Name: 利用综合沉淀富集系统识别目标蛋白的内源性后向转化剖面 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: 学习使用综合沉淀富集系统检测目标蛋白的内源性翻译后修饰，包括乙酰化、泛素化、SUMO化2/3和酪氨酸磷酸化。该方法采用A431细胞模型，为非PTM专家提供简化的蛋白质修饰分析流程。

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我们感谢Cytoskeleton公司研究科学家以及Brian Hoover博士和Ashley Davis博士对本文稿提出的宝贵审阅意见、编辑建议和富有成效的讨论。此外，我们感谢Robert Hom博士在视频文稿制作过程中所做出的贡献。本研究工作得到了Cytoskeleton公司的资金支持。

1. 样品制备：细胞培养
<ol>
	<li>在添加了10%胎牛血清的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中培养四块150 mm的A431细胞培养板。
	<ol>
		<li>将A431细胞培养至50%汇合度。</li>
		<li>使用无血清DMEM对四块A431细胞培养板进行血清饥饿处理24小时。</li>
		<li>用33.3 mg/mL表皮生长因子处理其中两块A431细胞培养板1小时，另外两块不作处理。 
		注意：此处所示的细胞生长和处理条件仅为示例；然而，该方法适用于多种不同类型的细胞和处理条件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制含抑制剂的blastR裂解缓冲液和稀释缓冲液（表1）。将2.895 mL blastR裂解缓冲液与15 µL酪氨酸磷酸酶抑制剂、30 µL去泛素化酶和去SUMO化酶抑制剂、30 µL组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂以及30 µL蛋白酶抑制剂混合液混合。
	<ol>
		<li>将9.65 mL blastR稀释缓冲液与50 µL酪氨酸磷酸酶抑制剂、100 µL去泛素化酶和去SUMO化酶抑制剂、100 µL组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂以及100 µL蛋白酶抑制剂混合液混合。 
		注意：缓冲液成分和抑制剂信息详见材料表。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>倒掉培养基，将细胞置于冰上，然后用10 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞两次。
	<ol>
		<li>在加入blastR裂解缓冲液前，尽可能去除PBS，以最大化细胞裂解效率。 
		注意：缓冲液成分详见材料表。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>每块150 mm培养板加入600 µL blastR裂解缓冲液。缓冲液体积根据预期蛋白产量确定（表2）。
	<ol>
		<li>使用细胞刮刀裂解细胞。由于细胞核裂解，裂解液将变得黏稠。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用剪去尖端的1 mL移液器吸头，将粗裂解液转移至已置于15 mL收集管中的blastR滤器中（图1）。此处使用15 mL离心管。</li>
	<li>使用配套的滤器推杆完全压紧blastR滤器，将裂解液滤过液（包括任何气泡）收集至15 mL离心管中（图1）。</li>
	<li>可选：将澄清后的裂解液转移至1.5 mL微量离心管中，在4 °C下以约10,000 × g离心1分钟。
	<ol>
		<li>将上清液转移至新的15 mL离心管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用blastR稀释缓冲液将澄清裂解液稀释至每块150 mm培养板终体积为3 mL。终体积根据预期蛋白产量确定（表2）。 
	注意：此步骤至关重要，因为最终缓冲液组成将影响免疫沉淀反应的严谨性。</li>
	<li>测定蛋白浓度（第2节）。</li>
</ol>
2. 蛋白质定量分析
注意：采用标准的比色法蛋白质定量检测来确定蛋白质浓度。此处使用 Precision Red Advanced Protein Assay 进行蛋白质定量。
<ol>
	<li>向两个1 mL比色皿中各加入1 mL的Precision Red高级蛋白质检测试剂。</li>
	<li>在冰上，将10 µL blastR裂解缓冲液与40 µL blastR稀释缓冲液混合于一个洁净的1.5 mL微量离心管中。 
	注意：此混合液用于测定空白蛋白质样品。</li>
	<li>向第一个比色皿中加入20 µL裂解/稀释缓冲液混合液（来自步骤2.2），通过倒置混匀2至3次。</li>
	<li>向第二个比色皿中加入20 µL稀释后的细胞裂解液（来自实验），混匀方式同上。</li>
	<li>将样品在室温下孵育1分钟。</li>
	<li>使用裂解/稀释缓冲液混合样品（来自步骤2.3）作为空白对照，校准分光光度计。</li>
	<li>在600 nm处测定裂解液样品（来自步骤2.4）的吸光度。</li>
	<li>按下述方法确定裂解液蛋白质浓度； 
	样品OD600读数 × 5 = 蛋白质浓度（mg/mL） 
	注意：OD读数低于0.05或高于0.5时，接近蛋白质检测的线性范围极限。对于读数&#62;0.5的样品，可进行稀释；对于读数&#60;0.05的样品，可向Precision Red高级蛋白质检测试剂中加入更多裂解液（最多50 µL）。参见表3中将分光光度计读数转换为mg/mL裂解液蛋白质浓度的换算系数。若单个培养板中蛋白含量不足，建议每个免疫沉淀实验使用2个或更多培养板。在此情况下，将依次收获各板，将最初的300 µL裂解缓冲液在各板之间转移。</li>
	<li>根据蛋白质浓度，使用缓冲液混合液（1份blastR裂解缓冲液 : 4份blastR稀释缓冲液）将样品稀释至目标终浓度（通常为1 mg/mL）。</li>
	<li>将不立即使用的样品分装后迅速冷冻。
	<ol>
		<li>将样品储存于-70 °C。</li>
		<li>进入第3节继续操作。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 免疫沉淀（IP）实验
注意：亲和 beads 的浓度、裂解液浓度和孵育时间仅为推荐的参考值，可能因每种目标蛋白及特定的翻译后修饰（PTM）而异。
<ol>
	<li>反复倒置含有泛素亲和磁珠、磷酸化酪氨酸亲和磁珠、SUMO 2/3 亲和磁珠以及乙酰化亲和磁珠的试剂管，确保磁珠在管内完全重悬。</li>
	<li>根据每次免疫沉淀（IP）实验，将磁珠悬液分装至预冷的 1.5 mL 微量离心管（IP 管）中。在此步骤中，分别向各 1.5 mL 微量离心管中加入 20 µL 泛素亲和磁珠、30 µL 磷酸化酪氨酸亲和磁珠、40 µL SUMO化 2/3 亲和磁珠或 50 µL 乙酰化亲和磁珠。 
	注意：每种亲和磁珠推荐使用的磁珠悬液体积请参见表 4。</li>
	<li>反复倒置含有泛素化 IP 对照磁珠和 IgG 对照磁珠的试剂管，确保磁珠在管内完全重悬。</li>
	<li>将对照磁珠按每个对照反应所需量分装至单独的 1.5 mL 微量离心管（对照 IP 管）中，用于检测非特异性结合。在此步骤中，分别向各 1.5 mL 微量离心管中加入 20 µL Ub 对照磁珠、30 µL pY 对照磁珠、40 µL SUMO 2/3 对照磁珠或 50 µL Ac 对照磁珠。 
	注意：每种亲和磁珠推荐使用的磁珠悬液体积请参见表 4。</li>
	<li>保留少量裂解液（20 µL）作为 Western 印迹上样对照。加入 5 µL 5× 上样缓冲液，并在 95 °C 下煮沸 5 分钟。 
	注意：缓冲液成分请参见材料表。</li>
	<li>将裂解液分别加入各 IP 管和对照 IP 管中。本实验中，每次 IP 反应和对照反应使用 1 mg 裂解液，共进行 8 次 IP 反应。 
	注意：建议每次检测使用 1.0 mg 裂解液作为起始量。所需裂解液的量取决于目标修饰蛋白的丰度。</li>
	<li>将各管置于 4 °C 下，使用翻转式旋转仪孵育 2 小时。本实验使用 ATR 管式旋转仪，转速设为 22。</li>
	<li>在 4 °C 下以 3,000 - 5,000 ×g 离心 1 分钟，使磁珠沉淀。</li>
	<li>尽可能吸除上清液，避免扰动磁珠沉淀。</li>
	<li>在 4 °C 下，用 1 mL blastR 洗涤缓冲液在旋转平台上洗涤磁珠 5 分钟（此阶段无需添加抑制剂）。</li>
	<li>在 4 °C 下以 3,000 - 5,000 ×g 离心 1 分钟，收集磁珠。</li>
	<li>尽可能吸除上清液，避免扰动磁珠沉淀。</li>
	<li>重复洗涤步骤（步骤 3.10 - 3.12）两次。</li>
	<li>最后一次洗涤后，彻底去除缓冲液上清。允许对磁珠沉淀造成轻微扰动（损失不超过 5%）。使用细孔蛋白加样枪头去除残留上清。</li>
	<li>加入 30 µL 磁珠洗脱缓冲液，并通过轻弹或轻敲管壁使磁珠重悬。此阶段切勿使用移液器吹打。 
	注意：缓冲液成分请参见材料表。</li>
	<li>室温孵育 5 分钟。</li>
	<li>将各管中的磁珠悬液轻柔转移至已置于 1.5 mL 微量离心管中的 1.5 mL 微量离心过滤柱中。 
	注意：建议剪去移液枪头末端，以便更温和地转移样品。</li>
	<li>在室温下以 9,000 - 10,000 ×g 离心 1 分钟，收集 IP 样品。</li>
	<li>向每个样品中加入 2 µL 2-巯基乙醇，并充分混匀。 
	注意：可将过滤柱盖剪下，用于封闭收集管，便于后续操作。</li>
	<li>将样品置于 95 °C 水浴中 5 分钟。随后在室温下以 10,000 ×g 离心 1 分钟收集样品。</li>
	<li>如有需要，可将样品储存于 -70 °C 并在此暂停实验，或继续进行 SDS-PAGE 电泳、转膜及 Western 印迹分析（第 4 节）。</li>
</ol>
4. 蛋白质印迹分析：目的蛋白的鉴定
<ol>
	<li>根据标准实验室方案，采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离样品，并将蛋白转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜32。</li>
	<li>使用一抗检测目标蛋白的翻译后修饰形式。此处使用 PD-L1 抗体检测翻译后修饰的 PD-L1。</li>
	<li>使用超敏化学发光检测试剂进行检测。 
	注意：化学发光试剂需与可识别一抗的 HRP 标记二抗配合使用。</li>
	<li>每张小型凝胶尺寸的转膜（约 8 × 7 cm）使用 2 mL 化学发光试剂。
	<ol>
		<li>与合适的二抗孵育（建议室温孵育 60 分钟）后，用 30 mL 含吐温-20 的三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水（TBST）洗涤印迹膜，每次 10 分钟，共洗 6 次。 
		注意：缓冲液成分见材料表。</li>
		<li>使用前立即取化学发光试剂 A 和试剂 B 各 1 mL 混匀（足够用于一张 8 cm × 7 cm 的膜）。</li>
		<li>将化学发光试剂加入膜上，室温轻摇孵育 1–5 分钟，随后通过 X 射线胶片或电荷耦合器件（CCD）相机成像检测蛋白信号。 
		注意：对于丰度较高的蛋白，可能需要缩短在化学发光试剂中的孵育时间。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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H.H. 和 A.L. 是 Cytoskeleton Inc. 的员工。K.M. 是 Cytoskeleton Inc. 的创始人。

确定目标蛋白是否发生翻译后修饰的初步方法可采用目标蛋白特异性抗体进行免疫沉淀，随后使用翻译后修饰特异性抗体进行蛋白质印迹检测例如，抗乙酰化赖氨酸），或使用PTM抗体进行免疫沉淀，随后用靶蛋白特异性抗体进行蛋白质印迹检测30,31,33虽然这两种方法在理论上均可行，但使用靶蛋白特异性抗体存在更多潜在缺陷，例如该抗体可能不适合用于免疫沉淀（IP），或者较大的翻译后修饰（PTM）可能遮蔽靶蛋白上的抗体识别位点。34,35PTM 亲和 beads 的优势在于抗体或结合结构域可特异性识别目标 PTM；因此，靶蛋白的修饰不应影响亲和 beads 对其识别。例如，利用本文所述技术鉴定出 PD-L1 的泛素化修饰，并检测到内源性的单泛素化和多泛素化形式（图4）。Lim最近发表的一篇论文 等已使用 体外 Ub 技术用于研究 PD-L1 的泛素化，结果与图中所示结果非常相似 图436有趣的是，他们还使用 PD-L1 抗体进行了免疫沉淀，以从细胞裂解液中富集 PD-L1，其中 Ub 过表达并添加了 MG-132 以增强信号。然而，Ub 条带较弱，且与预期结果明显不同 体外 泛素化模式。在Lim的细胞培养模型中，未对内源性PD-L1的泛素化进行研究。 等报告以阐明其细胞培养与其他方法之间的差异 体外 数据
由于蛋白质翻译后修饰（PTM）丰度较低且具有瞬时性，检测某种蛋白质是否发生PTM修饰具有挑战性37,38，通常需要通过免疫沉淀（IP）进行富集。有效的PTM免疫沉淀需要对多个关键步骤和试剂进行优化，例如裂解缓冲液和亲和试剂。在研究目标蛋白的多种PTM修饰时，所需的优化工作可能进一步增加。在本实验方案中，使用blastR裂解系统是关键步骤，该系统在保持强大免疫沉淀能力的同时，能够在同一系统中实现对磷酸化酪氨酸（pY）、SUMO 2/3、泛素（Ub）和乙酰化（Ac）这四种PTM的检测。该技术优化了确定特定目标蛋白是否受到这四种PTM修饰所需的时间和资源，并且相较于使用多种裂解系统分别进行PTM检测，可能更有利于揭示不同PTM之间的相互作用。已有研究对blastR裂解系统与糖基化等其他PTM的兼容性进行了探索；然而，该系统尚未针对所有类型的PTM进行全面验证。
大量的基因组DNA可能会干扰使用比色法或Nanodrop方法进行的蛋白质定量，影响蛋白质在SDS丙烯酰胺凝胶中的迁移，并在免疫沉淀（IP）实验中阻碍蛋白质与亲和基质的结合。本方案中所描述的方法利用一种特制滤器，可有效去除基因组DNA污染，这是本实验流程中的另一个关键步骤。为强调这一点，我们在blastR滤器处理前后进行了黏度测试，结果显示样品黏度由高黏度降低至与水相当的水平（数据未显示）。这一黏度变化得到了以下结果的支持： 图3，表明几乎所有的基因组DNA均已被去除。重要的是，该方法不会剪切DNA，因为任何已剪切的DNA片段均无法被滤膜捕获（数据未显示）。该工具优于传统的剪切方法（如超声处理或注射器剪切DNA），因为它无需特殊设备、具有高度可重复性，并且是去除DNA而非将其剪切。此外，该方法不会降解裂解液中的蛋白质，而传统方法可能会导致蛋白质降解29. 使用该滤器每个样本需要5至30秒，而其他方法中有效降解DNA可能需要数分钟即，注射器剪切）可能导致样品不均一，因为DNA污染物仍会残留在裂解液中。对blastR过滤前后的裂解液进行了全面分析，通过考马斯亮蓝染色、靶蛋白特异性Western blot以及总蛋白和靶蛋白特异性PTM分析均未观察到蛋白谱的明显差异；因此，过滤去除基因组DNA可能并未影响蛋白谱的完整性。最终，该过滤系统适用于任何存在基因组DNA并可能影响蛋白分析结果解读的Western blot或免疫沉淀（IP）应用。
需要注意的是，使用该技术可能存在假阴性检测结果的风险，部分原因可能包括亲和磁珠饱和、结合位点干扰或翻译后修饰（PTM）被掩盖。例如，某种特定靶蛋白可能仅在极低水平上发生乙酰化修饰（Ac），因此当广谱乙酰化赖氨酸亲和磁珠被更大量乙酰化修饰的靶蛋白饱和后，该低丰度靶蛋白可能无法被有效富集。目前正在进行的研究旨在评估本实验方案所用亲和试剂的检测灵敏度，但最近一项发表的研究表明其检测限非常灵敏。数据显示，该技术每细胞可检测到少至17个乙酰化靶蛋白分子31。然而，某些特定情况，如细胞类型的特异性、在特定刺激下瞬时发生的翻译后修饰，或由于蛋白质相互作用导致的翻译后修饰被掩盖，均可能导致假阴性结果。这些问题不仅是该技术的潜在局限，也普遍存在于大多数翻译后修饰免疫沉淀（IP）方法中。因此，建议通过多种方法验证实验结果。
研究表明，糖基化和磷酸化等修饰会竞争相同的氨基酸位点39,40，而泛素化和磷酸化等其他翻译后修饰（PTM）则被发现可依次发挥作用，共同调控蛋白质功能17,41。近期针对神经病理蛋白Tau的研究突显了PTM之间相互作用的重要性，其中Tau蛋白的过度磷酸化与SUMO化修饰可相互增强42。此外，该研究团队发现Tau的SUMO化修饰可抑制其多泛素化修饰及后续降解过程，可能导致Tau蛋白聚集。这只是PTM间调控性相互作用的众多实例之一，而本技术的应用将有助于阐明PTM及其相互作用在健康与疾病状态下对关键蛋白质调控的重要意义。

翻译后修饰（PTMs）是对蛋白质进行的高度调控的改变，这些修饰以特定方式被添加或去除。PTMs 通常是动态且短暂的变化，能够显著改变蛋白质的结构、与伴侣蛋白的相互作用以及空间定位，最终使蛋白质执行不同的功能1,2,3,4。PTMs 数量极为丰富，可使独特蛋白质形式（或称蛋白质异构体）的数量从约 30,000 个基因产物增加至超过一百万个蛋白质异构体5,6。鉴定 PTMs 并明确其对靶蛋白的影响，对于理解蛋白质的生理与病理功能至关重要7,8,9,10,11,12,13,14。针对微管蛋白、p53 和表皮生长因子受体（EGFR）等特定蛋白质的研究已阐明了 PTMs 的调控作用15,16,17。这些研究揭示了一个事实：这些蛋白质的调控由多种 PTMs 共同介导，在许多情况下，这些修饰协同作用以促进特定功能的实现。新近研究显示，在多种不同蛋白质上均可发生协同性或抑制性的 PTM 串扰18,19,20,21,22,23,24,25。然而，大多数蛋白质的 PTM 图谱来源于使用不同模型和独特条件的多项研究。若能建立一个经过优化的系统，用于在同一系统中研究多种 PTMs，将极大有助于深入理解靶蛋白潜在的 PTM 串扰机制。
在单一系统中研究翻译后修饰（PTMs）的一个挑战在于，不同的特定PTM需要使用不同的裂解缓冲液进行研究。例如，常用于磷酸化或泛素化研究的RIPA或NP-40等缓冲液，在研究诸如小泛素样修饰物（SUMO）化这类不稳定的PTM时可能并不充分26。此外，非变性缓冲液无法有效解离蛋白质相互作用，可能导致PTM的假阳性鉴定27。相比之下，使用变性裂解缓冲液研究PTM可能是更优选择，因为它能更有效地从所有细胞区室中分离蛋白质28，可解离大多数蛋白质间的相互作用，并能抑制改变PTM状态的蛋白酶（如去SUMO化酶）26；然而，变性缓冲液可能会影响某些亲和试剂的完整性，例如基于泛素结合结构域的工具27。因此，开发一种类似变性条件的裂解系统，以在兼容亲和试剂的体系中同时研究蛋白质的多种PTM，将对PTM之间的串扰研究具有重要意义。
尽管在研究翻译后修饰（PTMs）时，变性缓冲液相较于非变性缓冲液具有关键优势，但由于其显著的缺点而较少被使用，例如与常规蛋白质检测方法不兼容、基因组脱氧核糖核酸（DNA）污染严重，以及会破坏免疫沉淀（IP）试剂29。这些缺点可能导致样品制备时间延长，并在剪切基因组DNA时对目标蛋白质造成潜在损伤。目前常用的两种剪切DNA方法包括注射器裂解和超声处理29。这两种方法均需要大量优化，且通常缺乏精确的可重复性。去除基因组DNA的替代方法包括添加DNase酶；然而，这可能需要额外的优化以及缓冲液成分的调整。因此，在使用变性裂解缓冲液进行PTM研究时，若能采用一种简单且可重复的去除基因组DNA污染的方法，将具有重要优势。
该技术的目标是建立一个系统，用于在单一系统中分离和研究泛素化（Ub）、酪氨酸磷酸化（pY）、SUMO化2/3（SUMO 2/3）以及乙酰化（Ac）这四种翻译后修饰（PTM），以更深入地探究目标蛋白的PTM相互作用。该PTM检测系统已被用于在单一系统中快速分析多个目标蛋白的内源性PTM谱，并发现了有关潜在PTM串扰的新见解30,31。总体而言，本文所述技术在以下三个方面改进了现有的PTM及PTM串扰研究方法：1）开发了一种独特的变性缓冲液，可从所有细胞区室中分离蛋白，同时仍与PTM亲和试剂兼容；2）开发了一种独特的滤膜系统，能够以高重复性快速去除变性裂解液中的基因组DNA污染，且无需特殊设备；3）所使用的高稳定性亲和微珠、裂解系统和抑制剂试剂相互兼容，从而简化了目标蛋白这四种PTM的分离流程，实现PTM富集的最大化，并高效检测潜在的修饰间串扰。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;细胞裂解/基因组DNA去除与分析&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x 磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>常用缓冲液</td><td></td><td>配方：NaCl、KCl、Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;、KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>BlastR 裂解缓冲液</td><td>Cytoskeleton 公司</td><td>BLST01</td><td>专有混合物，含去垢剂、盐类及其他缓冲液添加剂</td></tr><tr><td>放射免疫沉淀分析缓冲液（RIPA）</td><td>常用缓冲液</td><td></td><td>配方：Tris-HCl、NaCl、SDS、脱氧胆酸钠、Igepal</td></tr><tr><td>哺乳动物蛋白提取试剂（mPER）</td><td>Thermofisher</td><td>78503</td><td>专有混合物，含去垢剂、盐类及其他缓冲液添加剂</td></tr><tr><td>免疫沉淀（IP）裂解液</td><td>Pierce</td><td>87787</td><td>专有混合物，含去垢剂、盐类及其他缓冲液添加剂</td></tr><tr><td>1% 十二烷基硫酸钠（SDS）变性缓冲液</td><td>常用缓冲液</td><td></td><td>配方：PBS、SDS、EDTA、EGTA</td></tr><tr><td>Laemmli 缓冲液</td><td>常用缓冲液</td><td></td><td>配方：Tris-HCl、SDS、甘油、溴酚蓝</td></tr><tr><td>BlastR 稀释缓冲液</td><td>Cytoskeleton 公司</td><td>BDB01</td><td>专有混合物，含去垢剂、盐类及其他缓冲液添加剂</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Cytoskeleton 公司</td><td>PIC02</td><td></td></tr><tr><td>N-乙基马来酰亚胺（NEM）&amp;amp; N,N,N&amp;prime;,N&amp;prime;-四(2-吡啶基甲基)乙二胺（TPEN）</td><td>Cytoskeleton 公司</td><td>NEM09BB</td><td></td></tr><tr><td>曲古抑菌素A（TSA）&amp;amp; 烟酰胺</td><td>Cytoskeleton 公司</td><td>TSA01</td><td></td></tr><tr><td>活化正钒酸钠（Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;VO&lt;sub&gt;4)&lt;/sub&gt;</td><td>Cytoskeleton 公司</td><td>PYI01</td><td></td></tr><tr><td>细胞刮刀</td><td>Costar</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>BlastR 滤膜</td><td>Cytoskeleton 公司</td><td>BLR02</td><td></td></tr><tr><td>BD 胰岛素注射器针头</td><td>BD</td><td>08290-3284-11</td><td></td></tr><tr><td>超声破碎仪（Branson Sonifier）</td><td>Branson</td><td>Sonifier 450</td><td></td></tr><tr><td>Precision Red 高级蛋白检测试剂</td><td>Cytoskeleton 公司</td><td>ADV02</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 比色皿</td><td>Fisher</td><td>14955127</td><td></td></tr><tr><td>分光光度计（Genesys20）</td><td>Thermofisher</td><td>4001</td><td>其他分光光度计也可用于测定蛋白浓度</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Fisher</td><td>BP1356-500</td><td></td></tr><tr><td>1kb 脱氧核糖核酸（DNA）ladder</td><td>NEB</td><td>N3232L</td><td></td></tr><tr><td>DNA 凝胶电泳槽</td><td>Thermofisher</td><td>7312 B1A</td><td></td></tr><tr><td>Tris/硼酸/EDTA（TBE）缓冲液</td><td>常用缓冲液</td><td></td><td>配方：Tris-HCl、硼酸、EDTA</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;PTM 免疫沉淀&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸化酪氨酸磁珠</td><td>Cytoskeleton 公司</td><td>APY03-beads</td><td></td></tr><tr><td>泛素化磁珠</td><td>Cytoskeleton 公司</td><td>UBA01-beads</td><td></td></tr><tr><td>SUMO化 2/3 磁珠</td><td>Cytoskeleton 公司</td><td>ASM24-beads</td><td></td></tr><tr><td>乙酰化磁珠</td><td>Cytoskeleton 公司</td><td>AAC04-beads</td><td></td></tr><tr><td>磷酸化酪氨酸对照磁珠</td><td>Cytoskeleton 公司</td><td>CIG01-beads</td><td></td></tr><tr><td>泛素化对照磁珠</td><td>Cytoskeleton 公司</td><td>CUB02-beads</td><td></td></tr><tr><td>SUMO化 2/3 对照磁珠</td><td>Cytoskeleton 公司</td><td>CIG01-beads</td><td></td></tr><tr><td>乙酰化对照磁珠</td><td>Cytoskeleton 公司</td><td>CIG02-beads</td><td></td></tr><tr><td>BlastR 洗涤缓冲液</td><td>Cytoskeleton 公司</td><td>BWB02</td><td>专有混合物，含去垢剂、盐类及其他缓冲液添加剂</td></tr><tr><td>磁珠洗脱缓冲液</td><td>Cytoskeleton 公司</td><td>BEB01</td><td>专有混合物，含去垢剂、盐类及其他缓冲液添加剂</td></tr><tr><td>微量离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5417</td><td>其他微量离心机也可使用&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>管式旋转混合仪</td><td>ATR</td><td>RKVSD</td><td>其他翻转式管式旋转仪也可使用&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>蛋白加样吸头</td><td>VWR</td><td>37001-150</td><td></td></tr><tr><td>离心柱</td><td>Cytoskeleton 公司</td><td>SPN22</td><td></td></tr><tr><td>95 &amp;deg;C 恒温金属浴</td><td>Benchmark</td><td>BSH1002</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;SDS-PAGE/转膜/蛋白印迹分析&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5x 上样缓冲液</td><td>常用缓冲液</td><td></td><td>配方：溴酚蓝、二硫苏糖醇（DTT）、甘油、SDS、Tris-HCl</td></tr><tr><td>Novex wedge well 4-20% Tris-甘氨酸凝胶</td><td>Invitrogen</td><td>XP04200BOX</td><td>大孔径wedge well适用于大体积样品上样</td></tr><tr><td>1x 电泳缓冲液</td><td>常用缓冲液</td><td></td><td>配方：Tris-HCl、甘氨酸、SDS</td></tr><tr><td>SeeBlue 蛋白ladder</td><td>Life Technologies</td><td>LC5625</td><td></td></tr><tr><td>电泳槽</td><td>Invitrogen</td><td>Xcell surelock 电泳槽</td><td>其他电泳槽也可使用，但此型号与Novex wedge well凝胶兼容&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>电源</td><td>Biorad</td><td>PowerPac HC</td><td>其他电源也可使用&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1x 转膜缓冲液</td><td>常用缓冲液</td><td></td><td>配方：Tris-HCl、甘氨酸、甲醇</td></tr><tr><td>转膜装置</td><td>Biorad</td><td>mini trans-blot 转膜仪</td><td>其他转膜装置也可使用&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Immobilon-P 膜（PVDF）</td><td>Millipore</td><td>IPVH 304F0</td><td></td></tr><tr><td>脱脂奶粉</td><td>Thrive</td><td>813503015095</td><td></td></tr><tr><td>含Tween的Tris缓冲盐水（TBST）</td><td>常用缓冲液</td><td></td><td>配方：Tris-HCl、NaCl、Tween 20</td></tr><tr><td>化学发光检测试剂</td><td>Cytoskeleton 公司</td><td>CLRA/CLRB</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;细胞培养与处理&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基&amp;nbsp;</td><td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>ATLAS</td><td>&amp;nbsp;F-0500-A&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>表皮生长因子</td><td>Cytoskeleton 公司</td><td>CN02-A</td><td></td></tr><tr><td>150 mm 细胞培养皿</td><td>Corning</td><td>430599</td><td></td></tr></tbody></table>

利用全面的免疫沉淀富集系统鉴定靶蛋白的内源性翻译后修饰谱

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

目前人们已充分认识到，翻译后修饰（PTM）在调控蛋白质的结构与功能中发挥着关键作用，这些修饰可能对特定蛋白质在生理及病理条件下的功能至关重要。在研究目标蛋白的PTM状态时，通常需要对PTM进行富集，因为PTM往往具有瞬时性且丰度较低。在富集目标蛋白的PTM过程中常会遇到诸多困难，例如缓冲液不兼容、目标蛋白抗体不适合免疫沉淀（IP）、PTM信号丢失等。当需要同时研究同一目标蛋白上的多种PTM（如乙酰化、泛素化、SUMO化2/3以及酪氨酸磷酸化）时，实验难度进一步加大。由于不同PTM之间存在广泛且关键的相互调控作用，因此联合研究这些PTM可能是必要的。然而，这些PTM通常需在不同的裂解缓冲液体系中，并添加各自特异的抑制剂组合来进行研究。为简化实验流程，已开发出一种独特的变性裂解体系，可有效分离并稳定保存上述四种PTM，从而能够在单一裂解体系中探究它们之间可能存在的相互作用。同时设计了一种独特的滤膜系统，用于去除裂解液中污染性的基因组DNA——这是变性缓冲液使用过程中常见的问题性副产物。此外，针对这四种PTM分别开发了高效的亲和基质，并与该缓冲体系协同优化，以最大程度地富集和检测这些PTM的内源性状态。这一整套全面的PTM检测工具显著简化了获取关键信息的过程，有助于明确某一蛋白质是否被其中一种或多种PTM所修饰。

这些工具通过有效检测上述4种PTM来研究PTM串扰的能力，在一定程度上依赖于独特的裂解缓冲液系统。blastR变性缓冲液与其他变性缓冲液类似，能够有效分离来自所有细胞区室的蛋白质，从而确保获得完整的蛋白质谱图2A）。此外，它还能保留不稳定的翻译后修饰信号，如 SUMO 2/3，这类修饰在非变性缓冲液（如放射免疫沉淀分析缓冲液，RIPA）中会迅速降解图 2B）。重要的是，在适当稀释后，它不会像其他变性缓冲液那样影响亲和试剂的完整性例如， Laemmli缓冲液
在使用变性缓冲液时，一个重要的难题是如何有效去除基因组DNA污染。传统降低黏度的方法是通过注射器针头剪切DNA或对样品进行超声处理。图3A展示了经BlastR滤器、注射器针头或超声处理后的A431细胞裂解液中基因组DNA污染的情况。使用BlastR滤器几乎可完全去除基因组DNA，而传统的注射器针头或超声处理则无法达到此效果。基因组DNA污染会显著影响蛋白质在SDS-丙烯酰胺凝胶中的迁移；然而，经BlastR滤器处理后可有效去除基因组DNA，从而实现正常的蛋白质迁移（图3B）。由基因组DNA污染引起的迁移异常会严重影响对Western印迹结果的判读；例如，未过滤裂解液中出现的EGFR弥散条带模式可能被错误地解释为相对于过滤后样品的表达量升高（图3C）。
通过使用这一优化的翻译后修饰（PTM）富集与检测系统，可快速确定目标蛋白是否被一种或多种PTM修饰。近期利用该技术对PD-L1的PTM谱进行了研究，结果表明，在EGF刺激下，PD-L1发生了泛素化、乙酰化以及酪氨酸磷酸化修饰（图4）。重要的是，这些数据报告的是内源性PD-L1的PTM变化，其仅占所鉴定的总PD-L1的一小部分。
<img alt="使用注射器过滤法进行DNA纯化的过程；戴手套操作实验步骤。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56912/56912fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：使用BlastR滤器从细胞裂解液中过滤基因组DNA。 (A) BlastR滤器的外观图。 (B) 将裂解液加入已置于15 mL收集管中的滤器内。 (C) 将推杆插入注射器，通过按压使裂解液经滤器过滤。 (D) 通过完全按压收集滤液，包括任何气泡。 (E) 过滤后的裂解液。
<img alt="Western blot 分析；细胞组分中的蛋白质标记物（A）及 SUMO2/3 免疫印迹检测（B）" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56912/56912fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：BlastR 裂解缓冲液与其它裂解缓冲液的比较。 图 2A 改编自 Horita et al. 2017. Biosci. Rep.31（A） 使用 BlastR、RIPA、mPER、IP 裂解、变性（1% SDS）和 Laemmli 裂解缓冲液裂解 A431 细胞。所有变性裂解物均使用 BlastR 滤膜去除基因组 DNA。通过针对各细胞区室标志蛋白的抗体，检测膜、胞质、线粒体和核标志蛋白的分离情况。（B） 使用 BlastR、RIPA 和 1% SDS 变性缓冲液裂解 A431 细胞。裂解物用 SUMO 2/3 或对照 IgG 亲和微珠进行免疫沉淀。样品经 SDS-PAGE 分离后，使用 SUMO 2/3-辣根过氧化物酶（HRP）抗体进行 Western 印迹分析。图中显示的是来自 N≥3 次独立实验的代表性印迹结果。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56912/56912fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="凝胶电泳结果；DNA 和蛋白质分离；千碱基和 kDa 标记物；过滤方法。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56912/56912fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 3"> 
图 3：BlastR 裂解滤膜可有效去除基因组 DNA。 (A) 使用变性裂解缓冲液裂解 A431 细胞。基因组 DNA 分别通过 BlastR 滤膜、注射器针头或超声处理 5、10、20 或 30 秒进行去除或剪切。取 2% 裂解液通过溴化乙锭染色和琼脂糖凝胶电泳进行分析。 (B) 使用变性缓冲液裂解 A431 细胞后，裂解液未经过滤或使用 BlastR 滤膜过滤。样品通过 SDS-PAGE 分离，并用考马斯亮蓝染色显影。 (C) B 组重复样品经 SDS-PAGE 分离后转至 PVDF 膜，使用 EGFR 抗体检测 EGFR 蛋白。图中显示的是来自 N ≥3 次独立实验的代表性印迹。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56912/56912fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示PD-L1表达的免疫印迹；抗体-蛋白G复合物分析；蛋白质分离结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56912/56912fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4：检测EGF诱导的PD-L1翻译后修饰。 图片改编自Horita et al. 2017. Neoplasia30 (A)。血清剥夺的A431细胞未经刺激（UT）或经EGF刺激一小时后，用BlastR裂解缓冲液裂解。WCL用于检测PD-L1水平（泳道1,2）。使用泛素结合磁珠（UBA01）免疫沉淀泛素化蛋白（泳道3,4）。使用磷酸酪氨酸结合磁珠（APY03）免疫沉淀酪氨酸磷酸化蛋白（泳道5,6）。使用SUMO 2/3结合磁珠（ASM24）免疫沉淀SUMO化2/3蛋白（泳道7,8）。使用乙酰赖氨酸结合磁珠（AAC01）免疫沉淀乙酰化蛋白（泳道9,10）。使用IgG结合对照磁珠免疫沉淀非特异性结合蛋白（泳道11,12）。样品通过SDS-PAGE分离，并使用PD-L1抗体进行Western印迹分析。图中展示的是N ≥3次独立实验的代表性结果。白色星号用于标示PD-L1 pY和Ac蛋白条带。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56912/56912fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">BlastR 裂解缓冲液配制计算</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1.0 mL</td>
			<td>2.0 mL</td>
			<td>5.0 mL</td>
			<td>10.0 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BlastR Lysis buffer</td>
			<td>965 µL</td>
			<td>1930 µL</td>
			<td>4.825 mL</td>
			<td>9.650 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>酪氨酸磷酸酶抑制剂</td>
			<td>5 µL</td>
			<td>10 µL</td>
			<td>25 µL</td>
			<td>50 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>去泛素化酶/去SUMO化酶抑制剂</td>
			<td>10 µL</td>
			<td>20 µL</td>
			<td>50 µL</td>
			<td>100 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDAC抑制剂</td>
			<td>10 µL</td>
			<td>20 µL</td>
			<td>50 µL</td>
			<td>100 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>蛋白酶抑制剂混合物</td>
			<td>10 µL</td>
			<td>20 µL</td>
			<td>50 µL</td>
			<td>100 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">BlastR 稀释缓冲液配制计算</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>4.0 mL</td>
			<td>8.0 mL</td>
			<td>20.0 mL</td>
			<td>40.0 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BlastR Lysis buffer</td>
			<td>3.86 mL</td>
			<td>7.72 mL</td>
			<td>19.3 mL</td>
			<td>38.6 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>酪氨酸磷酸酶抑制剂</td>
			<td>20 µL</td>
			<td>40 µL</td>
			<td>100 µL</td>
			<td>200 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>去泛素化酶/去SUMO化酶抑制剂</td>
			<td>40 µL</td>
			<td>80 µL</td>
			<td>200 µL</td>
			<td>400 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDAC抑制剂</td>
			<td>40 µL</td>
			<td>80 µL</td>
			<td>200 µL</td>
			<td>400 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>蛋白酶抑制剂混合物</td>
			<td>40 µL</td>
			<td>80 µL</td>
			<td>200 µL</td>
			<td>400 µL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1： 细胞裂解用裂解液与稀释液配制表。 本表提供了在配制细胞裂解用缓冲液时，针对特定体积的裂解液与稀释液所需添加的抑制剂浓度。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>培养皿蛋白质含量</td>
			<td>推荐的 BlastR 裂解缓冲液体积</td>
			<td>推荐的 BlastR 稀释缓冲液体积</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&lt; 1 mg</td>
			<td>合并多个培养皿中的蛋白质</td>
			<td>使终体积达到 1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-2 mg</td>
			<td>300 µL</td>
			<td>使终体积达到 1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-4 mg</td>
			<td>600 µL</td>
			<td>使终体积达到 3 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-6 mg</td>
			<td>900 µL</td>
			<td>使终体积达到 4.5 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2： BlastR 裂解/稀释缓冲液用量表。 本表格提供了在制备裂解液时推荐使用的裂解缓冲液和稀释缓冲液体积。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>加入 1 ml Precision Red 蛋白质测定试剂的细胞裂解物体积 (µL)</td>
			<td>样本吸光度 OD600 读数所用乘数</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50</td>
			<td>2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3： 将分光光度计读数转换为 mg/mL 裂解液的换算系数。 该图表提供换算数值，以帮助计算蛋白浓度。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>亲和 beads</td>
			<td>每 IP bead 悬液体积 (mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>泛素化</td>
			<td>20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>磷酸化酪氨酸</td>
			<td>30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUMO化 2/3</td>
			<td>40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>乙酰化</td>
			<td>50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>对照 beads</td>
			<td>每 IP bead 悬液体积 (mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>泛素化对照 beads</td>
			<td>20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>磷酸化酪氨酸对照 beads</td>
			<td>30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUMO化 2/3 对照 beads</td>
			<td>40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>乙酰化对照 beads</td>
			<td>50</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表4：每免疫沉淀反应推荐使用的磁珠体积对照表。 本对照表提供了每次免疫沉淀（IP）反应推荐使用的亲和磁珠用量。

针对目标蛋白的多种内源性翻译后修饰进行研究可能极具挑战性。本文所述技术采用优化的裂解缓冲液和滤膜系统，并结合特异性靶向特定翻译后修饰的亲和基质，利用单一、简化的系统即可检测目标蛋白的乙酰化、泛素化、SUMO化2/3以及酪氨酸磷酸化修饰。

如今人们已充分认识到，翻译后修饰（PTMs）在调控蛋白质结构与功能方面发挥着至关重要的作用，这……

本实验方案的总体目标是使缺乏PTM研究经验的研究人员能够利用一个综合性系统，有效确定其目标蛋白是否在体内被一种或多种PTM修饰。该方法通过使用单一、简化的系统来检测关键的翻译后修饰及其潜在的相互作用，从而推动翻译后修饰领域的研究进展。该技术的主要优势在于，非PTM领域的专家也能够在他们的模型系统中检测目标蛋白是否在体内被一种或多种PTM所修饰。我们在研究多种细胞信号通路的调控机制时首次提出了该方法的想法，当时发现现有的用户友好型试剂盒或系统实际上并不适用于非磷酸化翻译后修饰的研究。请按照文本方案中的描述，从A431细胞的制备开始本实验操作。同时，准备含有抑制剂的Blaster裂解液并用稀释缓冲液进行配制。倒掉培养基，将细胞置于冰上。随后用 10 毫升 1× 磷酸盐缓冲液洗涤细胞两次。在加入裂解缓冲液之前，尽可能去除 PBS，以最大限度地提高细胞裂解效率。向每个150毫米培养皿中加入600微升裂解缓冲液。缓冲液的用量取决于预期的蛋白产量。接着，使用细胞刮棒裂解细胞。由于细胞核裂解，裂解液将变得黏稠。使用剪去一毫米的移液器吸头，将粗裂解液转移至已置于15毫升收集管中的破碎过滤器。使用提供的过滤器压柄将破碎过滤器完全压紧，收集裂解液的滤过部分（包括任何气泡）至15毫升管中。简单高效的裂解过滤器可去除基因组DNA，而不是像其他常用方法那样将其剪切。根据预期的蛋白产量，用裂解稀释缓冲液将澄清裂解液稀释至每块150毫米培养板终体积为3毫升。此步骤非常重要，因为最终的缓冲液组成会影响氨基酸沉淀反应的严格性。接下来，按照文本方案中的描述准备蛋白质定量检测。在600纳米处测定裂解液样品的吸光度，并计算蛋白质浓度。将储备试剂管颠倒数次，确保磁珠在管内完全重悬。对于每个免疫沉淀实验，将磁珠悬液分装至预冷的1.5毫升微量离心管中，置于冰上。在此步骤中，向各微量离心管中分别加入20 µL泛素亲和磁珠、30 µL磷酸化酪氨酸亲和磁珠、40 µL SUMO2/3亲和磁珠，或50 µL乙酰化亲和磁珠。轻轻颠倒含有泛素化免疫沉淀对照微珠和IgG对照微珠的储备试剂管数次，确保微珠在管内完全重悬。接下来，将对照微珠按每个对照反应分装，以确定非特异性结合。此处，将20 µL泛素化对照微珠、30 µL磷酸化酪氨酸对照微珠、40 µL SUMO2/3化对照微珠或50 µL乙酰化对照微珠分别加入预冷的1.5 mL微量离心管中，置于冰上。保留20微升裂解液，用于进行Western印迹上样对照。向预留的裂解液中加入5微升5x上样缓冲液，在95摄氏度下煮沸5分钟。接着，将裂解液分别加入每个IP管及对照IP管中。此处，每次免疫沉淀（IP）及对照反应均使用一毫克裂解液，共进行八次免疫沉淀反应。将反应管置于4°C的翻转旋转平台上孵育两小时。孵育结束后，在4°C条件下以3,000至5,000 × g离心一分钟，收集磁珠。尽可能吸尽上清液，切勿扰动磁珠，然后在4°C旋转平台上用一毫升裂解洗涤缓冲液洗涤磁珠五分钟，并通过离心收集磁珠，操作同前。离心后，尽可能吸尽上清液，切勿扰动磁珠，并重复洗涤步骤两次。最后一次洗涤和离心后，吸除大部分缓冲液上清，然后使用细孔蛋白上样枪头去除残留的上清液。允许对珠粒沉淀造成轻微扰动。为最大程度回收目标PTM蛋白，需在尽量减少对珠粒沉淀扰动的前提下，确保完全去除所有洗涤缓冲液。接下来，加入30 µL珠粒洗脱缓冲液，并通过轻轻敲击或弹击管壁的方式充分重悬珠粒。此阶段请勿使用移液器。将重悬的磁珠在室温下孵育五分钟。剪掉转移用移液器吸头的尖端，然后轻轻将每份磁珠悬液转移至已放入1.5毫升微量离心管中的1.5毫升微量离心柱中。将样品在室温下以9,000至10,000 ×g离心1分钟，以收集免疫沉淀样品，然后向每个样品中加入2 µL的2-巯基乙醇并充分混匀。将样品置于95 °C水浴中孵育5分钟。孵育结束后，在室温下以10,000 ×g离心1分钟收集样品。最后，按照文本方案中所述步骤进行 SDS-PAGE、转膜和蛋白质印迹分析。将未经处理和经 EGF 处理的 A431 细胞裂解液分别加入泛素、磷酸化酪氨酸、SUMO 2/3 以及乙酰化赖氨酸亲和微珠中。使用 PD-L1 抗体进行蛋白质印迹分析，以确定 PD-L1 蛋白在 EGF 刺激下是否受到这四种翻译后修饰的修饰作用。此处展示的代表性结果表明，该方法能够有效鉴定 PD-L1 的内源性翻译后修饰。一旦掌握，若操作得当，可在四到四个半小时内完成该技术。观看本视频后，您应能充分理解如何利用这一全面的翻译后修饰检测系统，检测目标蛋白或信号通路中的内源性翻译后修饰或修饰间串扰。

utilizing-comprehensive-immunoprecipitation-enrichment-system-to

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

利用综合沉淀富集系统识别目标蛋白的内源性后向转化剖面

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植物蛋白质复合物翻译后修饰的鉴定

我们已建立一种利用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）系统纯化共调节相互作用蛋白的方法。...

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我们介绍一种结合液相色谱与高分辨质谱技术，利用同重标记、深度分级分离、生物信息学工具以及质量控制步骤，精确量化蛋白质的实验方案。...

通过同重标记、深度液相色谱、质谱分析及软件辅助定量进行深度蛋白质组分析

我们介绍一种从复杂的生物样品中纯化、检测和鉴定来源于泛素化蛋白质的diGly肽的方法。该方法具有良好的重复性和稳健性，在泛素化修饰组分析的深度方面优于已发表的方法。...

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我们采用严谨的生化方法表征了一种新的激酶蛋白：利用特异性抗体在不同细胞系和组织中进行蛋白质印迹分析，通过共免疫沉淀实验检测其相互作用，通过蛋白质印迹结合磷酸化特异性抗体以及γ[32P]...

利用稳健的生化方法对一种新型激酶蛋白进行分子水平表征

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泛素及泛素样蛋白依赖性翻译后修饰的分析及显著变化的鉴定

本文描述了一种蛋白质组学工作流程，用于从细胞核亚细胞组分中鉴定特定目标蛋白的相互作用蛋白伙伴。该流程采用免疫亲和富集结合无标记质谱分析技术，包括亚细胞分级分离、免疫沉淀、滤膜辅助样品制备、离线纯化、质谱分析以及后续的生物信息学分析流程。...

无需标记的免疫沉淀质谱工作流程用于大规模核相互作用组分析

本工作流程描述了同时对多种蛋白质翻译后修饰（PTM）进行高效、经济的时间和成本控制下的富集，以实现定量全局蛋白质组学分析。该方案采用多抗体偶联的肽段水平PTM富集方法，随后结合数据非依赖性采集质谱分析，以深入理解PTM之间的相互调控关系。...

同时富集两种翻译后修饰以实现定量与修饰位点定位

蛋白质-蛋白质相互作用对于阐明靶蛋白的功能至关重要，而免疫共沉淀（co-IP）可轻松验证蛋白质相互作用（PPI）。我们将编码表位标签蛋白的质粒瞬时转染至HEK-293细胞中，并建立了一种免疫沉淀方法，以简便地验证两种靶蛋白之间的结合。...

使用抗表位标签亲和凝胶进行免疫沉淀以研究蛋白质-蛋白质相互作用

学习使用综合沉淀富集系统检测目标蛋白的内源性翻译后修饰，包括乙酰化、泛素化、SUMO化2/3和酪氨酸磷酸化。该方法采用A431细胞模型，为非PTM专家提供简化的蛋白质修饰分析流程。

利用全面的免疫沉淀富集系统鉴定靶蛋白的内源性翻译后修饰谱

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