全基因组RNA干扰筛选鉴定调控溶瘤病毒治疗的宿主因子
2018年4月3日
本文介绍了一种利用高通量RNA干扰筛选来发现可被调控以增强溶瘤病毒治疗效果的宿主靶点的实验方案，特别是针对弹状病毒和痘苗病毒治疗，但该方法也可轻松适用于其他溶瘤病毒平台，或用于发现普遍调控病毒复制的宿主基因。
本方案的总体目标是鉴定可通过调控来增强溶瘤病毒治疗效果的宿主靶点。该方法有助于回答溶瘤病毒治疗领域中的关键科学问题，例如，哪些特定的宿主因子和细胞通路能够调控溶瘤病毒的复制。该技术的主要优势在于，能够以全面且无偏倚的方式识别出可用于干预并增强溶瘤病毒治疗效果的宿主靶点。
该方案还可用于鉴定普遍调节病毒复制的宿主因子。根据本文方案建立高通量筛选实验后，从冰箱中取出一批微孔板，室温解冻20至30分钟。在此期间，准备两瓶70%乙醇，并向两个50 mL锥形管中加入PBS，另一管中加入蒸馏水。
将液体分配器的软管浸入装有70%乙醇的瓶子中，然后在软管上贴一小段遮蔽胶带，标记出可视为无菌区域的界限位置。使用约25 mL的70%乙醇对软管进行预冲洗。向瓶中补充额外的乙醇以替换消耗的体积，然后让软管在乙醇中浸泡至少五分钟。
准备好细胞培养操作台后，在室温下以1026 × g离心密封的培养板和套件2分钟。接着，取下培养板上的密封膜。然后，将所需量的转染试剂用移液器加入含有预热转染试剂稀释液的锥形管中。
通过从每块培养板中吸除培养基开始消化细胞。用 9 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞，然后每块培养板加入 3 mL 胰蛋白酶溶液。将细胞在 37°C 条件下孵育约 5 分钟。
然后，用 22 mL 培养基重悬细胞，上下吹打 10 次。将每块组织培养板中的细胞悬液合并至一个无菌瓶中，并通过倒置瓶子混匀细胞悬液。随后，将细胞悬液中的 1 mL 分装至两个独立的微量离心管中。
从每支微量离心管中取出样品并计数细胞。然后根据所需密度计算所需的细胞悬液体积，并配制足量的稀释细胞悬液以供一批培养板使用。在准备细胞的同时，将液体分配器管路中的乙醇排空。
使用约 25 mL 的 PBS 预先润洗管路，然后排空管路。确保将要浸入转染试剂中以及后续浸入细胞悬液中的管路部分保持无菌。将可使用一个锥形管转染试剂溶液完成的培养板单独放置。
将转染试剂溶液上下吹打10次，然后用该溶液预润注液管，再向每孔分配5微升。在室温下以1026 × g离心板1分钟。
然后将培养板在室温下孵育，孵育时间根据所使用的转染试剂说明书推荐的时间而定。孵育期间，排空转染试剂溶液的管路，并将其放入盛有 PBS 的 50 mL 锥形管中。随后使用约 25 mL PBS 通过灌注并排空的方式冲洗管路。
混匀含有细胞悬液的瓶子，然后将管路插入悬液中，充分润洗管路，直至观察到每个加样头均能正常排液。将细胞悬液以每孔30 µL的量加入所有培养板的孔中。排空管路中的细胞悬液，随后用约25 mL的PBS冲洗管路，再用约50 mL的蒸馏水冲洗。
从接种细胞开始，将培养板在室温下静置45至60分钟。随后将培养板放入未受干扰的培养箱中，进行所需时长的基因沉默孵育。为节省时间，可在感染细胞的前一天，将每批培养板感染所需的准确量培养基（包括未感染孔所需的培养基）移液至无菌瓶中。
将培养基在 37 摄氏度下预热，然后用 70% 乙醇填充两个瓶子，用 PBS 填充两个 50 mL 离心管，并用蒸馏水填充一个离心管。按照之前演示的方法，用 70% 乙醇对管路进行灭菌。在管路浸泡于乙醇的同时，首先涡旋混匀病毒，然后用移液器将所需精确体积的病毒加入感染培养基瓶中。
然后用 25 mL 的 PBS 冲洗管路以进行预润，随后排空。将培养板从培养箱中取出后，放入组织培养操作台中。用培养基预润管路，然后向未感染的对照孔中加入 40 微升培养基。
排空管路中的培养基，用 25 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗管路。将病毒混匀后，将管路放入含有病毒的瓶子中，将 40 微升（µL）病毒液均匀加入各孔板中。在室温下以 400 × g 离心 30 分钟。
将培养板孵育至先前确定的时间。固定前一日，为每批培养板准备一瓶含有4%甲醛和PBS的固定静置液，但不添加Hoechst染料。将该溶液储存于远离光照的易燃品柜中。
次日，使用70%乙醇和PBS按照之前的方法冲洗管路。将30微升溶液加入所有孔板中，然后将孔板放入培养箱中孵育30分钟。孵育结束后，给孔板加上密封膜，并在4摄氏度避光保存。
根据文本方案进行成像和分析。图中显示的是786-O细胞，在单独使用转染试剂稀释液孵育72小时后，用Hoechst 33342染色。实验分组包括：转染试剂和稀释液、非靶向siRNA，以及靶向PLK1的siRNA。
此处显示的生存曲线表明，转染PLK1 siRNA的细胞中有22%存活，而转染非靶向siRNA的细胞中有94%存活。该图展示了在不同感染复数（MOI）下，感染表达增强型绿色荧光蛋白（enhanced GFP）的溶瘤性痘苗病毒的786 O细胞的活细胞时间过程实验结果。此处展示了在MOI为0.05时，细胞感染后活细胞时间过程的代表性图像。
21小时的孵育时间可用于检测扩散程度的增加或减少，因为该时间点处于线性范围内。在三种肿瘤细胞系中进行全基因组RNAi筛选后，采用MAD方法鉴定出1008个在至少三种癌细胞系中的两种或以上中共同存在的候选基因。从中选取UPR和ERAD通路中的10个候选基因，利用靶向不同序列的siRNA进行二次验证。
在分配试剂时，必须确保使用正确批次的培养板，选择正确的分配体积，并且管路中已充满正确的试剂，且始终完全浸没在试剂中。观看本视频后，您应能够充分理解如何开展高通量RNAi筛选，以鉴定可通过调控来增强溶瘤病毒治疗效果的宿主靶点，或鉴定普遍影响病毒复制的宿主因子。
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概述
本方案概述了一种高通量RNAi筛选方法，用于鉴定可增强溶瘤病毒治疗效果的宿主靶点，尤其适用于弹状病毒和痘苗病毒。该方法可推广至其他溶瘤病毒平台，并可用于发现影响病毒复制的宿主基因。
关键研究组成部分
科学领域
- 溶瘤病毒治疗
- RNA干扰（RNAi）
- 宿主-病原体相互作用
背景
- 溶瘤病毒旨在选择性感染并杀死癌细胞。
- 了解宿主因素可提高溶瘤病毒治疗的疗效。
- 高通量筛选有助于全面鉴定相关的宿主靶点。
- 本方案可适用于多种病毒载体平台。
研究目的
- 确定可通过调控以增强溶瘤病毒治疗效果的宿主靶点。
- 探索调控病毒复制的宿主因子及细胞信号通路。
- 提供一种全面且无偏倚的靶点鉴定方法。
使用的方法
- 高通量筛选实验的建立。
- 用于筛选的微量滴定板的制备。
- 利用RNAi技术敲低宿主基因。
- 分析宿主靶基因调控对病毒复制的影响。
主要结果
- 鉴定可增强溶瘤病毒治疗效果的特定宿主因子。
- 揭示影响病毒复制的细胞通路。
- 展示高通量RNAi筛选的有效性。
- 在理解病毒-宿主相互作用方面具有更广泛的应用潜力。
结论
- 该方案为增强溶瘤病毒疗法提供了一种有价值的工具。
- 鉴定宿主靶点有助于改进治疗策略。
- 该方法可适用于病毒学领域的多种研究应用。
常见问题
行业高管相关性
全基因组RNAi筛选能够无偏倚地鉴定出调控溶瘤病毒复制的宿主因子，为早期发现阶段的治疗靶点选择提供系统性的风险降低策略。通过绘制影响病毒感染性、裂解量和细胞毒性的宿主-病原体相互作用图谱，该方法可提高靶点验证和项目优先排序的可预测性。这一能力有助于加深对作用机制的理解，并为溶瘤病毒研发管线中的立项或终止决策提供依据。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过鉴定调控癌细胞中病毒复制的宿主基因，能够验证治疗假说。
- 操作价值：对全基因组范围内的宿主因子进行系统性、无偏倚的筛查，有助于阐明相关信号通路的参与机制。
- 科学价值：通过将宿主因子的调控与病毒溶瘤活性的可测量变化相关联，支持靶点的生物学去风险化。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：建立了一种标准化、可重复的检测系统，用于定量病毒复制表型，如感染性和细胞病变效应。
- 操作价值：生成适用于初筛命中物选择及下游验证工作流程的定量、高内涵数据。
- 科学价值：有助于检测方法的可扩展性，并可跨平台应用于玛拉巴病毒和痘苗病毒以外的其他溶瘤病毒。
转化与临床前研究
- 科学价值：在肿瘤细胞系中鉴定具有疾病相关性的宿主靶点，支持转化生物标志物的匹配。
- 操作价值：利用正交的siRNA序列进行二级和三级验证，以确认靶点特异性。
- 科学价值：通过在多种癌症细胞系中使用稳健的统计方法（MAD）确认阳性结果，支持基于风险调整的后续推进决策。
流程与工作流整合
该方法可整合到从靶点识别到临床前验证的整个发现流程中，从而能够基于假设来探究影响溶瘤病毒疗效的宿主通路。
- 发现生物学：通过将宿主基因敲降与病毒复制动态变化相关联，支持假设验证和通路解析。
- 筛选：提供可直接用于检测的实验体系和定量输出结果（例如生存曲线、感染指标），从而实现对化合物或遗传扰动的可靠评估。
- 分析：生成统计学输出结果（例如基于MAD的阳性信号识别），支持不同实验条件间的比较，并对候选因子进行优先排序。
- 转化研究：通过在多种肿瘤模型中验证阳性结果，并将其与已知通路（UPR、ERAD）关联，实现从发现研究到临床前研究的衔接。
- 企业级复用：建立可重复使用的筛选能力，适用于多种溶瘤病毒平台及广泛的病毒-宿主相互作用研究。
运营与企业影响
- 科学价值：提高靶点验证的预测可信度，降低宿主-病原体相互作用中机制上的不确定性。
- 操作价值：实现高通量RNAi筛选工作流程的标准化、可重复性和可扩展性。
- 战略价值：通过早期靶点去风险化，实现更优的立项/终止决策、资本使用效率以及降低后期生物学风险。
- 项目组合影响：基于在多种癌症模型中验证的宿主靶点，进行风险校正后的优先排序和推进决策。
实施注意事项
- 需要具备细胞培养、转染和高通量液体处理方面的专业技术。
- 依赖于获取RNAi文库、转染试剂以及用于病毒复制检测的成像平台。
- 需要跨团队对检测条件、试剂操作和数据分析流程进行标准化。
- 需考虑在不同肿瘤细胞系和病毒株之间进行方法优化，以确保检测的相关性。
- 实际限制因素包括试剂毒性、脱靶效应，以及需要通过正交验证来确认阳性结果的特异性。
