滤光片后无法实现明场成像。</td></tr><tr><td>32 mm 红外带通滤光片（750-790 nm）用于卤素灯</td><td>Zeiss</td><td>447958-9000-000</td><td>BP 750-790；DMR 32mm，用于明场和行为观测的红外照明</td></tr><tr><td>6孔位滤光转盘聚光镜（LD 0.55 H/DIC/Ph），电动</td><td>Zeiss</td><td>424244-0000-000</td><td>用于红外/行为成像</td></tr><tr><td>聚光镜 &amp;amp; 快门</td><td>Zeiss</td><td>423921-0000-000</td><td>用于红外/行为成像</td></tr><tr><td>带光导管的双目目镜，用于红外CMOS相机</td><td>Zeiss</td><td>425536-0000-000</td><td>用于红外/行为成像</td></tr><tr><td>目镜 10x，23 mm</td><td>Zeiss</td><td>444036-9000-000</td><td>用于在琼脂块上定位线虫</td></tr><tr><td>C型转接环 2/3&quot; 0.63倍减倍镜</td><td>Zeiss</td><td>426113-0000-000</td><td>红外CMOS相机支架</td></tr><tr><td>用于红外明场和行为观测的 CMOS 相机（1&quot; 传感器</td><td>FLIR（前身为 Point Grey Research）</td><td>GS3-U3-41C6NIR-C</td><td>用于明场成像的相机</td></tr><tr><td>USB 3.0 主机控制器卡</td><td>FLIR（前身为 Point Grey Research）</td><td>ACC-01-1202</td><td>Fresco FL1100，4 端口</td></tr><tr><td>8 针，1 米 GPIO 电缆，Hirose HR25 圆形连接器&amp;nbsp;</td><td>FLIR（前身为 Point Grey Research）</td><td>ACC-01-3000</td><td>TTL 触发用电缆。绿色线连接至 GPIO3 / 引脚 4，棕色线连接至接地 / 引脚 5</td></tr><tr><td>Plan-Apochromat 20x/0.8 WD=0.55 M27</td><td>Zeiss</td><td>420650-9901-000</td><td>最佳的放大倍数、数值孔径与工作距离组合</td></tr><tr><td>6立方体反射镜转台，电动</td><td>Zeiss</td><td>424947-0000-000</td><td>用于荧光成像</td></tr><tr><td>荧光光路，电动</td><td>Zeiss</td><td>423607-0000-000</td><td>用于荧光成像</td></tr><tr><td>荧光快门</td><td>Zeiss</td><td>423625-0000-000</td><td>用于荧光成像</td></tr><tr><td>GFP 和 mCherry 双激发与发射滤光立方体（用于显微镜）</td><td>Zeiss</td><td>489062-9901-000</td><td>荧光成像用FL滤光片组62 HE BFP+GFP+HcRed</td></tr><tr><td>LED照明系统</td><td>Zeiss</td><td>423052-9501-000</td><td>可触发的 Colibri.2 LED 荧光照明系统</td></tr><tr><td>GFP LED 模块（470 nm）</td><td>Zeiss</td><td>423052-9052-000</td><td>用于GFP荧光激发的Colibri.2 LED</td></tr><tr><td>mCherry LED 模块（590 nm）</td><td>Zeiss</td><td>423052-9082-000</td><td>Colibri.2 LED 用于 mCherry 荧光激发</td></tr><tr><td>透射光设备用虹膜光圈滑块</td><td>Zeiss</td><td>000000-1062-360</td><td>通过调节场光阑虹膜以限制LED照明范围，使其与相机视野一致</td></tr><tr><td>C型接口转接器 1&quot; 1.0x</td><td>Zeiss</td><td>426114-0000-000</td><td>用于图像分光器和sCMOS荧光相机的适配器</td></tr><tr><td>图像分束器</td><td>滨松</td><td>A12801-01</td><td>Gemini W-View，其他图像分光器也可使用，但可能未针对sCMOS相机的大传感器尺寸进行优化</td></tr><tr><td>GFP / mCherry 二向色镜（图像分光器）</td><td>Semrock</td><td>Di02-R594-25x36</td><td>将 GCaMP5、mCherry 与红外信号分离</td></tr><tr><td>GFP发射滤光片（图像分光器）</td><td>Semrock</td><td>FF01-525/30-25</td><td>捕获 GCaMP5 荧光信号</td></tr><tr><td>mCherry/发射滤光片（图像分光器）</td><td>Semrock</td><td>FF01-647/57-25</td><td>该滤光片对于排除用于明场成像的红外光是必要的</td></tr><tr><td>sCMOS 荧光相机（1&quot; 传感器</td><td>Hamamatsu</td><td>A12802-01 / C11440-22CU</td><td>Orca FLASH 4.0 V2。新型号支持对传感器的两个半区分别设置图像采集参数，可结合图像分光器实现双通道图像的采集。</td></tr><tr><td>电动XY载物台</td><td>M&amp;auml;rzh&amp;auml;行为动物中神经环路活动与麻醉或固定动物中的活动存在显著差异。基于高灵敏度、基因编码的Ca2+荧光探针，现已能够通过非侵入性光学方法在行为动物中记录细胞与突触活动，从而彻底改变了该领域的研究方式。结合遗传学与光遗传学技术，可进一步揭示在不同行为状态下调控细胞与环路活动的分子机制。本文介绍了一种在自由活动的秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中对单个神经元进行比率式Ca2+成像的方法。我们展示了一种简易的固定技术，将生长在标准线虫培养基（Nematode Growth Media, NGM）琼脂块上的线虫轻轻覆盖盖玻片，使动物在无约束运动和自然行为过程中得以高分辨率记录。利用该技术，我们采用高灵敏度Ca2+探针GCaMP5，记录了血清素能雌雄同体特异性神经元（Hermaphrodite Specific Neurons, HSNs）在驱动产卵行为过程中细胞内Ca2+的变化。通过共表达对Ca2+不敏感的荧光蛋白mCherry，可追踪HSN位置（精度约1 µm），并校正因焦距变化或运动引起的荧光波动。同时进行的红外明场成像结合电动载物台，可实现行为记录与动物追踪。通过整合上述显微技术与数据流，我们能够在数十分钟的时间尺度上，记录C. elegans产卵神经环路在非活动与活动行为状态转换过程中的Ca2+活动。</td><td>SCAN IM 130 x 100</td><td>阶段移动；该阶段的 XY 分辨率为 0.2&amp;micro;m 每步&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>带操纵杆的 XY 载物台控制器</td><td>LUDL</td><td>MAC6000，XY 手持操纵杆</td><td>手动追踪线虫。MAC6000控制器应通过串行（RS-232）端口连接至计算机，并设置为115200波特率。</td></tr><tr><td>数字采集板（DAQ）</td><td>Arduino</td><td>一</td><td>接收来自sCMOS相机的TTL触发信号。Uno应加载标准Firmata程序包，并将计算机USB端口配置为57600波特率</td></tr><tr><td>BNC公头至BNC公头线缆 - 6英尺</td><td>Hosa Technology</td><td>HOBB6</td><td>用于TTL触发的BNC连接器</td></tr><tr><td>镀金BNC公头转SMA公头同轴电缆（8.8&quot;)</td><td>uxcell</td><td>608641773651</td><td>连接荧光相机触发输出</td></tr><tr><td>BNC 转接头</td><td>Hantek</td><td>RRBNCTH21</td><td>BNC 转香蕉插头适配器（4 mm）</td></tr><tr><td>BNC 雌头至雌头连接器</td><td>Diageng</td><td>20130530009</td><td>BNC 母对母转接头，用于将相机的 BNC 输出端连接至香蕉插头</td></tr><tr><td>无焊柔性面包板跳线</td><td>Z&amp;amp;T</td><td>GK1212827</td><td>将BNC触发输出连接至Arduino数据采集设备。&amp;nbsp; 男性对男性。</td></tr><tr><td>高性能工作站</td><td>HP</td><td>Z820</td><td>Windows 7，64 GB RAM，双路 Xeon 处理器，固态 C 盘，串行（RS-232）端口，多个用于以太网连接的 PCIe3 插槽，USB 3.0 扩展卡，以及额外的固态硬盘</td></tr><tr><td>M.2 固态硬盘</td><td>三星</td><td>MZ-V5P512BW</td><td>高速图像数据的流式传输与分析</td></tr><tr><td>M.2 固态硬盘适配器&amp;nbsp;用于工作站</td><td>Lycom</td><td>DT-120</td><td>M.2 转 PCIe 3.0 四通道适配器</td></tr><tr><td>网络附加存储</td><td>Synology</td><td>DS-2415+</td><td>成像数据存储与分析</td></tr><tr><td>硬盘驱动器</td><td>西部数据</td><td>WD80EFZX</td><td>RED 8 TB，5400 RPM 级 SATA 6 Gb/s，128MB 缓存，3.5 英寸。用于成像数据存储（10 块硬盘 + 2 块硬盘冗余）</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>荧光信号采集</td><td>Hamamatsu</td><td>HCImage DIA</td><td>以每秒20帧的速度记录双通道（GCaMP5和mCherry）荧光图像序列</td></tr><tr><td>明场图像采集</td><td>FLIR（前身为 Point Grey Research）</td><td>Flycapture</td><td>明场 JPEG 图像序列的记录</td></tr><tr><td>阶段串口读取器</td><td>Bonsai</td><td>https://bitbucket.org/horizongir/bonsai</td><td>便于在行为过程中追踪线虫</td></tr><tr><td>LED 控制器软件</td><td>Zeiss</td><td>微型工具箱测试 2011</td><td>设置 Colibri.2 单元中不同 LED 的光强和触发输入</td></tr><tr><td>ImageJ&amp;nbsp;</td><td>美国国立卫生研究院</td><td>https://imagej.net/Fiji/Downloads</td><td>图像序列的简易审阅及导入比率定量软件前的格式转换</td></tr><tr><td>Excel</td><td>微软</td><td>&amp;nbsp;2002984-001-000001</td><td>用于从 Volocity 生成逗号分隔值数据子集以进行 MATLAB 分析</td></tr><tr><td>峰值检测</td><td>MATLAB</td><td>R2017a</td><td>用于计算比率峰值特征的脚本</td></tr><tr><td>比率定量</td><td>Perkin Elmer</td><td>Volocity 6.3</td><td>促进比例图像通道的计算、用于目标识别的图像分割，以及对识别目标的比例测量</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;脚本&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>XY-轴-最终.bonsai</td><td>Bonsai</td><td>TTL 触发的 DAQ 与载物台位置串口读取器</td><td>当连接的 Arduino 在帧曝光期间接收到来自 sCMOS 相机的正向 TTL 信号时，记录 X 和 Y 轴位置（单位：微米）。脚本生成一个包含四列的 .csv 文件：帧编号、X 位置（微米）、Y 位置（微米）以及帧间 elapsed 时间（以 20 fps 采样时通常约为 ~50 毫秒）。&amp;nbsp; 将该输出中的X和Y轴位置（分别为第2列和第3列）与MATLAB脚本AnalyzeGCaMP_2017.m生成的X和Y轴质心位置（分别为第4列和第5列）相加，得到记录中荧光物体的最终X和Y位置。&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

行为动物中单个神经元的比率钙成像 秀丽隐杆线虫

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

越来越多的研究表明，活动状态动物的神经回路活动与麻醉或固定动物中的神经活动存在显著差异。高灵敏度的基因编码钙离子（Ca2+）荧光探针已彻底改变了在活动动物中通过非侵入性光学手段记录细胞和突触活动的方式。当这些探针与遗传学和光遗传学技术相结合时，可识别在不同行为状态下调控细胞和回路活动的分子机制。
本文描述了在自由活动的秀丽隐杆线虫中进行比例钙成像的方法。2+ 自由活动个体中单个神经元的成像 秀丽隐杆线虫 线虫。我们展示了一种简单的固定技术，该技术通过将生长在标准线虫生长培养基（NGM）琼脂块上的线虫轻轻覆盖一层玻璃盖玻片来进行固定，使动物在自由活动和行为过程中能够以高分辨率被记录。利用该技术，我们使用灵敏的 Ca²⁺ 探针 GCaMP5 来记录驱动产卵行为的五羟色胺能雌雄同体特异性神经元（HSNs）中细胞内 Ca²⁺ 的变化。通过共表达对 Ca²⁺ 不敏感的荧光蛋白 mCherry，可追踪 HSN 的位置（精度约 1 µm），并校正因焦距变化或运动引起的荧光波动。同时，利用红外明场成像结合电动载物台，可实现行为记录与动物追踪。通过整合这些显微技术与数据流，我们能够在数十分钟内记录 C. elegans 产卵神经环路在非活动与活动行为状态转换过程中的 Ca²⁺ 活动。2+ 报告基因 GCaMP5 用于记录细胞内 Ca²⁺ 的变化2+ 在驱动产卵行为的5-羟色胺能雌雄同体特异性神经元（HSNs）中。通过共表达对钙离子不敏感的荧光蛋白mCherry，2+-不敏感的荧光蛋白，我们可以将 HSN 的位置追踪精度控制在约 ~ 1 &#181;m 并校正因焦距变化或运动引起的荧光波动。同步进行的红外明场成像可通过电动载物台实现行为记录与动物追踪。通过整合这些显微技术与数据流，我们能够记录线虫在数十分钟内从非活跃到活跃行为状态转变过程中，C. elegans 排卵环路中的 Ca²⁺ 活性。2+ 活动在 秀丽隐杆线虫 卵子产出回路在数十分钟内从非活跃行为状态向活跃行为状态转变的过程。

本文所述的简易固定技术（图1）在允许通过玻璃盖玻片对行为中的L4期及成年C. elegans进行高分辨率记录的同时，对其培养环境的影响极小（图4）。通过同步LED光源、载物台控制器和相机曝光，可实现每秒20帧、持续长达1小时的多通道数据采集。采用中等放大倍数（20倍）并结合高数值孔径物镜（0.7–0.8），即使使用4×4像素合并模式（1.25 µm/像素），仍可对产卵行为神经回路中的突触区域实现良好的空间分辨率。同时采集GCaMP5和mCherry荧光信号（图4A, B），用于生成逐像素的比值通道，以校正动物运动和焦距变化带来的影响（图4D）。HSN轴突前终末的尺寸可达到C. elegans中许多神经元胞体的大小，因此HSN突触前Ca2+的变化可被清晰观察。红外明场相机的大视野使线虫在记录过程中可被手动追踪（图4E）。对于每只动物，细胞内Ca2+的变化均可与明场成像中可见的行为（包括产卵和运动状态改变）进行关联分析（图4E）。
HSN Ca定量2+ 速度的变化证实，线虫在转变为产卵行为时，其运动方式也随之改变。在线虫产卵活跃状态之前、期间和之后，其运动速度存在显著差异。图5A）。这并非由成像或追踪系统本身的噪声引起。放大观察一次产卵事件，我们发现在产卵事件发生前，GCaMP5荧光信号（ΔF/F）显著变化，而mCherry荧光信号相对保持稳定（图5B). GCaMP5与mCherry比值（ΔR/R）的测量变化清晰地显示了HSN钙2+ 卵子释放前约 4 秒的瞬时变化（图5B）。随着阴门肌收缩，线虫的运动明显减慢，直至产卵结束。先前的研究结果表明，由HSNs支配的胆碱能VC运动神经元在强烈的阴门肌收缩及产卵期间表现出最高的活性。 8,10,27我们还发现，通过光遗传学激活VC神经元会立即导致运动速度减慢，这提示VC神经元可能由阴门肌收缩所激活，从而在接收到卵子释放的反馈信号之前持续抑制运动速度。27.
所述成像与追踪系统可实现对产卵行为空间分布的可视化（图5C）。如先前研究所示，线虫在进入活跃状态前会表现出持续的向前运动32。线虫大部分时间在琼脂块中心区域觅食细菌。在进入活跃状态之前，线虫会离开食物区域，此时恰好出现频率较低的HSN神经元Ca2+瞬时活动。随后，HSN活动转变为簇状放电，产生多个时间上紧密相连的Ca2+瞬时信号，从而维持产卵事件的发生。之后，线虫常会调转方向，恢复向前运动，并在返回至起始位置（靠近OP50细菌处）的过程中产卵。我们推测，局部O2和/或CO2浓度的变化可能影响了线虫选择产卵的位置33,34。
<img alt="用于生物学实验的NGM平板上OP50蠕虫静态平衡示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56911/56911fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1. C. elegans用于高分辨率成像卵产电路活动与行为的固定技术。 上图：最终固定样本的侧面图；下图：透过大盖玻片底部观察到的最终固定样本。箭头指示夹在NGM琼脂块与24 mm × 60 mm大盖玻片之间的OP50细菌食物、C. elegans线虫及其卵。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56911/56911fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="荧光显微镜示意图；GFP、mCherry成像；Ca²⁺、细胞位置测量；线虫行为。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56911/56911fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2．在倒置落射荧光显微镜上进行宽场比率法Ca2+成像及行为记录。（A）通过卤素灯发射的红外光（750–790 nm，紫色箭头），经NGM培养基块照射，使用20倍（0.8 NA）平场复消色差物镜在明场下捕捉线虫的位置与行为。通过操纵杆与电动载物台控制器，在记录过程中保持线虫处于视野中央。载物台位置（Δx, Δy）通过串口发送至计算机。线虫中表达的GCaMP5和mCherry蛋白分别由470 nm（蓝色箭头）和590 nm（黄色箭头）发光二极管（LED）激发。发射出的GCaMP5（绿色箭头）和mCherry（橙色箭头）荧光以及红外光共同穿过一个多波段二向色镜（见材料表）。一个80/20分光镜将20%的光引导通过0.63倍缩小透镜，由对红外光敏感的CMOS相机捕获（紫色箭头）。剩余80%的光则经显微镜侧端口进入图像分光器，将GCaMP5和mCherry荧光分至sCMOS相机的两个半区，同时滤除红外明场光。两台相机的数据均通过USB3线缆传输至计算机。荧光sCMOS相机的触发端口（蓝色）输出+5V TTL信号，分别触发LED照明系统、红外明场CMOS相机以及数据采集设备（DAQ）。（B）DAQ设备在数字引脚#8处检测到来自荧光sCMOS相机的触发信号3输出的TTL信号，并通过USB连接将信号传至计算机。这些数字输入信号触发Bonsai软件脚本（XY-stage-final）发出“获取XY”串行指令，读取每次采集的GCaMP5/mCherry荧光/红外图像对应的X和Y载物台位置。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56911/56911fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="数据处理流程图；串行数据输入/输出、Python解析、压缩、CSV输出。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56911/56911fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：Bonsai串行阶段通信脚本XY-stage-final的布局。顶部的DigitalInput节点（粉色）读取进入DAQ第8引脚的TTL触发信号。每当检测到一个正向TTL电压（绿色）时，DAQ会生成一个时间戳（蓝色），并通过串口（灰色）向载物台控制器发送一个“Where XY?”字符串（粉色）。SerialStringRead节点（粉色）读取来自载物台控制器的X和Y坐标响应。该字符串随后被转换为微米单位，并拆分为X和Y两个坐标值。最后，通过一个zip节点（蓝色）将这四个数据流合并，并生成一个四列的.csv文件：记录接收到的TTL信号的帧计数（Range节点，粉色）、X坐标、Y坐标，以及连续时间点之间的时间间隔（在20 Hz采样频率下通常约为50 ms）。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56911/56911fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="中体荧光显微镜，GCaMP5 和 mCherry，双通道，明场秀丽隐杆线虫。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56911/56911fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4：产卵行为期间HSN荧光及全动物明场的代表性显微图像。 (A-D) 卵子释放前 HSN 中 GCaMP5 与 mCherry 荧光的同步比率成像。箭头指示 HSN 的轴突终末。CGCaMP5 与 mCherry 荧光的合并。D) GCaMP5:mCherry 强度调制比值；高比值（红色）表示细胞内 Ca²⁺ 浓度高2+ 在突触前末梢。 (E卵子产出后线虫的整体明场图像。箭头指示产卵的阴门前半部和后半部。所有图像的比例尺为 50 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56911/56911fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="使用GCaMP5:mCherry比率进行Ca²⁺成像分析；图表记录线虫运动速度与产卵事件。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56911/56911fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图5"> 
图5HSN 钙成像记录2+ 产卵行为期间的运动速度。 (A) GCaMP5:mCherry 比值在细胞内 Ca²⁺ 刺激下的变化轨迹2+ 瞬时虫体速度（ΔR/R；红色）以及瞬时蠕虫速度（µm/s；蓝色）。产卵事件用箭头指示。B) HSN神经元GCaMP5荧光（绿色；ΔF/F）、mCherry荧光（红色；ΔF/F）、GCaMP5:mCherry荧光比值（黑色；ΔR/R）及线虫运动速度（蓝色）在排卵时刻前后的变化轨迹。C在整个10分钟记录期间产卵与运动行为的空间分布。线虫轨迹由XY载物台信息获得，并结合来自mCherry荧光记录所获取的HSN细胞质心位置。HSN瞬时活动（红圈）、产卵事件（黑箭头）以及记录的开始和结束时间（绿色和蓝色菱形）均已标出。比例尺为1 mm。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56911/56911fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

本方案描述了使用基因编码的Ca2+探针记录自由活动的Caenorhabditis elegans线虫神经活动变化的方法。

在活动动物中，神经环路的活动模式与麻醉或固定动物中的活动模式存在显著差异，这一点已变得日益明确。高灵敏度的基因编码Ca2+荧光探针的出现，通过非侵入性光学方法彻底改变了在活动动物中记录细胞和突触活动的方式。当这些探针与遗传学和光遗传学技术相结合时，可识别在不同行为状态下调节细胞和环路活动的分子机制。本文描述了在自由活动的秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中对单个神经元进行比率式Ca2+成像的方法。我们展示了一种简单的固定技术，该技术将生长在标准线虫培养基（Nematode Growth Media, NGM）琼脂块上的线虫轻轻覆盖上盖玻片，使动物在无限制运动和行为过程中能够以高分辨率进行记录。利用该技术，我们采用灵敏的Ca2+探针GCaMP5，记录了驱动产卵行为的5-羟色胺能雌雄同体特异性神经元（Hermaphrodite Specific Neurons, HSNs）中细胞内Ca2+的变化。通过共表达对Ca2+不敏感的荧光蛋白mCherry，我们能够以约1 µm的精度追踪HSN的位置，并校正因焦距变化或运动引起的荧光波动。同时进行的红外明场成像结合电动载物台，可实现行为记录和动物追踪。通过整合这些显微技术与数据流，我们能够在数十分钟的时间尺度上，记录C. elegans产卵环路在非活跃与活跃行为状态转换过程中的Ca2+活动。

本实验的总体目标是研究雌雄同体特异性神经元（HSN）活动对秀丽隐杆线虫行为影响的比率钙成像。该方法有助于回答行为神经科学领域中的关键问题，即神经回路活动如何在动物交替处于不同行为状态时引起行为变化。该技术能够在高信噪比条件下记录细胞内钙活性的变化，同时追踪动物的行为和运动。尽管该方法可用于研究秀丽隐杆线虫（C. elegans）的神经元活动，也可应用于其他透明的模式生物系统，包括果蝇幼虫和斑马鱼。接下来由我演示实验操作，参与演示的是Collin's Labs的学生：Richard Kopcock、Pravat Dhakal和Layla Nassar。在固定动物时，首先从已接种的大肠杆菌OP50培养板上，用铂金线虫挑取针底部蘸取少量细菌食物，然后用挑取针转移约20只晚期L4幼虫（L4-X 2,000），这些线虫在HSN神经元中通过N-L3p启动子表达对钙离子敏感的荧光报告蛋白GCaMP5和钙离子不敏感的荧光蛋白mCherry，将其转移至已接种的线虫生长培养基（Nematode Growth Medium, NGM）培养板上。在体视显微镜下确认发育中的阴门结构，其表现为被白色月牙形区域包围的清晰深色斑点，并将线虫在20摄氏度条件下培养24至40小时。培养结束后，用接种环挑取少量OP50，将三条线虫转移至未接种细菌的线虫生长培养基平板上，新平板上需保留少量食物，供成像期间线虫摄食。随后，使用平坦的圆形刮铲从无菌平板上切下一枚20 × 20毫米的琼脂块，并将琼脂块（线虫面朝下）放置于一块洁净的24 × 60毫米、厚度为1.5号的盖玻片的一端边缘处。然后，小心地将琼脂块滑动至盖玻片中央，并在琼脂块上方放置一个 22 × 22 毫米的 1 号盖玻片，以减少粘连和蒸发。设置成像系统时，将线虫置于倒置显微镜的载物台上，并选择 20 倍物镜。通过双目目镜选取待成像的线虫，将红外滤光片滑入并置于聚光镜上方。打开合适的视频分析程序，运行串行阶段 XY 载物台最终通信脚本。单击 CsvWriter 并选择一个文件夹用于保存记录的 X 和 Y 载物台信息。然后，单击绿色箭头以初始化数字采集设备。在红外相机录制软件的设置中，选择“切换相机控制对话框”。然后选择“自定义视频模式”菜单，并选择模式1和像素格式Raw eight。在触发信号持续时间下，将触发输入线设置为3，极性设置为高，模式设置为14。单击“启用”以暂停帧采集，直至从荧光相机接收到电压触发信号。在图像查看窗口打开后，点击“记录”并选择用于保存图像序列的文件夹。选择缓冲记录模式，并以 JPEG 格式保存图像。然后，点击“开始录制”以初始化采集。接着，在荧光采集软件中打开“采集”选项卡，将曝光时间设置为10毫秒，Binning 设置为4×，图像深度设置为16位。选择一个居中的相机子区域，宽度为512像素，高度为256像素。程序将自动将宽幅图像分成两半，以生成独立的荧光通道。单击“显示输出触发选项”，并将所有触发设置为正向。确认触发一和触发二设置为“曝光”，触发三设置为“可编程”，周期为 25 毫秒。然后，在“序列”选项卡下，于扫描设置中选择时间推移，将“场延迟1”设置为50毫秒，以每秒20帧的频率采集图像。选择保存到临时缓冲区。进行比例钙成像时，在“序列”选项卡下，单击“开始”以开始记录，并使用操纵杆跟踪线虫，使目标细胞和突触保持在视野中央并处于聚焦状态。荧光记录开始时，会向等待中的明场相机和载物台控制器发送触发信号，从而开始同步采集图像和载物台位置信息。点击直方图窗口中的“统计”按钮，以显示每个通道的像素统计信息。调节LED光源功率，确保在红色通道中，mCherry荧光在突触前末端的最大单像素值大于或等于8,000计数，从而在背景之上提供约12位的动态范围。在静息或低钙条件下，突触前末端的钙指示剂信号在绿色通道中应约为 2,500 计数。记录行为，直至达到一次产卵活跃状态。然后，保存包含首次产卵事件前 6,000 帧和事件后 6,001 帧的 10 分钟子集。务必注意保留相同的行为学明场图像子集，否则将丢失X-Y载物台位置的时间点或数据流的精确同步。进行图像分割时，将图像序列导入合适的比率定量分析软件程序，在序列选项卡中的时间序列上右键单击，设置时间序列为每秒20帧，每像素1.25微米。在“工具”菜单下，选择“比率”，然后为通道A选择mCherry，为通道B选择GCaMP5，点击“计算”以从每个图像序列中扣除背景。选择将彩虹查找表应用于比率通道，并使用mCherry通道生成强度调制的比率通道，以将比率颜色映射到mCherry通道的亮度上。点击“比率”以生成两个通道。要创建对象识别协议，将“测量”选项卡下的“使用强度查找对象”工具拖至协议面板，点击齿轮图标设置mCherry强度值范围并查找对象。选择强度值大于或等于背景以上两个标准差的区域，确保检测到细胞体和突触前末端。如有必要，仅针对 mCherry 通道添加额外滤镜，以排除不需要的结构，例如：头部、尾部或肠道荧光。然后，打开“测量”菜单，选择“创建测量项目”，并选择所有时间点以执行图像量化分析方案。通过同步采集 GCaMP5 和 mCherry 荧光信号，生成逐像素比值通道，以校正动物运动和焦距变化带来的影响。对于每只动物，可将 HSN 突触前胞内钙离子水平的变化与明场成像中观察到的行为（包括产卵和运动状态改变）进行关联分析。事实上，可在产卵活跃状态前、期间和之后观察到蠕虫运动速度的显著差异。放大观察一次产卵事件，可以发现产卵事件发生前GCaMP5荧光信号发生了显著变化，而mCherry的荧光信号则相对保持稳定。此外，通过测量GCaMP5与mCherry的比值变化，可以清晰地显示在卵子释放前约4秒，HSN神经元出现了一次钙瞬变。产道收缩伴随明显的蠕虫运动减慢，最终以产卵结束。此外，如上所述对蠕虫进行成像与追踪，可实现对产卵行为空间组织的可视化观察，包括觅食行为、瞬时的HSM钙信号变化，以及HSN活动在运动至产卵位置前转变为簇状放电的过程。一旦掌握该技术，若操作得当，可在一到两小时内完成。在进行该操作时，重要的是要记住在成像过程中始终保持对目标细胞及其突触前末梢的聚焦。完成该操作后，还可进行其他方法，例如光遗传学激活，以进一步探究HSN对突触前刺激的反应机制。该技术为神经科学领域的研究人员探索秀丽隐杆线虫（C. elegans）产卵环路功能奠定了基础。观看本视频后，您应能充分了解如何在活跃的秀丽隐杆线虫中对HSN进行比例钙成像。

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行为动物中单个神经元的比率钙成像秀丽隐杆线虫

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