Name: 全基因组的 rna 干扰筛查以确定调节溶瘤病毒治疗的宿主因素 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: 了解全基因组RNA干扰筛查技术，用于识别增强溶瘤病毒疗法的宿主靶点。该方法可全面、无偏倚地分析宿主因子与细胞通路，为肿瘤病毒治疗研究提供重要工具。

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本研究工作获得了安大略癌症研究所、加拿大创新基金会、渥太华地区癌症基金会以及特里·福克斯研究所的资助。K.J.A. 获得了加拿大范尼尔研究生奖学金、加拿大卫生研究院硕士奖学金以及安大略研究生奖学金的支持。

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作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种利用高通量RNAi筛选来鉴定可被调控以增强溶瘤病毒治疗效果的宿主靶点的实验方案。该方法已成功应用于溶瘤型马腊巴病毒（Maraba virus）和溶瘤型痘苗病毒（vaccinia virus），但如文中所述，也可根据需要调整用于其他溶瘤病毒或一般病毒，以鉴定调控病毒复制的宿主基因。该筛选方案的设计也可用于鉴定促进或抑制病毒扩散的基因，但可根据需要轻松修改以适应其他检测指标。例如，我们针对马腊巴病毒的筛选旨在利用基于刃天青（resazurin）的简单活细胞染料检测法评估细胞活力，从而鉴定调控溶瘤作用的基因（见图4）15。在此类筛选中，病毒感染孵育后，不再使用甲醛固定细胞并用Hoechst染色，而是向每孔加入刃天青染料（终浓度为20 μg/mL），经6小时孵育后，使用酶标仪测定吸光度（573 nm）。我们也可选择基于Hoechst染色的细胞数量作为检测指标。尽管在此筛选中无需使用替代性报告分子来监测病毒复制，但携带报告蛋白（尤其是荧光蛋白）的病毒有助于优化筛选流程，例如可实现对病毒复制的实时监测；此外，使用带有报告蛋白的病...

高通量全基因组RNAi筛选已被证明是揭示包括病毒生物学在内的多个研究领域生物学机制的宝贵工具。在过去十年左右的时间里，众多研究团队已开展基于细胞的大规模RNAi筛选，以系统性地鉴定调控病毒复制的宿主基因（详见综述1,2,3,4,5,6,7）。有趣的是，这些筛选中有大量是在癌细胞中进行的，且部分研究使用了当前正在开发为溶瘤病毒候选物的病毒，包括痘苗病毒8,9,10、粘液瘤病毒11、单纯疱疹病毒12、水疱性口炎病毒13,14和马拉巴病毒15。尽管这些研究的主要目标是鉴定影响病毒复制某一环节的宿主因子，而非专门寻找可用于增强溶瘤病毒治疗效果的生物治疗靶点，但这些数据集仍可被深入挖掘，用于此目的。显然，利用这些筛选手段发现可调控以增强溶瘤病毒治疗效果的宿主靶点的潜力尚未被充分开发。
目前正在开展大量针对溶瘤病毒平台的临床前和临床研究，包括单纯疱疹病毒、呼肠孤病毒和痘苗病毒，其中一些已在晚期临床试验中显示出显著疗效。对于大多数此类平台，研究重点集中在改造病毒基因组以增强治疗效果。例如，为提高对肿瘤的特异性，已对特定病毒基因进行删除或突变，从而显著限制病毒在正常细胞中的复制，而在肿瘤细胞中则不受影响。在某些情况下，还引入了外源基因，如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）以增强免疫应答，或钠碘同向转运体（NIS）以实现 体内 用于治疗目的的成像和细胞摄取放射性碘。然而，目前针对调控宿主/肿瘤基因并探究宿主/肿瘤基因对溶瘤病毒复制影响的研究极为有限。随着高通量筛选技术的发展，现已能够在基因组水平上研究宿主与病毒之间的相互作用，并揭示通过调控宿主基因组以增强溶瘤病毒治疗效果的新机遇（综述见16,17,18).
我们报道了首个通过高通量遗传筛选验证概念的研究，旨在识别可用于增强溶瘤病毒治疗效果的宿主靶点。为发现调控Maraba病毒溶瘤作用的宿主基因（Maraba病毒是一种正进行I期和II期临床试验的溶瘤弹状病毒），我们利用靶向18,120个基因的siRNA（小干扰RNA）文库，在三种不同的肿瘤细胞系中重复进行了全基因组RNA干扰筛选。15筛选结果的通路分析显示，内质网（endoplasmic reticulum, ER）应激反应通路的成员显著富集。我们从这些通路中选取了10个候选基因，使用与初筛不同的靶向序列的siRNA进行二次验证。作为三级验证的一部分，我们开展了IRE1α（inositol-requiring enzyme 1 alpha）的挽救实验，以确认候选基因的作用为靶点特异性。 体外 和 体内 使用IRE1α小分子抑制剂进行测试，结果显著增强了溶瘤疗效。
Workenhe 等12 还利用一个靶向 16,056 个基因的混合型慢病毒 shRNA（短发夹 RNA）文库，开展了全基因组范围的 RNA 干扰筛选，以鉴定限制人单纯疱疹病毒 1 型（HSV-1）突变株 KM100 介导的乳腺癌细胞溶瘤作用的宿主因子。在初筛中，他们鉴定出 343 个基因，其表达下调可导致 KM100 感染细胞的细胞毒性较对照感染细胞增强；他们从中选取了 24 个基因进行二次验证。在 24 个基因中，有 8 个基因在二次筛选中得到确认，其中之一为 SRSF2（丝氨酸/精氨酸富集剪接因子 2），该结果在后续的三轮验证中通过基因拯救实验进一步证实。研究团队进一步鉴定出一种 DNA 拓扑异构酶抑制剂类化疗药物，该药物可降低 SRSF2 的磷酸化水平，并发现将 HSV-1 KM100 与该抑制剂联合治疗可延长携带 TUBO 肿瘤的小鼠的生存期。
在上述研究中，均遵循了相似的工作流程。每项研究均首先进行全基因组范围的RNAi初筛，随后对初筛中鉴定出的部分阳性结果进行二次筛选。接下来开展三次验证实验，包括通过遗传拯救实验确认阳性结果的作用靶点特异性。 体外 通过操控目标基因产物进行最终验证 体内本文首先提供了一种高通量siRNA筛选实验的建立与验证通用方案，包括确定最佳转染条件、病毒用量及感染时间。此外，我们还提供了进行初筛高通量siRNA筛选的详细步骤，以及对二次筛选验证和三次验证方法的整体描述。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;耗材&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>siRNA文库</td><td>GE Dharmacon</td><td>G-005005-02</td><td></td></tr><tr><td>Corning 384孔板</td><td>康宁</td><td>3985</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 384 孔板</td><td>Becton Dickinson</td><td>353962</td><td></td></tr><tr><td>水</td><td>Sigma</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>siGenome SMARTpool PLK1</td><td>GE Dharmacon</td><td>M-003290-01</td><td></td></tr><tr><td>AllStars 阴性对照 siRNA</td><td>Qiagen</td><td>SI03650318</td><td></td></tr><tr><td>siGenome 非靶向 siRNA 混合物 #2</td><td>GE Dharmacon</td><td>D-001206-14-20</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/高糖</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Sigma</td><td>F15051-500ML</td><td></td></tr><tr><td>HEPES溶液（1 M）</td><td>Sigma</td><td>H3535-100ML</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素 100 倍溶液</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.25%）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>2500056</td><td></td></tr><tr><td>DPBS/改良版</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>13778100</td><td></td></tr><tr><td>Oligofectamine</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>1225011</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>22600-050</td><td></td></tr><tr><td>刃天青钠盐</td><td>Sigma</td><td>R7017-5G</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>H21492</td><td></td></tr><tr><td>甲醛（37% 质量分数）</td><td>Fisher Scientific</td><td>F79-4</td><td></td></tr><tr><td>500 ml 瓶</td><td>康宁</td><td>430282</td><td></td></tr><tr><td>微孔板用粘性密封膜</td><td>Excel Scientific</td><td>361006007</td><td></td></tr><tr><td>可剥离热封箔</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AB-3720</td><td></td></tr><tr><td>BioTek MicroFlo Select 分液器卡带</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-120-625</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MicroFlo Select（液体分配器）</td><td>Fisher Scientific</td><td>11120621</td><td></td></tr><tr><td>BioTek Synergy HT 酶标仪</td><td>Biotek</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Opera 成像与分析仪器</td><td>PerkinElmer</td><td>HH10000115</td><td></td></tr><tr><td>KiNEDx 机械臂</td><td>峰形分析与自动化（原名为 Peak Robotics）</td><td>KX-300-660</td><td></td></tr><tr><td>Cytomat 24C系列自动培养箱</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>50080227</td><td></td></tr><tr><td>JANUS 自动化工作站</td><td>PerkinElmer</td><td>AJI4M01</td><td></td></tr><tr><td>板架转盘</td><td>峰形分析与自动化（原名为 Peak Robotics）</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Alps 3000 微孔板封膜机</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AB-3000</td><td></td></tr></tbody></table>

全基因组rna干扰筛选鉴定调控溶瘤病毒治疗的宿主因子

Genome-wide RNAi Screening to Identify Host Factors That Modulate Oncolytic Virus Therapy

高通量全基因组RNAi（RNA干扰）筛选技术已被广泛用于发现影响宿主因子的基因&#160;病毒复制。本文介绍了该技术在揭示特异性调控马腊巴病毒（Maraba virus）和痘苗病毒（vaccinia virus）复制的宿主靶点方面的应用，旨在增强溶瘤病毒治疗效果。尽管本方案已针对溶瘤型马腊巴病毒和溶瘤型痘苗病毒进行了测试，但该方法同样适用于其他溶瘤病毒，并可用于广泛识别调控哺乳动物细胞中病毒复制的宿主靶点。本方案详细描述了在哺乳动物细胞中建立和验证用于高通量RNA干扰（RNAi）筛选的检测方法，开展初次高通量RNAi筛选所需的关键考虑因素和准备步骤，以及进行初次高通量RNAi筛选的逐步操作指南；此外，还概述了二次筛选验证和三次验证研究的一般方法。高通量RNAi筛选的优势在于，只要能够建立相应的检测体系，便可以系统、无偏倚的方式全面鉴定出调控病毒复制任一环节的宿主因子。 体外 例如感染性、裂解量和细胞毒性等检测。该方法能够揭示基于现有知识尚未预见的生物治疗靶点。

用于确定宿主靶点以增强溶瘤病毒治疗的实验流程概览见图1。
如图1所示，进行高通量RNAi筛选的关键第一步是建立检测方法。图2A展示了一个用于转染优化检测的示例板布局。图2B包含预期结果的代表性图像，而图2C为预期结果的代表性图表。在对PLK-1基因进行siRNA敲低后（该基因可诱导细胞死亡，常作为阳性对照用于监测siRNA敲低效率），除非细胞系的倍增时间较长（此时观察细胞死亡表型所需时间更长），否则细胞存活率预期应在0–30%之间。非靶向siRNA应对细胞基本无毒性，其相对存活率应与未处理细胞相近。
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本文介绍了一种利用高通量RNA干扰筛选来发现可被调控以增强溶瘤病毒治疗效果的宿主靶点的实验方案，特别是针对弹状病毒和痘苗病毒治疗，但该方法也可轻松适用于其他溶瘤病毒平台，或用于发现普遍调控病毒复制的宿主基因。

全基因组RNA干扰筛选鉴定调控溶瘤病毒治疗的宿主因子

高通量全基因组RNAi（RNA干扰）筛选技术已广泛用于发现影响病毒的宿主因子……

本方案的总体目标是鉴定可通过调控来增强溶瘤病毒治疗效果的宿主靶点。该方法有助于回答溶瘤病毒治疗领域中的关键科学问题，例如，哪些特定的宿主因子和细胞通路能够调控溶瘤病毒的复制。该技术的主要优势在于，能够以全面且无偏倚的方式识别出可用于干预并增强溶瘤病毒治疗效果的宿主靶点。该方案还可用于鉴定普遍调节病毒复制的宿主因子。根据本文方案建立高通量筛选实验后，从冰箱中取出一批微孔板，室温解冻20至30分钟。在此期间，准备两瓶70%乙醇，并向两个50 mL锥形管中加入PBS，另一管中加入蒸馏水。将液体分配器的软管浸入装有70%乙醇的瓶子中，然后在软管上贴一小段遮蔽胶带，标记出可视为无菌区域的界限位置。使用约25 mL的70%乙醇对软管进行预冲洗。向瓶中补充额外的乙醇以替换消耗的体积，然后让软管在乙醇中浸泡至少五分钟。准备好细胞培养操作台后，在室温下以1026 × g离心密封的培养板和套件2分钟。接着，取下培养板上的密封膜。然后，将所需量的转染试剂用移液器加入含有预热转染试剂稀释液的锥形管中。通过从每块培养板中吸除培养基开始消化细胞。用 9 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞，然后每块培养板加入 3 mL 胰蛋白酶溶液。将细胞在 37°C 条件下孵育约 5 分钟。然后，用 22 mL 培养基重悬细胞，上下吹打 10 次。将每块组织培养板中的细胞悬液合并至一个无菌瓶中，并通过倒置瓶子混匀细胞悬液。随后，将细胞悬液中的 1 mL 分装至两个独立的微量离心管中。从每支微量离心管中取出样品并计数细胞。然后根据所需密度计算所需的细胞悬液体积，并配制足量的稀释细胞悬液以供一批培养板使用。在准备细胞的同时，将液体分配器管路中的乙醇排空。使用约 25 mL 的 PBS 预先润洗管路，然后排空管路。确保将要浸入转染试剂中以及后续浸入细胞悬液中的管路部分保持无菌。将可使用一个锥形管转染试剂溶液完成的培养板单独放置。将转染试剂溶液上下吹打10次，然后用该溶液预润注液管，再向每孔分配5微升。在室温下以1026 × g离心板1分钟。然后将培养板在室温下孵育，孵育时间根据所使用的转染试剂说明书推荐的时间而定。孵育期间，排空转染试剂溶液的管路，并将其放入盛有 PBS 的 50 mL 锥形管中。随后使用约 25 mL PBS 通过灌注并排空的方式冲洗管路。混匀含有细胞悬液的瓶子，然后将管路插入悬液中，充分润洗管路，直至观察到每个加样头均能正常排液。将细胞悬液以每孔30 µL的量加入所有培养板的孔中。排空管路中的细胞悬液，随后用约25 mL的PBS冲洗管路，再用约50 mL的蒸馏水冲洗。从接种细胞开始，将培养板在室温下静置45至60分钟。随后将培养板放入未受干扰的培养箱中，进行所需时长的基因沉默孵育。为节省时间，可在感染细胞的前一天，将每批培养板感染所需的准确量培养基（包括未感染孔所需的培养基）移液至无菌瓶中。将培养基在 37 摄氏度下预热，然后用 70% 乙醇填充两个瓶子，用 PBS 填充两个 50 mL 离心管，并用蒸馏水填充一个离心管。按照之前演示的方法，用 70% 乙醇对管路进行灭菌。在管路浸泡于乙醇的同时，首先涡旋混匀病毒，然后用移液器将所需精确体积的病毒加入感染培养基瓶中。然后用 25 mL 的 PBS 冲洗管路以进行预润，随后排空。将培养板从培养箱中取出后，放入组织培养操作台中。用培养基预润管路，然后向未感染的对照孔中加入 40 微升培养基。排空管路中的培养基，用 25 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗管路。将病毒混匀后，将管路放入含有病毒的瓶子中，将 40 微升（µL）病毒液均匀加入各孔板中。在室温下以 400 × g 离心 30 分钟。将培养板孵育至先前确定的时间。固定前一日，为每批培养板准备一瓶含有4%甲醛和PBS的固定静置液，但不添加Hoechst染料。将该溶液储存于远离光照的易燃品柜中。次日，使用70%乙醇和PBS按照之前的方法冲洗管路。将30微升溶液加入所有孔板中，然后将孔板放入培养箱中孵育30分钟。孵育结束后，给孔板加上密封膜，并在4摄氏度避光保存。根据文本方案进行成像和分析。图中显示的是786-O细胞，在单独使用转染试剂稀释液孵育72小时后，用Hoechst 33342染色。实验分组包括：转染试剂和稀释液、非靶向siRNA，以及靶向PLK1的siRNA。此处显示的生存曲线表明，转染PLK1 siRNA的细胞中有22%存活，而转染非靶向siRNA的细胞中有94%存活。该图展示了在不同感染复数（MOI）下，感染表达增强型绿色荧光蛋白（enhanced GFP）的溶瘤性痘苗病毒的786 O细胞的活细胞时间过程实验结果。此处展示了在MOI为0.05时，细胞感染后活细胞时间过程的代表性图像。21小时的孵育时间可用于检测扩散程度的增加或减少，因为该时间点处于线性范围内。在三种肿瘤细胞系中进行全基因组RNAi筛选后，采用MAD方法鉴定出1008个在至少三种癌细胞系中的两种或以上中共同存在的候选基因。从中选取UPR和ERAD通路中的10个候选基因，利用靶向不同序列的siRNA进行二次验证。在分配试剂时，必须确保使用正确批次的培养板，选择正确的分配体积，并且管路中已充满正确的试剂，且始终完全浸没在试剂中。观看本视频后，您应能够充分理解如何开展高通量RNAi筛选，以鉴定可通过调控来增强溶瘤病毒治疗效果的宿主靶点，或鉴定普遍影响病毒复制的宿主因子。

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全基因组的 rna 干扰筛查以确定调节溶瘤病毒治疗的宿主因素

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