Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

该实验方案的总体目标是使没有经验的 PTM 研究人员能够使用单个综合系统有效地确定其靶蛋白是否被一个或多个 PTM 内源性修饰。该方法将使用单一、简化的系统检测任何靶蛋白的关键 PTM 和潜在串扰，从而加强对翻译后修饰领域的研究。该技术的主要优点是非 PTM 专家可以检测蛋白质是否由其模型系统中的一个或多个 PTM 内源性修饰。

我们在研究几种细胞信号转导通路的调节机制时首次有了这种方法的想法，并发现我们的用户友好型试剂盒或系统实际上并不可用于研究非磷酸化 PTM。从制备 A431 细胞开始此过程，如文本方案中所述。此外，在含有抑制剂的稀释缓冲液中制备 blaster 裂解液。

倒出培养基，将细胞置于冰上。然后用 10 毫升 1x 磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞两次。在添加 blaster 裂解缓冲液之前，尽可能多地去除 PBS，以最大限度地减少细胞裂解。

向每个 150 毫米板中加入 600 μL Blaster 裂解缓冲液。缓冲液的量基于预期的蛋白质产量。接下来，使用细胞刮刀裂解细胞。

裂解物会因细胞核裂解而变得粘稠。使用剪下的 1 毫米移液器吸头将粗裂解物转移到已放入 15 毫升收集管中的喷砂过滤器中。使用随附的过滤器柱塞完全压缩 blaster 过滤器，并将裂解物流出物（包括任何气泡）收集在 15 mL 试管中。

简单、高效的 blaster 过滤器可去除基因组 DNA，而不是像其他常用方法那样剪切它。用 blaster 稀释缓冲液将澄清的裂解物稀释至每 150 毫米板的最终体积为 3 mL。最终体积基于预期的蛋白质产量。

此步骤很重要，因为最终的缓冲液组成会影响氨基沉淀反应的严格性。接下来，按照文本方案中的说明准备蛋白质定量测定。测量裂解物样品在 600 纳米处的吸光度，并计算蛋白质浓度。

将储备试剂管倒置数次，以确保磁珠完全重悬于试管中。对于每次 IP 检测，将微珠悬浮液分装到单独的 1.5 mL、冰上微量离心管中。在这里，将 20 微升泛素亲和珠、30 微升磷酸酪氨酸亲和珠、40 微升 SUMOylation 2/3 亲和珠或 50 微升乙酰化亲和珠添加到各个微量离心管中。

将含有泛素化 IP 对照珠和 IGG 对照珠的储备试剂管倒置数次，以确保珠子完全重悬于管中。接下来，将每个对照反应的对照微珠分装以确定非特异性结合。在这里，将 20 微升泛素对照珠、30 微升磷酸酪氨酸对照珠、40 微升 SUMOylation 2/3 对照珠或 50 微升乙酰化对照珠添加到冰上的单个 1.5 毫升微量离心管中。

节省 20 μL 裂解物，作为 western blot input裂解物对照运行。向预留的裂解物中加入 5 微升 5x 样品缓冲液，并在 95 摄氏度下煮沸 5 分钟。接下来，向每个 IP 管和对照 IP 管中加入裂解物。

在这里，每个 IP 和对照反应使用 1 毫克裂解物，总共产生 8 个 IP 反应。将试管放在 4 摄氏度的旋转平台上孵育 2 小时。孵育后，在 4 摄氏度下以 3 至 5， 000 倍 G 离心 1 分钟，收集珠子。

在不干扰磁珠的情况下吸出尽可能多的上清液，然后在 4 摄氏度的旋转平台上用 1 毫升 blaster 洗涤缓冲液洗涤磁珠 5 分钟，并像以前一样通过离心收集磁珠。离心后，在不干扰磁珠的情况下吸出尽可能多的上清液，然后再重复洗涤步骤两次。最终洗涤和离心后，吸出缓冲液上清液中的大多数，然后使用细孔蛋白质上样吸头去除残留的上清液。

微珠沉淀的最小破坏是可以接受的。确保去除所有洗涤缓冲液，同时最大限度地减少对拍打沉淀的干扰，以最大限度地提高 PTM 蛋白的回收率。接下来，加入 30 μL 磁珠洗脱缓冲液，并通过轻轻敲击或轻弹试管侧面来重悬磁珠。

在此阶段不要使用移液器。将重悬的微珠在室温下孵育 5 分钟。剪掉移液管吸头的末端，轻轻地将每个微珠悬浮液转移到 1.5 mL 微量离心柱中，该离心柱已放入 1.5 mL微量离心管中。

在室温下以 9 至 10， 000 倍 G 离心样品，从 1 分钟开始收集 IP 样品，然后向每个样品中加入 2 微升 2-巯基乙醇并充分混合。将样品置于 95 摄氏度的水浴中 5 分钟。孵育后，在室温下以 10， 000 x G 离心 1 分钟来收集样品。

最后，按照文本方案中的说明继续运行 SDS PAGE、转移和蛋白质印迹分析。将未经处理和 EGF 处理的 A431 细胞裂解物添加到泛素、磷酸酪氨酸、SUMO 2/3 和乙酰赖氨酸亲和珠中。PD-L1 抗体用于蛋白质免疫印迹分析，以确定 PD-L1 蛋白是否响应 EGF 刺激而被这四种 PTM 修饰。

此处显示的代表性结果表明，该方法有效识别 PD-L1 的内源性 PTM 修饰。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在 4 到 4 1/2 小时内完成。观看本视频后，您应该对如何使用这款全面的 PTM 检测系统检测靶蛋白或信号通路的内源性 PTM 或串扰有很好的了解。