用于评估结合能力的细胞聚集实验 果蝇 缺口与 转录-配体及其抑制作用 顺式-配体

本聚集实验的总体目标是评估 Notch 受体与反式配体的结合及其被顺式配体抑制的情况。该方法有助于回答一个关键问题：遗传或药理学因素将如何影响 Notch 受体与其配体的结合，并进而改变信号传导？该技术的主要优势在于，能够同时评估 Notch 受体与其配体之间的反式结合和顺式结合。

有趣的是，在不涉及内源性配体重叠效应的情况下，开始检测时先将信号接收细胞离心沉淀，然后重悬于Schneider培养基中。使用血细胞计数板手动计数细胞。

在六孔板的每个孔中，分别接种五次方10的S2细胞和稳定的S2-Notch细胞，每孔加入1毫升Schneider培养基。接着，向每孔加入7.5微克双链RNA，并在25°C下孵育细胞24小时。然后加入0.7毫摩尔硫酸铜以诱导Notch表达，并将细胞在25°C下继续孵育三天。

孵育后，使用血细胞计数板手动计数信号发送细胞。将5×10⁶个稳定细胞接种至6孔板的每孔中，每孔加入1毫升添加物的Schneider培养基。然后加入0.7 mmol/L硫酸铜以诱导配体表达，并将细胞在25°C条件下孵育3小时。

通过轻柔吹打收集经双链RNA处理的S2-control和S2-Notch细胞。将每孔2.5 × 10⁵个细胞接种至24孔板中。向补充了添加剂的Schneider培养基中加入5 × 10⁵个稳定的S2-Delta或S2-Serrate Tomato细胞，终体积为200 µL。

将培养板置于150 rpm的摇床上。一分钟后，混匀每孔中的内容物，取出20 µL进行聚集体计数。同时，在倒置显微镜下使用10倍物镜拍摄代表性图像。

为了观察细胞，将相机安装在显微镜上，并连接软件以获取图像。使用血细胞计数板手动计数聚集体。将培养板置于摇床上。

在聚集开始后5分钟和15分钟时重复进行图像采集和计数。通过计算每毫升S2细胞与S2-Delta或S2-Serrate Tomato细胞之间的聚集体数量（作为背景对照），以及每毫升S2-Notch细胞与S2-Delta或S2-Serrate Tomato细胞之间的聚集体数量，进行反式结合定量分析。将信号接收细胞接种于6孔板中，每孔加入1毫升补充型Schneider培养基，每孔接种5 × 10⁵个S2细胞。

向每个孔中加入 7.5 µg 双链 RNA，并将培养板在 25 °C 下孵育 24 小时。孵育后，使用商用转染试剂对经双链 RNA 处理的细胞进行共转染，每孔总 DNA 浓度为 2 µg。将瞬时转染的 S2 细胞在 25 °C 下孵育 24 小时。

第二天，加入0.7毫摩尔的硫酸铜以诱导Notch及其配体的表达，在25摄氏度下孵育三天。按照前文所述方法制备信号发送细胞。最后，按照前述方法进行信号发送细胞与信号接收细胞的聚集实验。

在1至5分钟之间，聚集体数量出现急剧增加。随后，聚集体数量继续增加至30分钟，但增速减缓。在三个时间点显示聚集情况的图像表明，经EGFP双链RNA处理的S2-Notch细胞与S2-Delta细胞形成聚集体，且聚集体数量随时间推移而增加。

相比之下，经sham和双链RNA处理的S2-Notch细胞形成聚集体的速度更快，且聚集体更大、数量更多，表明降低shams水平可增强Notch与Delta的反式结合。将等量的Notch和Delta表达载体转染至S2细胞后，这些细胞与S2-Delta细胞之间形成的聚集体数量显著减少。

此外，顺式 Delta 含量的减少会导致聚集体数量增加，表明在本实验所用的 Notch/顺式 Delta 比例范围内，顺式 Delta 能够以剂量依赖的方式抑制 Notch 与反式 Delta 之间的结合。对相对聚集程度的定量分析显示，在 EGFP 和对照双链 RNA 处理条件下，对聚集的抑制作用相当。

所有试剂准备好后，该检测操作简便，可在几小时内完成。