4.2: 酶活性实验及动力学

酶是生命所必需的生化催化剂。酶测定用于研究酶促反应的动力学特性，阐明酶的催化作用。本视频将介绍酶动力学和检测，介绍一般程序，并展示一些应用。

酶是作用于特定反应物（称为底物）的蛋白质，或较少见的 RNA。酶会降低引发生化反应所需的活化能，导致反应以更快的速度发生。

酶促反应可以分解为三个基本组分。首先是酶-底物复合物的形成，由底物与酶活性位点结合形成。该复合物可以分解成其原始成分。这是第二个基本反应。或者，复合物可以形成产物并回收酶，这是第三个基本反应。

基本反应的动力学由基本速率定律方程给出。速率定律方程根据反应物的浓度和速率常数给出速率。每个基本反应都有一个单独的速率定律方程，具有自己的速率常数。这些方程可以提炼成一个动力学模型，称为 Michaelis-Menten 方程。这给出了根据底物浓度表示的反应速率;这可以通过实验来确定。酶反应的一些一般趋势可以使用 Michaelis-Menten 方程来确定。在高底物浓度下，达到一个饱和点，称为 Vmax。在这里，速率受酶总浓度和酶在给定时间内转化为产物的底物分子数（也称为 kcat）的限制。在 Michaelis-Menten 动力学中，kcat 是控制反应速率的两个常数之一。另一个常数 KM 称为关联常数。KM 也相当于反应速率相当于 Vmax 的一半的浓度。具有较高亲和力的酶将具有较低的 KM 并更快地达到 Vmax，而具有较低亲和力的酶将具有较高的 KM 并且需要更长的时间才能达到 Vmax。了解 kcat 和 KM 可以比较酶。为此，我们使用一个称为酶效率的比率。较高的 kcat 和较低的 KM 会导致更高的效率，而较低的 kcat 和较高的 KM 会导致较低的效率。

用于阐明酶动力学的因素必须通过实验确定。这些分析通常是通过在受控环境中混合酶和底物溶液来进行的。通过测量底物、产品或副产品的浓度随时间的变化进行观察。

浓度随时间的变化用于确定反应速率。为了确定动力学，必须获得多种浓度的速率数据。如果逆初始速率与逆初始浓度的关系图（称为 Lineweaver-Burk 图）是线性的，则反应遵循 Michaelis-Menten 动力学。线的斜率和截距允许确定动力学参数 KM 和 Vmax，然后可用于计算 kcat 和酶效率。

现在已经讨论了酶动力学的原理，让我们看看如何进行典型的酶测定。

在此过程中，展示了比色测定法。?第一步是生成标准曲线，该曲线将吸光度与底物浓度相关联。制备已知浓度的溶液以及对照样品。添加与底物反应的显影液以产生有色化合物。测量吸光度并与浓度作图以生成标准曲线。

为了进行测定，制备已知浓度的底物以及适量的酶。将酶和底物混合并孵育设定的时间间隔。pH 值和温度由缓冲溶液和加热块控制。添加淬灭剂以终止反应。然后将显影液添加到反应中并混合。然后将溶液放入比色皿中并测量吸光度。通过将测得的吸光度与标准曲线进行比较来确定消耗的底物量。使用收集的数据，通过绘制浓度随时间的变化来确定初始反应速率。最后，利用速率数据和浓度，制作 Michaelis-Menten 图。这允许确定酶的动力学特性，例如周转数和酶效率。

现在我们已经回顾了检测程序，让我们看看其他检测方法及其应用。

在此过程中，FRET 分析用于研究蛋白酶水解蛋白质肽键的动力学。可以测量这些排放物，从而对底物消耗和生产进行连续和定量分析，有助于确定反应动力学。

酶测定可用于环境科学，以确定环境中细胞外酶活性的水平。可以从环境中收集水、土壤和沉积物，并在实验室中进行处理。然后可以使用酶测定来表征这些材料的细胞外酶活性。这是了解环境如何处理有机材料的有用工具。

细胞的 DNA 修复机制可以通过研究细胞核中发现的酶的动力学来评估。酶去除 DNA 损伤或损伤的速率可以使用荧光分子信标进行测量，荧光分子信标仅在与独特的 DNA 序列结合时才会发出荧光。通过检测荧光标记的切割产物，可以实时测量 DNA 修复水平。

您刚刚观看了 JoVE 关于酶动力学和检测的视频。该视频解释了酶动力学，介绍了分析概念，介绍了一般程序，并描述了一些应用。

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