Name: 利用荧光排斥法和专用微流控器件对神经元进行高分辨率体积成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: 学习使用PDMS微流控芯片和荧光排斥法对体外神经元进行亚微米级轴向分辨率的全场体积成像技术，以分析神经突触动态结构变化，助力神经生长与退行性疾病研究。

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作者希望感谢都灵理工大学材料与微系统实验室（ChiLab, Materials and Microsystems Laboratory - Politecnico di Torino - DISAT）的 C F Pirri 教授、M Cocuzza 博士和 S L Marasso 博士，感谢他们在工艺开发和器件制备过程中提供的宝贵支持。我们感谢 Quantacell 公司的 Victor Racine 在图像处理方面的讨论与支持。我们感谢居里研究所动物实验中心的 Isabelle Grandjean 和 Manon Chartier 在小鼠实验方面的支持，以及居里研究所的 Pablo Vargas 和 Ana-Maria Lennon 为我们提供表达 GFP LifeAct 的转基因小鼠。我们感谢朗之万研究所的 Olivier Thouvenin，以及居里研究所（UMR 144）的 Clotilde Cadart、Larisa Venkova 和 Matthieu Piel，感谢他们在理解荧光排除法（Fluorescence eXclusion Method）方面提供的帮助。最后，我们感谢皮埃尔-吉勒·德热讷研究所（Institut Pierre-Gilles de Gennes，CNRS UMS 3750）技术平台在微加工方面的支持。本研究部分得到了欧洲研究理事会高级资助（ERC Advanced Grant No. 321107）&#34;CellO,&#34; PSL 大学（SwithNeuroTrails 项目）、法国国家科研署“未来投资计划”（ANR Investissement d'Avenir）、IPGG 实验室卓越计划（Labex）和 Equipex 项目的资助。

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</ol>

作者声明无利益冲突。

由于神经元细胞具有细长的突起，对其进行体积成像对FXm技术而言是一项挑战。本方案描述了专用于神经元成像的同一类型微流控装置的多种变体。
除了微流控设计的各个方面外，物镜的选择对于荧光排阻成像至关重要，并且需要在横向分辨率和图像清晰度之间进行权衡。文献13已表明，当数值孔径（NA）较高，导致焦深小于腔室高度时，只要在焦点处成像，并且在感兴趣对象的轮廓与积分表面边界之间留有足够的余量，就不会影响体积测量的精度。然而，若腔室高度远大于焦深，则会因光子扩散而降低图像清晰度，使感兴趣对象的边缘变得模糊。制造高度为3 µm的腔室可显著减少这种横向模糊，即使使用高数值孔径（0.8）的40倍物镜以实现高横向分辨率观察神经元分支，也能获得极为清晰的荧光排阻图像。
芯片组装是一个关键步骤，特别是对于3 µm高的腔室而言，但按照4.1.2节所述进行仔细操作可避免顶板塌陷。由于这些薄腔室具有较高的表面积与体积比，也引发了葡聚糖浓度随时间变化的稳定性问题。我们已验证，葡聚糖在过夜孵育后的表面吸附可忽略不计：在用PBS替换葡聚糖后，柱状结构与背景之间的强度差值约为存在葡聚糖时两者初始强度对比度的千分之一。需要注意的是，神经元可能既会贴附在底部盖玻片上，也会贴附在PDMS顶板上。使用图案化盖玻片时，该现象会消失。即 当我们不在PDMS腔室内孵育粘附分子时），由于涂层仅严格局限于腔室底部。
除了其复杂的形态外，神经元由于该方法的主要局限性之一，反而较适合进行FXm分析， 即 葡聚糖内吞作用在这些细胞中非常有限。我们选用10 kDa的制剂，以在长时间（数小时）内抑制任何可见的内吞现象。
总之，FXm 的概念简单性伴随着一系列实验问题，而本方案已解决了这些问题，例如纳米级 PDMS 粗糙度和微米级腔室高度，或通过背景校正来修正柱状结构之间 PDMS 顶壁的不平整。然而，使用封闭式微流控腔室来限制荧光介质会带来一些特定限制，例如需要支撑柱，这会降低细胞黏附的有效表面积；以及必须将细胞胞体排除在中央腔室之外，以最清晰地观察神经突起，从而限制了可进行高分辨率观察的细胞区域。该方法的一个可能发展方向是摒弃这种物理限制，转而采用光学限制。未来，光片显微镜的新进展可能会与 FXm 有利地结合使用。

近年来，细胞体积的精确认知受到越来越多的关注，这一研究兴趣源于单细胞微生物中的细胞大小稳态问题1，以及更广泛意义上的有丝分裂细胞中的类似问题2。然而，细胞体积的问题同样适用于终末分化后的细胞，其中神经元即为一个典型的范例。
体积确实是神经元生命过程中不同尺度和时间点上生理与病理事件的重要特征，从与电活动相关的瞬时轴突形变（毫秒级）3，到神经退行性疾病无症状期发生的不可逆神经元肿胀（在人类中可持续数年）4，均体现了这一点。然而，最大幅度的体积变化发生在神经元生长期间，时间尺度为数天至数周（取决于所研究的生物体）。神经元复杂而延伸的形态引发了一系列问题，其中就包括细胞大小的调控。体内轴突的长度和直径受到严格调控，其数值因神经元类型而异5,6。
这些问题错综复杂，难以解决 体内，也可以通过简化的方式解决 体外 为此目的，需采用一种专用于体积测量的方法，其速度足以跟踪生长动态（即 在数分钟的时间尺度内完成，并能够兼容数小时或数天的持续观察。多年来已开发出多种方法，以实现对细胞体积的直接或间接测量 体外共聚焦成像的细胞重建是其中一种方法，但该方法需要进行标记并反复暴露于光照，且轴向分辨率有限，约为500 nm 7需要注意的是，一种更为复杂且近期出现的方法——晶格光片显微镜，在一定程度上克服了上述最后两个缺点。 8原子力显微镜已被用于 9 但这种扫描方法本质上缓慢且繁琐。此外，由于神经元极度柔软，该方法所需的细胞物理接触可能干扰测量结果。 10采用阻抗或共振的间接方法已用于不同类型细胞的研究 11但对于神经元等具有较长黏附性的细胞而言，则显得不足。
最有前景的方法之一是基于测量充满荧光染料的密闭腔室内细胞的排开体积。荧光排阻法（FXm）原理简单，无需标记，适用于对细胞群体进行快速、长期的光学成像，并有望实现亚光学轴向分辨率。更准确地说，z方向的分辨率取决于培养腔室内的最大荧光强度（即无细胞区域）除以相机的动态范围，尽管多种噪声来源限制了这一极限分辨率。该方法在追踪迁移性贴壁细胞的体积变化12，或研究哺乳动物细胞有丝分裂过程中的体积变化方面已表现出强大能力，如文献13中详尽描述。然而，由于神经元具有广泛延伸至亚微米级突起的复杂分支结构，这对FXm构成了方法学上的挑战。
本文介绍一种用于制备光滑FXm腔室的方法，可高精度测量神经元分支以及生长锥等参与神经元生长的动态结构的体积和高度。
为了优化轴向分辨率，腔室的高度应与待测物体相近。因此，我们设计了多种FXm装置，其特征在于具有三种不同高度的中央测量腔室。最薄的一种（高度为3 µm）专用于神经突的测量：这种低高度设计可排除胞体，使其停留在邻近高度约为15 µm的中间腔室内。较厚的中央腔室（10 和 12 µm）则足够高，可用于追踪整个细胞的生长过程。该装置还在中央腔室两侧设有两个储液池。因此共设置了四个注入孔（IH），具体命名如下：入口和出口用于将细胞悬液引入芯片，另外两个则用于向储液池供液。
我们首先利用已知几何结构的光刻胶结构制备了用于高度测量的校准盖玻片。随后，我们对自由生长的神经元以及被微图案化黏附结构在形态上加以限制的神经元进行了成像。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmalab System 100</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td>用于执行DRIE</td></tr><tr><td>MJB4 掩模对准器</td><td>SUSS MicroTec</td><td></td><td>SU-8 光刻</td></tr><tr><td>NXQ 4006 掩模对准器</td><td>Neutronix Quintel</td><td></td><td>与DRIE相关的光刻</td></tr><tr><td>等离子清洗机</td><td>Diener Electronic</td><td>Pico PCCE</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养罩</td><td>ADS Laminaire</td><td>Optimale 12</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Heraeus Multifuge X1R</td><td></td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C 5% CO2 培养箱</td><td>Panasonic</td><td>MCO-170AICUVH-PE IncuSafe CO2 培养箱</td><td></td></tr><tr><td>落射荧光显微镜</td><td>Leica</td><td>DMi8</td><td></td></tr><tr><td>65 至 80 &amp;deg;C 的PDMS烘箱</td><td>Memmert</td><td></td><td></td></tr><tr><td>机械轮廓仪</td><td>Veeco</td><td>Dektak 6M Stylus Profiler</td><td></td></tr><tr><td>光学轮廓仪</td><td>Veeco</td><td>Wyko NT9100</td><td></td></tr><tr><td>真空干燥器</td><td>Verrerie Villeurbanaise (Kartel Labware)</td><td>230KAR</td><td>直径 200 mm</td></tr><tr><td>超声波清洗机</td><td>Labo Moderne</td><td>SHE1000</td><td>清洗槽体积：0.8 升</td></tr><tr><td>加热板</td><td>Stuart SD162</td><td>SD162</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;掩模&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DRIE</td><td></td><td></td><td>补充数据</td></tr><tr><td>Su8 掩模 1</td><td></td><td></td><td>补充数据</td></tr><tr><td>Su8 掩模 2</td><td></td><td></td><td>补充数据</td></tr><tr><td>Su8 掩模 3</td><td></td><td></td><td>补充数据</td></tr><tr><td>S1805 校准条纹</td><td></td><td></td><td>补充数据</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;小型实验设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mm 打孔器</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>29002519 (美国货号)</td><td></td></tr><tr><td>手术刀或剃须刀片</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>9&quot; 带勺不锈钢扁铲</td><td>VWR International</td><td>82027-532</td><td>用于脱模PDMS</td></tr><tr><td>顶部夹持晶圆操作工具</td><td>VWR International</td><td>63042-096</td><td></td></tr><tr><td>弯头镊子</td><td>FST</td><td>Dumont #7 镊子 - 标准 / Dumoxel</td><td>用于操作玻璃盖玻片</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;基底材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>硅片</td><td>Prolog Semicor Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24x24 mm 玻璃盖玻片</td><td>VWR</td><td>631-0127</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;光刻胶及显影剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AZ 1518 正性光刻胶</td><td>Microchemicals GmbH</td><td></td><td>DRIE工艺前使用，厚度为1.8 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>AZ 351B 显影剂</td><td>Microchemicals GmbH</td><td></td><td>用于显影正性AZ 1518光刻胶</td></tr><tr><td>SU-8 2007</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2025</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2050</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PGMA 显影剂</td><td>Technic</td><td></td><td>用于显影SU-8负性光刻胶</td></tr><tr><td>Microposit S1805 光刻胶</td><td>Chimie Tech Services</td><td></td><td>用于获得0.5&amp;micro;m 高的结构的正性光刻胶</td></tr><tr><td>MF 26A 显影剂</td><td>Chimie Tech Services</td><td></td><td>用于显影正性S1805光刻胶</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;实验耗材&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>一次性塑料移液管 3 mL</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P100 培养皿</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>20 mL 注射器</td><td>Terumo</td><td>SS+20ES1</td><td></td></tr><tr><td>透明胶带</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>方形擦拭布</td><td>VWR</td><td>115-2148</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>DUTSCHER</td><td>90260</td><td>塑料石蜡膜</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;化学品&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(3-甲基丙烯酰氧基丙基)三氯硅烷</td><td>abcr</td><td>AB 109004</td><td></td></tr><tr><td>PDMS及固化剂 Sylgard 184</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>761036</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td></td><td>W292907</td><td></td></tr><tr><td>多聚鸟氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957 - 50 mL</td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>Sigma-aldrich</td><td>02865</td><td>99.8%</td></tr><tr><td>3-甲基丙烯酰氧基丙基-三甲氧基硅烷</td><td>Sigma-aldrich</td><td>M6514-25ML</td><td>(C4H5O2)-(CH2)3- Si(OCH3)3</td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Sigma-aldrich</td><td>71251-5ML-F</td><td></td></tr><tr><td>与Alexa488偶联的10kW葡聚糖</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>D22910</td><td>在488 nm处有吸收峰</td></tr><tr><td>与Alexa647偶联的10kW葡聚糖</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>D22914</td><td>在647 nm处有吸收峰</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;培养基&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>21090-022</td><td></td></tr><tr><td>马血清</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax 200 mM</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠 GIBCO 100 mM</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>15710-049</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 10x</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>14180-046</td><td></td></tr><tr><td>Hepes 1M</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59418C-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>不含酚红的Neurobasal</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>12348-017</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab中用于背景归一化的程序</td><td>Quantacell</td><td>联系 Victor Racine：victor.racine@quantacell.com</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>用于选择图像分析的特定感兴趣区域</td></tr><tr><td>程序</td><td>ImageJ</td><td></td><td>补充数据</td></tr><tr><td>程序</td><td>Matlab</td><td></td><td>补充数据</td></tr></tbody></table>

利用荧光排阻法及专用微流控装置实现神经元的高分辨率体积成像

High-resolution Volume Imaging of Neurons by the Use of Fluorescence eXclusion Method and Dedicated Microfluidic Devices

体积是衡量神经元在不同时间尺度下生理与病理特征的重要参数。由于神经元具有高度分支的复杂形态，属于结构独特的细胞类型，因此在体积测量方面带来诸多方法学上的挑战。在特定情况下 体外 神经元生长研究中，所选方法应具备亚微米级轴向分辨率，并能在数分钟至数小时乃至数天的时间尺度上实现全场域观测。与其他方法（如使用共聚焦成像进行细胞形态重建、基于电学的测量或原子力显微镜）相比，近年来发展的荧光排阻法（Fluorescence eXclusion method, FXm）有望满足上述要求。然而，尽管其原理简单，实现用于神经元的高分辨率FXm仍需多项调整并建立专门的方法体系。本文介绍一种结合荧光排阻、低粗糙度多隔室微流控装置以及微图案化技术的方法，以实现 体外 局部神经元体积的测量。该设备提供的高分辨率使我们能够测量神经元突起（neurites）的局部体积，以及参与神经元生长的某些特定结构（如生长锥，GCs）的体积。

第1和第2节所述制备过程的结果由以下图像展示 图1A-1B 以及曲线的 图1C. 表格的 图1D 显示 PDMS 芯片两个不同代表性区域的粗糙度值， 即 在中央和 20 µm 高阶中间腔室。通过使用蚀刻硅片替代SU-8光刻胶，表面粗糙度降低了约7倍。随后，FXm首先应用于几何尺寸已知的光刻胶条带上图2A）内 10 µm 高腔室。经过图像处理和强度到高度的转换后（见下图） 图2B），沿此条带横截面进行的FXm分析谱图（图2C) 提供所需的高度轮廓（图 2D). 图 2D 展示了使用机械轮廓测量法与FXm方法获得的轮廓之间的比较。这些轮廓（包括边缘和平台值）非常相似，验证了该方法的可靠性。需要注意的是，FXm数据的散射并不反映该方法的最终分辨率，这一点将在后续评估中进一步说明 图3 和 图4，但这是由于采用了较低的激发强度，以避免光刻胶在GFP通道中可能产生的极微弱自发荧光效应。
然后，我们观察了神经突 3 µm 和 10 µm 高腔室（图3）。经强度到高度转换及背景校正后，背景噪声的标准差约为18 nm。该值略高于以硅表面为模板制备的PDMS表面的物理粗糙度（12 nm，见下表 图1D）但远低于在SU-8模具制备的PDMS上测得的粗糙度。这些结果凸显了在硅片上钻孔制备微井相较于在SU-8光刻胶上开孔制备微柱的显著优势。如此低的粗糙度值可实现高信噪比，从而获得清晰的三维图像，如图中所示。 图3A. 作为可从此类图像中获取数据的一个示例，我们计算了体积 1.6 µm (即 10像素）宽的神经突切片（见下图的曲线图） 图3B）。在初步近似下，对这些数据进行线性拟合，得到平均神经突高度值约为 400 nm，可与之相比 例如 在10日龄幼鼠胼胝体中发现的500 nm轴突直径 5我们还将FXm与由连续相邻的黏附微图案结合使用 2 µm 和 6 µm 宽条带 30 µm 长度。我们的目标是研究神经突宽度对其三维形态的影响。 图3C 显示了一个以假彩色呈现的完整神经元图像的三维表示 10 µm 高室。神经突在 2 µm 和 6 µm 宽条纹，而细胞体位于最宽条纹的一端。在三个不同的横截面中绘制了高度轮廓图。与图中所示结果一致 图3A，横截面所积分的表面积随神经突的宽度增加而增大（图3D).
我们还重点关注了生长锥（GC）的三维结构。 图 4A-B 显示在不同条件下获得的两个不同GC谱图 3 µm 高腔室，突出显示其分支状亚结构。此外，我们进行了延时实验，以追踪生发中心（GCs）体积的动态变化 12 µm 高室 图 4C 在数十分钟的时间尺度内，表现出特定生长锥（GC）的收缩与再激活循环。得益于GFP-lifeact小鼠的使用，生长锥因其富含肌动蛋白而在GFP发射波长（510 nm）处被定位。通过该波长识别出的表面用于对647 nm处的葡聚糖发射波长进行积分，以计算生长锥体积。 图4D 最终显示了三个不同神经元上不同时间点和位置的GC体积分布，其中心值约为 6 µm3.
<img alt="微流控芯片制备；PDMS光刻；高度轮廓图；三维表面分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：FXm PDMS腔室。 (A) 微加工四个主要步骤的示意图，最终形成模具。图中显示了入口、出口和储液池的位置。比例尺：1 mm。(B) 使用光学轮廓仪获得的PDMS FXm腔室图像。该图像显示了中央腔室，内含3排高度为10 µm的柱状结构，以及高度分别为20、50和90 µm的中间腔室。比例尺：500 µm。 (C) 沿(B)图中两条虚线的芯片横截面视图。黄色/金色：沿柱状结构的横截面；蓝色：柱间区域的横截面。 (D) 在硅片上以及20 µm高的SU-8中间腔室上成型的50 × 50 µm2区域测得的PDMS表面粗糙度平均值（箭头指示这些区域的位置）。平均值来自三个不同区域的测量结果。 <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig1v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="使用强度和高度图进行表面轮廓分析和数据拟合的光学显微镜分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：使用光刻胶条带作为目标物体对 FXm 方法进行校准。 (A) 在充满 1 mg/mL 浓度、分子量为 10,000 的在 488 nm 处吸收的葡聚糖溶液的 10 µm 高腔室中，使用干式 40X NA 0.8 物镜拍摄的 GFP 荧光图像。（B：背景，P：支柱）。比例尺：50 µm。 (B) 根据 (A) 中两个彩色矩形区域的平均强度获得的线性校准曲线。 (C) 沿 (A) 中蓝色虚线位置测得的荧光强度分布图，穿过光刻胶条带（0.45 µm 高的正性光刻胶）。 (D) 机械轮廓仪测得的轮廓（黑点）与将 (B) 数据经强度-高度转换后由 FXm 获得的轮廓（蓝点）的比较。 <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显微镜示意图显示细胞结构、数据分析图、三维图及体积-宽度相关性" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：神经突体积成像。 （A） 神经突延伸至中枢 3 µm 高室位于下一个胞体所在的位置 15 µm 中间室。使用在488 nm处吸收的10,000 MW葡聚糖进行成像，物镜为40倍、数值孔径0.8的干式物镜。插图经背景消减程序处理后获得，突出了两条神经突，并用于绘制右侧的图表。比例尺： 30 µm. (B) 神经突切片体积随神经突宽度的变化关系，数据来自22个轮廓（基于10个像素的平均值） 即 在 1.6 µm “神经突片段”（如图A所示）。实线代表斜率的线性拟合 0.4 µm 通过原点。 (C) 在由连续粘附条带构成的图案化神经元的伪彩色图像 2 µm 和 6 µm 宽桩（以白色表示）。测量在 a 中进行 10 µm 高浓度腔室中充满在647 nm处有吸收的10,000 MW葡聚糖，使用40倍NA 0.8干式物镜。 (D) 与 (C) 中所示彩色虚线相对应的高度轮廓，颜色编码保持一致。 <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="神经突形态的图分析；显微镜图像、高度与距离曲线图、生长锥体积。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 4"> 
图 4：静态与动态生长锥成像。 (A-B) 在高度为 3 µm 的腔室中，沿相关图像中黄色线条所示位置进行强度到高度转换后获得的生长锥高度分布图。实验采用在 488 nm 处吸收的 10,000 MW 葡聚糖填充腔室，并使用 40X、NA 0.8 的干式物镜进行观察。 (C) 在高度为 12 µm 的腔室中，填充在 647 nm 处吸收的 10,000 MW 葡聚糖，对完整神经元进行成像。实验在两个荧光通道中进行观察：GFP 通道用于定位生长锥（黄色虚线），CY5 通道用于通过荧光排阻法计算生长锥（GC）体积。以黄色虚线所包围的区域用于计算 GC 体积。图中显示了 GC 体积随时间的变化，以及在两个代表性时间点 GFP 和 CY5 通道中的相应形态。所有数据均使用 40x NA 0.8 干式物镜每 3 分钟采集一次。比例尺：10 µm。 <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>步骤</td>
			<td>掩模 1：8 µm 层</td>
			<td>掩模 2：30 µm 层</td>
			<td>掩模 3：40 µm 层</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 类型</td>
			<td>2007</td>
			<td>2025</td>
			<td>2050</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>旋涂</td>
			<td>30 秒 @ 2000 转/分钟</td>
			<td>30 秒 @ 3050 转/分钟</td>
			<td>30 秒 @ 3250 转/分钟</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>前烘</td>
			<td>3 分钟 @ 95 °C</td>
			<td>2 分钟 @ 65 °C + 6 分钟 @ 95 °C</td>
			<td>3 分钟 @ 65 °C + 7 分钟 @ 95 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>曝光能量</td>
			<td>110 mJ/cm2</td>
			<td>155 mJ/cm2</td>
			<td>170 mJ/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>曝光后烘烤</td>
			<td>4 分钟 @ 95 °C</td>
			<td>1 分钟 @ 65 °C + 6 分钟 @ 95 °C</td>
			<td>2 分钟 @ 65 °C + 7 分钟 @ 95 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>显影</td>
			<td>2 分 30 秒</td>
			<td>5 分钟</td>
			<td>6 分钟</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>坚膜烘烤（可选）</td>
			<td>3–5 分钟 @ 200 °C</td>
			<td>3–5 分钟 @ 200 °C</td>
			<td>3–5 分钟 @ 200 °C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：用于构建包含12 μm高度中央腔室的装置的光刻步骤。 中间腔室的高度：20、50 和 90 µm。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>步骤</td>
			<td>掩模 1：10 µm 层</td>
			<td>掩模 2：30 µm 层</td>
			<td>掩模 3：40 µm 层</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 类型</td>
			<td>2007</td>
			<td>2025</td>
			<td>2050</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>旋涂</td>
			<td>30 秒 @ 1500 rpm</td>
			<td>30 秒 @ 3050 rpm</td>
			<td>30 秒 @ 3250 rpm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>前烘</td>
			<td>3 分钟 @ 95 °C</td>
			<td>2 分钟 @ 65 °C + 6 分钟 @ 95 °C</td>
			<td>3 分钟 @ 65 °C + 7 分钟 @ 95 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>曝光能量</td>
			<td>125 mJ/cm2</td>
			<td>155 mJ/cm2</td>
			<td>170 mJ/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>曝光后烘烤</td>
			<td>4 分钟 @ 95 °C</td>
			<td>1 分钟 @ 65 °C + 6 分钟 @ 95 °C</td>
			<td>2 分钟 @ 65 °C + 7 分钟 @ 95 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>显影</td>
			<td>2 分 30 秒</td>
			<td>5 分钟</td>
			<td>6 分钟</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>坚膜烘烤（可选）</td>
			<td>3–5 分钟 @ 200 °C</td>
			<td>3–5 分钟 @ 200 °C</td>
			<td>3–5 分钟 @ 200 °C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：用于构建包含10 μm 高中央腔室的装置的光刻步骤。 中间腔室的高度：20、50 和 90 µm。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>步骤</td>
			<td>掩模 1：12 µm 层</td>
			<td>掩模 2：32 µm 层</td>
			<td>掩模 3：40 µm 层</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 类型</td>
			<td>2015</td>
			<td>2025</td>
			<td>2050</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>旋涂</td>
			<td>30 秒 @ 3250 rpm</td>
			<td>30 秒 @ 2500 rpm</td>
			<td>30 秒 @ 3250 rpm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>前烘</td>
			<td>3 分钟 @ 95 °C</td>
			<td>2 分钟 @ 65 °C + 5 分钟 @ 95 °C</td>
			<td>3 分钟 @ 65 °C + 7 分钟 @ 95 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>曝光时间</td>
			<td>140 mJ/cm2</td>
			<td>157 mJ/cm2</td>
			<td>170 mJ/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>曝光后烘烤</td>
			<td>4 分钟 @ 95 °C</td>
			<td>1 分钟 @ 65 °C + 5 分钟 @ 95 °C</td>
			<td>2 分钟 @ 65 °C + 7 分钟 @ 95 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>显影</td>
			<td>3 分钟</td>
			<td>5 分钟</td>
			<td>6 分钟</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>坚膜烘烤（可选）</td>
			<td>3–5 分钟 @ 200 °C</td>
			<td>3–5 分钟 @ 200 °C</td>
			<td>3–5 分钟 @ 200 °C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3：用于构建包含3 μm高中央腔室的装置的光刻步骤。 中间腔室的高度：18、50 和 90 µm。
补充数据 1：masks_neuron_volume_chips.tiff。用于制备 PDMS 装置的掩模示意图（DRIE 掩模及掩模 1-3）。<a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56923/masks_neuron_volume_chips.tiff">请点击此处下载该文件。</a>
补充数据 2： 文件“masks_neuron_volume_chips.dxf”。该电子文件可用于制备 DRIE 掩模以及掩模 1-3。<a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56923/masks_neuron_volume_chips.dxf">请点击此处下载该文件。</a>
补充数据 3：“Mask_Photoresist-stripes.dxf”。用于制备光刻胶条纹光刻所用掩模的电子文件。<a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56923/Mask_Photoresist-stripes.dxf">请点击此处下载该文件</a>
补充数据 4： 文件 conversion_mattotiff.m <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56923/conversion_mattotiff.m">请点击此处下载该文件。</a>
补充数据 5： 文件 importfilevol.m <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56923/importfilevol.m">请点击此处下载该文件。</a>

体积是反映细胞生理与病理特征的重要参数。我们介绍一种荧光排阻法，可实现全场范围的体积测量 体外 具有亚微米级轴向分辨率的神经元体积成像，可用于分析神经突及参与神经元生长的动态结构。

体积是反映神经元在不同时间尺度下生理与病理特征的重要参数。神经元具有相当独特的...

本实验的总体目标是实现对体外神经元体积的全场测量，具备亚微米级轴向分辨率，从而满足对参与神经元生长的动态结构中神经突进行分析的需求。该方法有助于回答细胞神经科学领域中的关键问题，即在非生长状态或轴突退变过程中，亚细胞尺度下体积变化的动力学特征。该技术的主要优势在于，它结合了亚微米级轴向分辨率、全场观测能力以及数小时至数天的时间尺度。开始实验操作时，在化学通风橱内向PDMS块上倒入异丙醇以脱模。接着，将其放置在通风橱的不锈钢台面上。沿硅胶晶圆周围进行切割，并将PDMS复制品脱模。然后，使用手术刀或剃刀刀片沿芯片周围切割，并留出两毫米的边缘。通过用力按压直径为1.5毫米的打孔器并启动，以切割并雕刻出入口孔。在芯片上用于注入液体的四个指定区域进行相同的打孔操作。随后，将胶带粘贴在微结构化表面并撕下，以清洁芯片。在芯片两侧撒上异丙醇。然后，使用气吹枪通入加压氮气将芯片吹干。在此步骤中，将每张盖玻片放置于洁净室环境中的旋涂仪上。滴加一滴正性光刻胶，覆盖约75%的盖玻片表面，以4000 rpm旋涂30秒，最终获得0.45 µm的厚度。随后将盖玻片置于表面温度为115 °C的热板上加热1分钟。使用掩模对准器，根据制造商参数，通过专用掩模在435纳米波长下照射每张盖玻片。接着，准备两个玻璃结晶皿，一个装入未稀释的显影液，另一个装入去离子水。将盖玻片逐张浸入显影液中，持续轻轻搅拌结晶皿，处理一分钟。然后，将硅片浸入去离子水中约五秒钟。将硅片转移至吸水纸上，并使用压缩氮气枪吹干。将PDMS芯片及其将要键合的玻璃皿一同放入等离子体腔室中进行表面活化。接下来，在一块矩形的厚显微镜玻璃载片上滴加一滴水，并通过毛细作用将盖玻片粘附在玻璃载片上。在显微镜下，标记光刻胶条纹在玻璃载片背面的位置。将带有图案的玻璃盖玻片放置在光刻对准仪的掩模固定架上。依靠标记来居中光刻胶参考物。为了增强光学对比度，在PDMS芯片下方放置一片硅片。在对准过程中，硅片应牢固地固定在卡盘上。然后，将PDMS芯片放置在光刻对准仪的可移动基底支架上。接着，将吸盘抬升至足以观察芯片以及位于盖玻片上的光刻胶条阵列的位置，同时确保尚未发生机械接触。通过对准，继续抬升吸盘，直至PDMS微柱表面与玻璃盖玻片接触，实现芯片与盖玻片之间的机械接触。随后，降低卡盘。将与芯片键合的盖玻片从掩模 holder 上取下。然后，将装置放入一个 35 毫米的培养皿中，并将整个装置转移至烘箱中加热 5 到 10 分钟，以增强键合强度。在结合后30分钟，将装有PLO溶液的10微升移液器吸头置于入口处，然后加样至顶部形成液滴。在出口和储液池处重复相同操作。随后，在培养皿中的芯片周围加入 PBS。用石蜡膜密封培养皿，并在室温下孵育至少五小时。然后，将10 µL吸头尖端轻轻插入每个注射孔中，吸去多余液体。接下来，用培养基替换PLO以及芯片周围的PBS。随后，将芯片置于温度为37摄氏度、含5%二氧化碳的培养箱中孵育，直至神经元贴壁，孵育时间至少为五小时。在此步骤中，从芯片中吸出培养基。吸取两到三微升（µL）新鲜重悬的细胞溶液，注入入口处。立即在出口处重复相同操作。在每个储液池中注入大致相同体积的培养基。在显微镜下快速观察芯片，以检查细胞密度。最佳细胞密度的数量级约为四个支柱所限定的方形区域内有5至10个细胞。重复注入0.5至1微升细胞悬液的操作，直至达到目标细胞密度。进行成像时，将培养基更换为成像介质。然后将芯片置于落射荧光显微镜下。对于延时实验，需获取从单次到多次连续的细胞图像。此处展示的是校准光刻胶条带和神经元的代表性观察结果。这些物体的高倍图像和横截面显示在右侧。此处展示了典型的神经突以及一个高为三微米的中央腔室。神经突切片的体积可作为神经突宽度的函数进行计算。此处为具有代表性的生长锥以及一个高3微米的中央腔室。其亚结构可从约20纳米的光学背景噪声中清晰显现。通过延时观察接种于12微米高腔室中的活体神经元，可追踪生长锥在数十分钟时间尺度内的收缩与再激活循环。在尝试此操作时，必须能够使用深离子刻蚀设备来制备硅模具。观看本视频后，您应能充分理解如何将结构化玻璃盖玻片与PDMS芯片进行对准。一旦掌握，该技术可重复应用于三维神经结构的定量分析。该技术为药理学领域的研究人员探索各种药物在真实口径的闭合锥形条件下的效应铺平了道路。请务必注意，操作原代神经元时需格外小心，以避免污染和破碎。更换培养基时，务必轻柔快速，以尽量减少细胞在培养箱外停留的时间。

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