Name: 胎儿和成人心脏组织外植体作为三维体外研究平台的可比较去角质 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: 了解胎儿与成人心脏组织的标准化去细胞化方法，用于三维体外研究平台比较分析。该技术保留细胞外基质结构，助力心血管发育生物学与再生医学研究。

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作者感谢Pinto-do-Ó实验室所有成员提出的富有价值的批评性讨论。本工作由麻省理工学院-科学技术基金会（FCT）项目资助 &#34;CARDIOSTEM—用于心血管应用的工程化心脏组织与干细胞疗法&#34; （MITP-TB/ECE/0013/2013）。A.C.S. 获得葡萄牙科技基金会（FCT）奖学金 [SFRH/BD/88780/2012]，M.J.O. 为 FCT 研究员（FCT-Investigator 2012）。

所有所述方法均经i3S动物伦理委员会和葡萄牙兽医总局（DGAV）批准，符合欧洲议会指令2010/63/EU的规定。
1. 脱细胞溶液的制备
注意：所有脱细胞溶液均应通过 0.22 μm 滤膜过滤，并最多保存 3 个月，除非另有说明。
<ol>
	<li>配制1× PBS：将8 g NaCl、1.01 g Na2HPO4&#160;200&#160;mg KCl和200&#160;mg KH2PO4溶于900 mL去离子水（DI水）中。调节溶液pH至7.5，并定容至1 L。过滤、高压灭菌后，室温（RT）保存。</li>
	<li>配制低渗缓冲液（10 mM Tris，0.1% EDTA）：将1.21 g TrisBASE和1 g EDTA溶于900 mL去离子水中。用NaOH/HCl调节溶液pH至7.8，并定容至1 L。过滤、高压灭菌后，室温保存。</li>
	<li>配制0.2% SDS溶液（0.2% SDS，10 mM Tris）：将0.6 g TrisBASE和1 g十二烷基硫酸钠（SDS）加入400 mL去离子水中，于60 °C搅拌至溶质完全溶解。待溶液冷却至室温。调节溶液pH至7.8，并定容至500 mL。通过过滤对溶液进行灭菌。 
	注意：SDS溶液应在使用前配制。仅在SDS完全溶解后进行过滤，否则未溶解的SDS颗粒会堵塞滤膜，改变最终SDS浓度，从而影响组织脱细胞效率。</li>
	<li>配制低渗洗涤缓冲液（10 mM Tris）：将1.21 g TrisBASE溶于900 mL去离子水中。调节溶液pH至7.8，并定容至1 L。过滤、高压灭菌后，室温保存。</li>
	<li>配制DNase处理液（20 mM Tris，2 mM MgCl2，50 U/mL DNase）：将2.42 g TrisBASE和2 mL 1 M MgCl2溶于900 mL去离子水中。调节pH至7.8，并定容至1 L。过滤后高压灭菌。溶液室温保存。使用前加入DNase I（50 U/mL）。</li>
	<li>配制DNase I储存液：配制含50%甘油、20 mM Tris-HCl（pH 7.5）、1 mM MgCl2的DNase缓冲液，用去离子水定容至10 mL。在超净工作台中，将DNase I粉末加入DNase缓冲液中，轻轻混匀至完全溶解。经0.22 μm滤膜过滤灭菌。分装为1 mL每份，-20 °C保存。</li>
</ol>
2. 组织采集与冷冻保存
<ol>
	<li>在妊娠18天（E18胚胎）时，通过CO2窒息法处死成年怀孕雌鼠。使用手术剪进行剖腹产手术，用两把带锯齿、弯曲尖头的镊子（每只子宫角末端各一把）将带有胎鼠的子宫角取出，并置于含冰上预冷的1×PBS的培养皿中。
	<ol>
		<li>切开子宫角和羊膜囊以分离胎鼠。将胎鼠转移至另一含有冰上预冷的1×PBS的新培养皿中以进行麻醉，随后用剪刀断头处死。</li>
		<li>使用CO2窒息法处死7-8周龄的雄性C57BL/6小鼠。对每只小鼠胸部做切口并取出心脏。</li>
		<li>用冰上预冷的1×PBS短暂冲洗胎儿和成年小鼠的心脏。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>借助解剖刀去除成年心脏的心房组织。在右心室做切口，并用直头小剪刀将其切除。去除室间隔以暴露左心室内壁。在新的培养皿中，使用解剖刀和带锯齿、弯曲尖头的镊子将左心室游离壁切成厚度约为2 mm的纵向条状，并去除乳头肌。
	<ol>
		<li>借助解剖刀，按照2 mm × 2 mm的网格划分切取小块组织外植体（详见补充图15中的详细说明）。用1×PBS短暂冲洗组织外植体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向已灭菌的1.5 mL离心管中加入约250 µL的包埋剂（OCT）。将完整胎儿心脏和成年心脏组织外植体转移至含有250 µL OCT的离心管中，用干冰冷却的异戊烷速冻后，于-80 °C保存（最长不超过6个月）。 
	注意：冷冻保存超过6个月的心脏组织外植体会显著降低脱细胞效率，尤其是成年心脏组织外植体。</li>
</ol>
3. 组织脱细胞
注意：心脏组织脱细胞在24孔细胞培养板中进行，每孔放置一个样本。每个孔中加入1 mL相应的脱细胞溶液。除非另有说明，所有脱细胞步骤均需在25 °C条件下以165 rpm（轨道直径为20 mm的培养箱摇床）振荡进行。更多细节请参见图1A所示方案。两性霉素B（例如 fungizone）和庆大霉素在使用前需新鲜加入所有脱细胞溶液中，终浓度分别为2.5 μg/mL和0.01 μg/mL。为了定量脱细胞组织中残留的DNA含量，在开始脱细胞方案前需测定样本质量。DNA定量方案详见第5.1节。
<ol>
	<li>第1天
	<ol>
		<li>从-80 °C冰箱中取出组织样本，将1.5 mL微量离心管置于室温，直至OCT包埋剂部分融化。用镊子将仍处于冻结状态的OCT包埋的心脏组织块转移至含有1x PBS的培养皿中。</li>
		<li>OCT完全融化后，将心脏组织转移至另一个含有1x PBS的新培养皿中。在1x PBS中以60 rpm振荡洗涤10–15分钟，重复至少两次。</li>
		<li>向无菌24孔细胞培养板的每孔加入1 mL工作浓度的低渗缓冲液。用镊子将每个样本转移至单独一孔中。</li>
		<li>将含有样本的24孔细胞培养板置于25 °C的摇床培养箱中，开始用低渗缓冲液孵育18小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第2天
	<ol>
		<li>按照第1.3节所述方法配制0.2% SDS溶液。</li>
		<li>吸除低渗缓冲液，用1x PBS洗涤样本1小时，重复3次。 
		注意：暂停点：脱细胞过程中的组织可在4 °C静态条件下保存于1x PBS中达18小时。</li>
		<li>移除1x PBS，每孔加入1 mL新配制的SDS溶液（步骤1.3），37 °C孵育24小时。 
		注意：（检查点）SDS处理后，应确保样本呈现白色至半透明外观。此阶段经SDS处理的样本富含DNA，呈凝胶状质地。移除SDS溶液时应缓慢操作，避免样本黏附于移液器吸头。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第3天
	<ol>
		<li>用低渗洗涤缓冲液（每孔1 mL）洗涤样本20分钟，重复3次。 
		注意：此步骤中由于细胞残余物被清除，样本体积减小属正常现象。暂停点：脱细胞过程中的组织可在4 °C静态条件下保存于低渗洗涤缓冲液中达18小时。</li>
		<li>每孔加入1 mL DNase处理液，37 °C孵育3小时。</li>
		<li>吸除DNase处理液，用1x PBS（每孔1 mL）洗涤样本20分钟，重复3次。最后在室温下用1x PBS（每孔1 mL）进行过夜洗涤，并以60 rpm振荡。&#160;</li>
		<li>（检查点）DNase处理后，应确认脱细胞样本已失去凝胶状质地。 
		注意：DNase处理后，更换1x PBS时应轻柔操作，因样本易被移液器吸头捕获或黏附。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 脱细胞组织细胞去除效果的评估
<ol>
	<li>在24孔组织培养板中固定样本，每孔放置1个样本，加入1 mL新配制的含0.03%水溶性伊红的10%中性缓冲福尔马林溶液，在室温下固定2.5–3小时。 
	注意：在固定液中加入伊红可对脱细胞组织进行染色，便于切片和组织学染色过程中观察样本。伊红的添加不会干扰后续的组织学染色或免疫荧光技术。也可选择在4 °C下过夜固定。</li>
	<li>移除固定液，加入1 mL 1× PBS洗涤样本。</li>
	<li>根据制造商说明书，使用一次性乙烯基标本模具将固定的生物支架包埋于组织学处理凝胶中。</li>
	<li>将含有样本的组织学凝胶从模具中取出，并转移至带盖的活检处理/包埋盒中。 
	注意：除使用组织学处理凝胶包埋外，另一种方法是将每个样本置于两个具有小孔的活检海绵中进行处理。样本应位于活检海绵中央，以利于后续识别。需注意的是，部分样本采用此方法可能难以定位。</li>
	<li>将样本进行石蜡包埋处理，依次在不同浓度酒精（70%、80%、90%、100%、100%）中孵育（每种溶液30分钟），随后在异链烷烃溶液中孵育（两个步骤），最后在石蜡中孵育（两个步骤），温度均为56 °C。</li>
	<li>将样本包埋于石蜡块中。</li>
	<li>使用切片机切割3 μm厚的石蜡切片，并将切片收集到载玻片上。</li>
	<li>在37 °C下过夜干燥石蜡切片。 
	注意：（暂停点）石蜡切片可在4 °C保存，待后续使用。</li>
	<li>为验证脱细胞方案的效率，按照制造商说明书对脱细胞样本切片及未经处理的组织切片进行苏木精-伊红（H&amp;#38;E）染色和马松三色（MT）染色。 
	注意：H&amp;#38;E染色使细胞核呈蓝/紫色，细胞质呈深粉/红色，胶原呈浅粉色；MT染色使细胞核呈黑色，细胞质呈红色，胶原和黏蛋白呈蓝色。当观察到无细胞核染色，且呈现多孔的浅粉色（H&amp;#38;E、MT染色）和蓝色（MT染色）网状结构时，表明脱细胞效果良好。</li>
</ol>
5. 脱细胞组织中细胞核物质去除效果的评估
注意：脱细胞组织上的DNA含量定量必须与相应的未经处理的组织进行比较。
<ol>
	<li>脱细胞处理前，使用高精度电子天平称量一个1.5 mL微量离心管的重量。将心脏组织转移至该管中，去除多余的1×PBS，然后称量装有样品的离心管总重。计算样品的湿重： 
	样品湿重 = 含样品管重量 – 空管重量</li>
	<li>按照步骤3所述方法对样品进行脱细胞处理。</li>
	<li>脱细胞处理后，将脱细胞组织收集至微量离心管中。
	<ol>
		<li>由于单个心脏样品尺寸小、质量轻，且受试剂盒规格限制，需将每种实验条件下的脱细胞组织合并（胎儿心脏：5个完整心脏；成年左心室组织块：15个组织块）。对未处理组织执行相同操作。 
		注：（暂停点）样品可在-20 °C保存，直至进行DNA提取与定量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在洁净的培养皿中，使用手术刀将未处理和脱细胞处理的组织切成小块。 
	注：每个样品应使用独立的手术刀和培养皿。通过手术刀对样品进行机械破碎，有助于后续的酶消化及DNA提取。</li>
	<li>根据制造商说明书，采用离心柱法进行DNA提取。
	<ol>
		<li>使用宽口移液器吸头，按照制造商说明书，用主消化缓冲液（消化缓冲液和蛋白酶K）将培养皿中机械解离的样品收集起来。 
		注：脱细胞样品经蛋白酶K消化后的组织裂解速度更快。若需同时处理多个样品，应在所有样品完成裂解前将其置于冰上，以减少降解。组织完全裂解通常需要4–6小时。</li>
		<li>按照制造商说明书继续操作。</li>
		<li>为提高脱细胞和未脱细胞组织样品的DNA提取得率，分别使用25–50 μL和100 μL洗脱缓冲液进行DNA洗脱。收集洗脱液并加载至离心柱中，在室温孵育1分钟，然后按照制造商说明书进行离心。 
		注：（暂停点）提取的DNA可在-20 °C保存，以备后续使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据制造商说明书，使用荧光双链DNA检测试剂盒对提取的DNA进行定量。</li>
	<li>将DNA含量标准化为每毫克初始样品湿重（脱细胞前）所含的DNA纳克数（ng DNA/mg 初始湿重）。</li>
</ol>
6. 脱细胞支架的细胞接种
注意：所有溶液/试剂均需无菌，且整个操作过程需在无菌条件下进行。
<ol>
	<li>配制含 2.5 μg/mL 两性霉素 B 和 1% 青霉素/链霉素（青霉素 100 I.U.；链霉素 100 µg/mL）的 1x DPBS 溶液。</li>
	<li>移除脱细胞化洗涤最后一步（步骤 3.3.3）中的 1x PBS 溶液，每孔加入 500 μL 新鲜配制的含 2.5 μg/mL 两性霉素 B 和 1% 青霉素/链霉素的 1x DPBS 溶液。将样品在 4 °C 条件下保存 1–7 天。 
	注意：在 4 °C 条件下保存样品对于维持无菌状态至关重要。</li>
	<li>将青霉素/链霉素加入细胞基础培养基（不含 FBS 和其他添加剂）中，使其终浓度为 1%。</li>
	<li>吸除脱细胞化样品中的含 2.5 μg/mL 两性霉素 B 和 1% 青霉素/链霉素的 1x DPBS 溶液。每孔加入 500 μL 含 1% 青霉素/链霉素的细胞基础培养基，于 37 °C 孵育 1 小时，或于 4 °C 孵育超过 1 小时，使样品充分平衡。</li>
	<li>消化并传代目标细胞，制备成所需细胞密度的小体积细胞悬液。 
	注意：脱细胞化组织的接种必须在体视显微镜下无菌操作进行。细胞培养基中应含有 1% 青霉素/链霉素。</li>
	<li>用移液器向 96 孔板每孔中央加入 3–4 μL DPBS。使用细而直的镊子将脱细胞化支架转移至 DPBS 液滴中，吸除多余 DPBS，确保样品未折叠或起皱。让其边缘自然干燥，以使其贴附于孔底表面。 
	注意：未贴附的支架会导致接种效率降低。</li>
	<li>沿孔壁缓慢滴加单细胞悬液，将细胞接种至支架上。 
	注意：例如，新生大鼠心肌细胞的接种密度为 7,500 个细胞/mm2，永生化小鼠 Lin− Sca-1+ 心脏祖细胞（iCPCSca-1）的接种密度为 60–1,500 个细胞/mm2。应根据实验设计调整细胞接种密度。</li>
	<li>向相邻孔中加入 DPBS，以防止培养基过快蒸发。</li>
	<li>细胞接种后 24 小时，若所用细胞类型能够贴附于组织培养级聚苯乙烯板（TCPS），则将生物支架转移至新孔中；否则更换培养基以去除未贴壁细胞。</li>
	<li>根据具体细胞类型的需要，小心更换培养基。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

细胞外基质（ECM）是由纤维性和黏附性糖蛋白构成的高度动态且复杂的网状结构，其中含有大量生物活性肽和包埋的生长因子。作为细胞黏附、细胞骨架动态、运动/迁移、增殖、分化和凋亡的主要调节因子，ECM主动调控细胞的功能与行为。已知细胞在二维（2D）和三维（3D）培养环境中的行为存在差异，因此人们致力于开发新型的类器官模型，以更准确地模拟天然组织环境。近年来，组织去细胞化已成为组织工程与再生医学领域的一种替代性技术。目前，组织和器官去细胞化是体外和体内研究组织特异性微环境参数（生化、结构和力学特性）及生物学活性的首选工具。
我们开发了一种结合低渗缓冲液与具有阴离子表面活性剂特性的去垢剂处理，随后进行DNase消化的方案5,12,13。本方案提供了一种简单且可重复的方法，用于对去细胞化的小鼠胎儿和成年心脏组织进行比较分析。我们在其他组织上的实践经验，包括来自癌症患者手术切除样本的肿瘤组织以及小鼠肺组织，表明...

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Erratum: Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies

细胞外基质（ECM）是由多种分子构成的动态网络，可调控重要的细胞过程，即命运决定、增殖和分化1,4。对细胞-ECM相互作用的研究主要在体外二维（2D）培养系统中进行，这些系统通常以ECM组分包被，但其特性较体内天然ECM存在显著简化。in vivo。脱细胞技术可生成无细胞的类三维（3D）ECM生物支架，能够较大程度地保留天然组织和器官的细胞外结构与组成3,4。除了作为组织工程中的生物活性支架外，脱细胞3D ECM生物材料正逐渐成为研究细胞-ECM生物学的新平台，可更贴近模拟体内环境。
采用相似的天然生物支架制备方案，将有助于评估不同组织、器官及年龄阶段中细胞外基质（ECM）组分的差异性作用。在心脏研究中，我们建立了一种通用的去细胞化方案，适用于胎儿和成体来源的样本，为器官微环境的比较研究提供了替代方法。利用该方法，我们成功保留了天然的心脏微环境，并证实胎儿ECM能够促进心脏细胞更高的再接种效率5。去细胞化还使我们能够在基底膜和细胞周基质网状结构及纤维组成水平上，识别胎儿与成体ECM之间固有的结构差异5。在此项工作之前，仅在恒河猴肾脏和啮齿类动物心脏中，使用相同的去细胞化方法对不同发育阶段的组织进行过直接比较。此外，仅有少数研究专门报道了胎儿组织/器官的去细胞化本身5,6,7。这些研究均采用十二烷基硫酸钠（SDS）作为唯一的去细胞化试剂；然而，针对胎儿和成体心脏组织的去细胞化使用了不同的SDS浓度7,8。SDS是最有效的离子型去垢剂之一，可高效清除胞质和核物质，广泛应用于多种组织和样本的去细胞化过程9,10。高浓度SDS溶液长时间作用与蛋白质变性、糖胺聚糖（GAGs）丢失以及胶原原纤维结构破坏相关10,11，因此必须在ECM保护与细胞去除之间取得平衡。为了将同一操作流程应用于胎儿和成体心脏组织，本文所述方案分为三个连续步骤：通过渗透冲击（低渗缓冲液）实现细胞裂解；利用0.2% SDS溶解脂蛋白、DNA-蛋白及蛋白-蛋白相互作用；最后通过DNase处理去除核物质。
本方案具有多项优势：i) 采用相同的脱细胞策略即可实现针对不同年龄阶段心脏组织的等效脱细胞；ii) 无需特殊方法或专用设备；iii) 易于推广至其他组织和物种，此前已通过少量调整成功应用于人肠活检组织12和小鼠肺组织13；更重要的是，iv) 该方法可在评估细胞外基质（ECM）生物力学特性的同时，支持构建三维类器官型培养体系，更接近天然组织微环境的分子特征。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>恒温摇床</td><td>轨道摇床</td><td>IKA:3510001</td><td>推荐使用</td></tr><tr><td>荧光计</td><td>-</td><td>-</td><td>可使用设备</td></tr><tr><td>电子天平</td><td>-</td><td>-</td><td>可使用设备</td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>-</td><td>-</td><td>可使用设备</td></tr><tr><td>细胞培养箱</td><td>-</td><td>-</td><td>可使用设备</td></tr><tr><td>冰箱（4&amp;ordm;C）</td><td>-</td><td>-</td><td>可使用设备</td></tr><tr><td>超低温冰箱（-80&amp;ordm;C）</td><td>-</td><td>-</td><td>可使用设备</td></tr><tr><td>切片机</td><td>-</td><td>-</td><td>可使用设备</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;手术器械&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vannas弹簧剪 - 2.5 mm切割刃</td><td>Fine Science Tools</td><td>5000-08</td><td>推荐使用</td></tr><tr><td>Dumont 5号精细镊子 - 生物学/不锈钢</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td>推荐使用</td></tr><tr><td>Dumont 7号镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11272-30</td><td>推荐使用</td></tr><tr><td>直型解剖剪</td><td>-</td><td>-</td><td>可用工具</td></tr><tr><td>带齿弯镊</td><td>-</td><td>-</td><td>可用工具</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24孔板，独立包装</td><td>VWR</td><td>29442-044</td><td>-</td></tr><tr><td>96孔板，独立包装</td><td>VWR</td><td>71000-078</td><td>-</td></tr><tr><td>Steriflip-GV，0.22&amp;micro;m，PVDF，辐射灭菌</td><td>Millipore</td><td>SE1M179M6</td><td>-</td></tr><tr><td>Eppendorf离心管</td><td>-</td><td>-</td><td>可使用材料</td></tr><tr><td>15 mL Falcon离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>430791</td><td>-</td></tr><tr><td>50 mL Falcon离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>430829</td><td>-</td></tr><tr><td>带盖四室组织活检处理/包埋盒</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>70075-B</td><td>-</td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus载玻片</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-037-246</td><td>-</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;组织冷冻保存&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shandon Cryomatrix包埋树脂</td><td>Thermo Scientific</td><td>6769006</td><td>-</td></tr><tr><td>2-甲基丁烷，无水，99+%（异戊烷）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>277258-1L</td><td>-</td></tr><tr><td>干冰</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;脱细胞处理&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>BDH Prolabo</td><td>27810.364</td><td>-</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-31264</td><td>-</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5379-100g</td><td>-</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8041-1KG</td><td>-</td></tr><tr><td>Tris碱</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066-500G</td><td>-</td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-4390</td><td>-</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>MERCK</td><td>1.05833.1000</td><td>-</td></tr><tr><td>DNA酶I</td><td>AplliChem</td><td>A3778,0050</td><td>-</td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>Gibco</td><td>15710-049</td><td>-</td></tr><tr><td>两性霉素B</td><td>Gibco BRL</td><td>15290-026</td><td>-</td></tr><tr><td>去离子水（DI水）</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;组织学&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10%中性缓冲福尔马林</td><td>Prolabo</td><td>361387P</td><td>-</td></tr><tr><td>伊红Y水溶液</td><td>Surgipath</td><td>01592E</td><td>可用醇溶性伊红替代</td></tr><tr><td>Richard-Allan Scientific HistoGel样本处理凝胶</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HG-4000-012</td><td>-</td></tr><tr><td>乙醇（无水乙醇，99.5%）</td><td>Aga</td><td>4,006,02,02,00</td><td>-</td></tr><tr><td>去离子水（DI水）</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Clear Rite 3</td><td>Richard-Allan Scientific</td><td>6915</td><td>-</td></tr><tr><td>Shandon Histoplast包埋剂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>RAS.6774006</td><td>-</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;试剂盒&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PureLink基因组DNA小量提取试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K182001</td><td>-</td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen&amp;nbsp;dsDNA定量试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>P11496</td><td>-</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;细胞培养&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>VWR</td><td>45000-434</td><td>-</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液（100X）</td><td>Labclinics</td><td>L0022-100</td><td>-</td></tr><tr><td>两性霉素B</td><td>Gibco BRL</td><td>15290-026</td><td>-</td></tr><tr><td>目标细胞的细胞培养基</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr></tbody></table>

用于体外研究的胎儿与成人心脏组织外植体的可比性脱细胞三维样平台

Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies

目前，关于细胞外基质（ECM）与细胞间通讯的知识主要来源于大规模的二维（2D）体外培养研究，其中ECM组分通常以表面包被的形式呈现。这类培养系统是对组织ECM复杂特性的一种简化，未能充分反映ECM在生化组成、结构特征和力学性质等方面的复杂性。为了更真实地模拟塑造心脏微环境的ECM-细胞相互作用，我们开发了一种可同时对胎儿全心和成年左心室组织外植体进行去细胞化的实验方案，以支持比较性研究。该方案结合使用低渗缓冲液、具有阴离子表面活性剂特性的去垢剂以及DNase处理，无需特殊技能或专用设备。将相同的去细胞化策略应用于不同年龄个体的组织样本，为开展比较研究提供了一种替代方法。本方案有助于识别胎儿与成年心脏ECM网络之间的独特结构差异以及相应的生物学细胞反应。此外，本文所述方法具有更广泛的应用潜力，仅需少量调整即可成功应用于其他组织和物种，例如人肠道活检组织和小鼠肺组织。

脱细胞效率应通过三种主要技术进行评估：宏观观察、组织学和DNA定量。SDS处理后样品的宏观外观间接影响细胞去除的效果。经过SDS孵育后，样品应呈现半透明至微白色图1C）。胎鼠（E18）去细胞组织呈高度半透明结构，而成年动物外植体则呈半透明至白色外观。较白的外观通常与细胞外基质网络中较高的纤维和胶原含量相关。 例如 成年心室和血管血管ECM网状结构（图1C）。苏木精 &amp; 伊红（H&amp;E）和/或Masson三色染色（MT）用于通过观察多孔网状结构（浅粉色，H&amp;E；浅粉色和蓝色，MT）（图1C此外，MT染色将胶原纤维网络染成蓝色5脱细胞后细胞核物质的清除通过DNA定量来评估，与未经处理的组织相比，通常可实现约99.8%的减少。图1C）。已有报道称，脱细胞支...

心脏细胞外基质（ECM）是由多种分子构成的复杂网络，可在整个生命周期中协调组织和器官的关键生理过程，并经历生理性的重塑。对胎儿和成人心脏进行标准化脱细胞处理，可在三维环境中保留其天然结构和生物力学特性，从而实现两种组织的对比实验研究。

当前对细胞外基质（ECM）-细胞通讯的认识主要基于大规模二维（2D）体外培养研究，其中ECM组分……

该方法有助于解决心血管领域中关于细胞外基质在心脏不同生理和发育阶段所起作用的重要问题。该技术的主要优势在于，通过将相似的脱细胞方法应用于胎儿和成人心脏组织，能够实现对胎儿与成年细胞外基质之间的比较分析。因此，该方法已成功应用于其他器官，例如癌症患者的手术切除组织，从而促进了在不同背景下对细胞外基质的研究。首先用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）快速冲洗胎鼠和成年小鼠的心脏。随后将组织置于解剖显微镜下，使用直头小剪刀去除成年小鼠心脏的心房、右心室及室间隔。将左心室转移至新的培养皿中，并将左心室游离壁切成厚度为2毫米的纵向条状组织。 使用大小均一的成年小鼠左心室组织块对于获得稳定的脱细胞效率至关重要。在使用2 mm × 2 mm网格进一步将组织条切割成更小的组织碎片之前，先用手术刀和带齿镊子（镊尖弯曲）去除乳头肌。当所有组织均被切碎后，用足量的磷酸盐缓冲液（PBS）短暂冲洗组织碎片，确保完全覆盖组织块。将胎心及成人心脏组织碎片分别转移至含有250微升最佳切割温度包埋剂（OCT）的1.5毫升微量离心管中，每管一份。随后，将心脏组织样本置于干冰冷却的异戊烷中冷冻，于负80摄氏度保存。为脱细胞化冷冻保存的组织，将冷冻样本放入培养皿中，加入足量的磷酸盐缓冲液（PBS），完全覆盖组织块。OCT 融化后，将样本浸入盛有 PBS 的新培养皿中，在摇床上以每分钟 60 转的速度洗涤 3 次，每次 10 至 15 分钟。最后一次洗涤后，向无菌 24 孔细胞培养板的每孔中加入 1 毫升工作浓度的低渗缓冲液，并用精细镊子将一个组织片段转移至每孔中。将培养板在 25 摄氏度、165 转/分钟条件下孵育 18 小时，随后每孔加入 1 毫升 PBS，在相同转速下洗涤 3 次，每次 1 小时。最后一次洗涤后，向每个孔中加入1毫升新配制的十二烷基硫酸钠（SDS）溶液，在25摄氏度下孵育24小时。第二天，用低渗洗涤缓冲液每次1毫升、每次洗涤20分钟、共洗涤三次冲洗样品，随后向每个孔中加入1毫升DNase处理溶液，在37摄氏度下孵育3小时。孵育结束后，脱细胞样品应失去其类似明胶的质地。然后用一毫升磷酸盐缓冲液（PBS）清洗组织碎片，每次清洗20分钟，共清洗三次，随后在室温及60 RPM条件下，每孔加入一毫升新鲜PBS过夜清洗。为了评估脱细胞组织中细胞残余物的去除情况，次日早晨每孔加入一毫升新配制的含0.03%水溶性伊红的10%中性缓冲液，室温固定2.5至3小时。孵育结束后，每孔用一毫升PBS清洗样本。根据制造商的说明，使用一次性乙烯基标本模具将脱细胞碎片包埋在组织学处理凝胶中。接着，将包埋好的碎片转移至活检处理包埋盒中。通过依次在浓度递增的乙醇、异链烷烃溶液以及两轮56摄氏度的石蜡浸渍剂中各孵育30分钟，对样品进行石蜡包埋处理。经过第二次脱蜡后，将样品置于石蜡包埋块中，并使用切片机获取厚度为三微米的切片

comparable-decellularization-fetal-adult-cardiac-tissue-explants-as

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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