利用荧光排阻法及专用微流控装置实现神经元的高分辨率体积成像

本实验的总体目标是实现对体外神经元体积的全场测量，具备亚微米级轴向分辨率，从而满足对参与神经元生长的动态结构中神经突进行分析的需求。该方法有助于回答细胞神经科学领域中的关键问题，即在非生长状态或轴突退变过程中，亚细胞尺度下体积变化的动力学特征。该技术的主要优势在于，它结合了亚微米级轴向分辨率、全场观测能力以及数小时至数天的时间尺度。

开始实验操作时，在化学通风橱内向PDMS块上倒入异丙醇以脱模。接着，将其放置在通风橱的不锈钢台面上。沿硅胶晶圆周围进行切割，并将PDMS复制品脱模。

然后，使用手术刀或剃刀刀片沿芯片周围切割，并留出两毫米的边缘。通过用力按压直径为1.5毫米的打孔器并启动，以切割并雕刻出入口孔。在芯片上用于注入液体的四个指定区域进行相同的打孔操作。

随后，将胶带粘贴在微结构化表面并撕下，以清洁芯片。在芯片两侧撒上异丙醇。然后，使用气吹枪通入加压氮气将芯片吹干。

在此步骤中，将每张盖玻片放置于洁净室环境中的旋涂仪上。滴加一滴正性光刻胶，覆盖约75%的盖玻片表面，以4000 rpm旋涂30秒，最终获得0.45 µm的厚度。随后将盖玻片置于表面温度为115 °C的热板上加热1分钟。

使用掩模对准器，根据制造商参数，通过专用掩模在435纳米波长下照射每张盖玻片。接着，准备两个玻璃结晶皿，一个装入未稀释的显影液，另一个装入去离子水。将盖玻片逐张浸入显影液中，持续轻轻搅拌结晶皿，处理一分钟。

然后，将硅片浸入去离子水中约五秒钟。将硅片转移至吸水纸上，并使用压缩氮气枪吹干。将PDMS芯片及其将要键合的玻璃皿一同放入等离子体腔室中进行表面活化。

接下来，在一块矩形的厚显微镜玻璃载片上滴加一滴水，并通过毛细作用将盖玻片粘附在玻璃载片上。在显微镜下，标记光刻胶条纹在玻璃载片背面的位置。将带有图案的玻璃盖玻片放置在光刻对准仪的掩模固定架上。

依靠标记来居中光刻胶参考物。为了增强光学对比度，在PDMS芯片下方放置一片硅片。在对准过程中，硅片应牢固地固定在卡盘上。

然后，将PDMS芯片放置在光刻对准仪的可移动基底支架上。接着，将吸盘抬升至足以观察芯片以及位于盖玻片上的光刻胶条阵列的位置，同时确保尚未发生机械接触。通过对准，继续抬升吸盘，直至PDMS微柱表面与玻璃盖玻片接触，实现芯片与盖玻片之间的机械接触。

随后，降低卡盘。将与芯片键合的盖玻片从掩模 holder 上取下。然后，将装置放入一个 35 毫米的培养皿中，并将整个装置转移至烘箱中加热 5 到 10 分钟，以增强键合强度。

在结合后30分钟，将装有PLO溶液的10微升移液器吸头置于入口处，然后加样至顶部形成液滴。在出口和储液池处重复相同操作。

随后，在培养皿中的芯片周围加入 PBS。用石蜡膜密封培养皿，并在室温下孵育至少五小时。然后，将10 µL吸头尖端轻轻插入每个注射孔中，吸去多余液体。

接下来，用培养基替换PLO以及芯片周围的PBS。随后，将芯片置于温度为37摄氏度、含5%二氧化碳的培养箱中孵育，直至神经元贴壁，孵育时间至少为五小时。在此步骤中，从芯片中吸出培养基。

吸取两到三微升（µL）新鲜重悬的细胞溶液，注入入口处。立即在出口处重复相同操作。在每个储液池中注入大致相同体积的培养基。

在显微镜下快速观察芯片，以检查细胞密度。最佳细胞密度的数量级约为四个支柱所限定的方形区域内有5至10个细胞。重复注入0.5至1微升细胞悬液的操作，直至达到目标细胞密度。

进行成像时，将培养基更换为成像介质。然后将芯片置于落射荧光显微镜下。对于延时实验，需获取从单次到多次连续的细胞图像。

此处展示的是校准光刻胶条带和神经元的代表性观察结果。这些物体的高倍图像和横截面显示在右侧。此处展示了典型的神经突以及一个高为三微米的中央腔室。

神经突切片的体积可作为神经突宽度的函数进行计算。此处为具有代表性的生长锥以及一个高3微米的中央腔室。其亚结构可从约20纳米的光学背景噪声中清晰显现。

通过延时观察接种于12微米高腔室中的活体神经元，可追踪生长锥在数十分钟时间尺度内的收缩与再激活循环。在尝试此操作时，必须能够使用深离子刻蚀设备来制备硅模具。观看本视频后，您应能充分理解如何将结构化玻璃盖玻片与PDMS芯片进行对准。

一旦掌握，该技术可重复应用于三维神经结构的定量分析。该技术为药理学领域的研究人员探索各种药物在真实口径的闭合锥形条件下的效应铺平了道路。请务必注意，操作原代神经元时需格外小心，以避免污染和破碎。

更换培养基时，务必轻柔快速，以尽量减少细胞在培养箱外停留的时间。