胎儿和成人心脏组织外植体作为三维体外研究平台的可比较去角质

这种方法可以帮助解决心血管领域的重要问题，即细胞外基质在心脏的不同生理和发育阶段的影响。该技术的主要优点是，它允许通过对两种组织应用类似的去细胞化方法，对胎儿和成人细胞外基质进行比较分析。因此，该方法已成功地应用于其他器官，如癌症患者的手术切除，有助于不同情况下的细胞外基质的研究。

首先用冰冷的PBS短暂冲洗胎儿和成年小鼠心脏。然后将组织放在解剖显微镜下，然后用直小剪刀从成年小鼠心脏取出腹膜、右心室和隔膜。将左心室转移到新的培养皿中，将左心室自由壁分成两毫米厚的纵向条。

使用成人小鼠左心室异室的均匀大小对于一致的去细胞效率至关重要。使用手术刀和带弯曲尖端的锯齿形钳子去除毛骨肌肉，然后再使用两毫米的网格进一步将条状肉末碎成较小的组织碎片。当所有组织都碎了，用足够的PBS短暂冲洗，以覆盖外植。

将胎儿心脏和成人心脏组织片段转移到单个1.5毫升微离心管中，每管含有250微升的最佳切削温度或OCENT化合物。然后，将心电组织样本冷冻在干冰冷却异丙烷中，储存在负80摄氏度。去细胞化冷冻保存的组织将冷冻样品放在含有足够PBS的培养皿中，以完全覆盖外植。

OCT 熔化后，将样品淹没在 PBS 的新 Petri 盘中，并在摇床上以每次洗涤 60 RPM 的速度将样品洗涤 10 至 15 分钟。最后一次洗涤后，在无菌的24井组织培养板的每个井中加入一毫升的工作低吨位缓冲液，并使用细钳将一个片段转移到每一个井中。在25摄氏度下孵育板18小时，在165 RPM时，每井每井一毫升PBS中孵育3个1小时。

上次洗涤后，将一毫升新鲜准备好的硫酸钠或SDS溶液添加到每井中，在25摄氏度下24小时孵育。第二天，每次洗涤用三个20分钟洗涤样品，然后在每个井中加入一毫升DNase治疗溶液，在37摄氏度下孵育3小时。在孵育结束时，去细胞化样品应失去其明胶状的稠度。

然后用一毫升 PBS 洗涤组织碎片三次，每次洗涤 20 分钟，然后在室温和 60 RPM 下，每井一毫升新鲜 PBS 中隔夜清洗。为了评估从去细胞化组织中去除细胞残留物，第二天早上将样品固定在一毫升新鲜准备的10%配方中性缓冲液中，并辅以每口水性Eosin的0.03%，在室温下2.5至3小时。在孵育结束时，将样品洗净每井一毫升PBS。

并使用一次性乙烯基试样模具，根据制造商的规格封装组织学加工凝胶中的脱细胞碎片。接下来，将封装的片段转移到活检处理嵌入盒式磁带。通过连续30分钟的孵化，在乙醇、无磷酸盐烃溶液和两个56摄氏度石蜡中连续孵化，对石蜡的嵌入样品进行处理。

第二次石蜡出现后，将样品安装在石蜡块中，并使用微原子获得三微米厚的部分。然后根据标准协议用血氧素、eosin和马森三色染色来染色部分，验证去细胞化效率。过夜PBS用震动洗涤后，加入500微升新鲜准备的DPBS，每毫升安培他林B 1%抗生素溶液补充2.5微克到每个脚手架。

在4摄氏度下储存样品一至七天。在坐上细胞之前，用500微升的细胞基底介质代替DPBS溶液，并辅以抗生素。在37摄氏度下孵化脚手架一小时。

在孵化结束时，使用显微镜将四微升的 DPBS 滴添加到每个脚手架 96 井板的一个井的中心。并使用薄直钳将一个去细胞化的脚手架转移到每滴的顶部。通过吸气去除任何额外的 DPBS，并确认脚手架没有折叠或起皱。

当脚手架在边缘干燥时，缓慢地将感兴趣的细胞的单个电池悬挂在每个脚手架的顶部。胚胎第18天去细胞化组织的特点是高度半透明结构，而成人外植表现出半透明到白色的外观。赤氧树脂素和 eosin 和马森的三叶草染色确认通过存在多孔网有效去除细胞。

与非操纵组织相比，非细胞化后核材料减少约99.8%，这对于避免在植入时引发不必要的炎症反应至关重要。在体内培养过程中，可以通过钙素染色来监测坐式脚手架内的细胞生存能力。细胞在脚手架上的再填充和分布的终端分析，也可以在石蜡处理后进行，如中央生物分裂部分的这些代表性图像中观察到的。

因此，这项技术为研究人员探索胎儿和成年小鼠心脏以及其他组织细胞外基质的生物活性特性铺平了道路。