利用全面的免疫沉淀富集系统鉴定靶蛋白的内源性翻译后修饰谱

本实验方案的总体目标是使缺乏PTM研究经验的研究人员能够利用一个综合性系统，有效确定其目标蛋白是否在体内被一种或多种PTM修饰。该方法通过使用单一、简化的系统来检测关键的翻译后修饰及其潜在的相互作用，从而推动翻译后修饰领域的研究进展。该技术的主要优势在于，非PTM领域的专家也能够在他们的模型系统中检测目标蛋白是否在体内被一种或多种PTM所修饰。

我们在研究多种细胞信号通路的调控机制时首次提出了该方法的想法，当时发现现有的用户友好型试剂盒或系统实际上并不适用于非磷酸化翻译后修饰的研究。请按照文本方案中的描述，从A431细胞的制备开始本实验操作。同时，准备含有抑制剂的Blaster裂解液并用稀释缓冲液进行配制。

倒掉培养基，将细胞置于冰上。随后用 10 毫升 1× 磷酸盐缓冲液洗涤细胞两次。在加入裂解缓冲液之前，尽可能去除 PBS，以最大限度地提高细胞裂解效率。

向每个150毫米培养皿中加入600微升裂解缓冲液。缓冲液的用量取决于预期的蛋白产量。接着，使用细胞刮棒裂解细胞。

由于细胞核裂解，裂解液将变得黏稠。使用剪去一毫米的移液器吸头，将粗裂解液转移至已置于15毫升收集管中的破碎过滤器。使用提供的过滤器压柄将破碎过滤器完全压紧，收集裂解液的滤过部分（包括任何气泡）至15毫升管中。

简单高效的裂解过滤器可去除基因组DNA，而不是像其他常用方法那样将其剪切。根据预期的蛋白产量，用裂解稀释缓冲液将澄清裂解液稀释至每块150毫米培养板终体积为3毫升。

此步骤非常重要，因为最终的缓冲液组成会影响氨基酸沉淀反应的严格性。接下来，按照文本方案中的描述准备蛋白质定量检测。在600纳米处测定裂解液样品的吸光度，并计算蛋白质浓度。

将储备试剂管颠倒数次，确保磁珠在管内完全重悬。对于每个免疫沉淀实验，将磁珠悬液分装至预冷的1.5毫升微量离心管中，置于冰上。在此步骤中，向各微量离心管中分别加入20 µL泛素亲和磁珠、30 µL磷酸化酪氨酸亲和磁珠、40 µL SUMO2/3亲和磁珠，或50 µL乙酰化亲和磁珠。

轻轻颠倒含有泛素化免疫沉淀对照微珠和IgG对照微珠的储备试剂管数次，确保微珠在管内完全重悬。接下来，将对照微珠按每个对照反应分装，以确定非特异性结合。此处，将20 µL泛素化对照微珠、30 µL磷酸化酪氨酸对照微珠、40 µL SUMO2/3化对照微珠或50 µL乙酰化对照微珠分别加入预冷的1.5 mL微量离心管中，置于冰上。

保留20微升裂解液，用于进行Western印迹上样对照。向预留的裂解液中加入5微升5x上样缓冲液，在95摄氏度下煮沸5分钟。接着，将裂解液分别加入每个IP管及对照IP管中。

此处，每次免疫沉淀（IP）及对照反应均使用一毫克裂解液，共进行八次免疫沉淀反应。将反应管置于4°C的翻转旋转平台上孵育两小时。孵育结束后，在4°C条件下以3,000至5,000 × g离心一分钟，收集磁珠。

尽可能吸尽上清液，切勿扰动磁珠，然后在4°C旋转平台上用一毫升裂解洗涤缓冲液洗涤磁珠五分钟，并通过离心收集磁珠，操作同前。离心后，尽可能吸尽上清液，切勿扰动磁珠，并重复洗涤步骤两次。最后一次洗涤和离心后，吸除大部分缓冲液上清，然后使用细孔蛋白上样枪头去除残留的上清液。

允许对珠粒沉淀造成轻微扰动。为最大程度回收目标PTM蛋白，需在尽量减少对珠粒沉淀扰动的前提下，确保完全去除所有洗涤缓冲液。接下来，加入30 µL珠粒洗脱缓冲液，并通过轻轻敲击或弹击管壁的方式充分重悬珠粒。

此阶段请勿使用移液器。将重悬的磁珠在室温下孵育五分钟。剪掉转移用移液器吸头的尖端，然后轻轻将每份磁珠悬液转移至已放入1.5毫升微量离心管中的1.5毫升微量离心柱中。

将样品在室温下以9,000至10,000 ×g离心1分钟，以收集免疫沉淀样品，然后向每个样品中加入2 µL的2-巯基乙醇并充分混匀。将样品置于95 °C水浴中孵育5分钟。孵育结束后，在室温下以10,000 ×g离心1分钟收集样品。

最后，按照文本方案中所述步骤进行 SDS-PAGE、转膜和蛋白质印迹分析。将未经处理和经 EGF 处理的 A431 细胞裂解液分别加入泛素、磷酸化酪氨酸、SUMO 2/3 以及乙酰化赖氨酸亲和微珠中。使用 PD-L1 抗体进行蛋白质印迹分析，以确定 PD-L1 蛋白在 EGF 刺激下是否受到这四种翻译后修饰的修饰作用。

此处展示的代表性结果表明，该方法能够有效鉴定 PD-L1 的内源性翻译后修饰。一旦掌握，若操作得当，可在四到四个半小时内完成该技术。观看本视频后，您应能充分理解如何利用这一全面的翻译后修饰检测系统，检测目标蛋白或信号通路中的内源性翻译后修饰或修饰间串扰。