酶联反应合成 l-赖氨酸手性氨基醇的研究

该程序的总体目标是合成和纯化手性氨基醇，这些化合物具有广泛的应用范围，从用于有机合成的手性助剂到药物治疗。这是一个全产量计，可在单组分程序中通过两到三个酶促步骤获得源自天然氨基酸赖氨酸的手性氨基醇。该程序的主要优点是方案的简单性和纯化步骤的效率。

演示该程序的是我实验室的技术员 Aurelie Fossey-Jouenne。为了合成二氢醚化赖氨酸衍生物，将 hepes 缓冲液、l-赖氨酸、alpaquita 戊二酸、抗坏血酸钠和更多盐添加到 250 ml 锥形瓶中。然后，考虑到要添加的酶溶液的体积，加水至最终体积为 10 ml。

加入脱氧酶 KD-01 至终浓度为 0.075 mg/ml。在室温下以 300 rpm 摇动反应混合物适当的持续时间。混合后，将 10mcl 反应混合物转移到 1.5ml ependorf 管中。

然后，在乙醇中加入 aquias 碳酸氢钠溶液、乙醇和每毫升 2.5 毫克的 DNFB 溶液。关闭微管，以 1000rpm 和 65 摄氏度摇动溶液 1 小时。完成后，使用微型离心机沉淀溶液。

用 10mcl 1M 氢化糖酸淬灭反应混合物。涡旋溶液，然后使用微型离心机使其沉淀。使用 1 ml 诱饵注射器，在直径为 4 mm 的非无菌注射器过滤器上过滤混合物，并使用 0.22 mcm 倾倒大小的亲水性聚偏二氟乙烯膜。

然后，将衍生化的反应混合物样品放入 HPLC 仪器中。将 10mcl 注入 C-18 色谱柱 使用 UV 检测，在 400 纳米处分析产品。当反应监测显示反应完成时，向培养瓶中加入 αquita 戊二酸、抗坏血酸钠和更多盐。

加入脱氧酶 KD-02 至每毫升 0.5 mg 的适当终浓度。使用初始反应体积计算。在室温下以 300 rpm 摇动反应混合物 18 小时。

当反应监测指示反应完成时，向反应混合物中加入 100 mcl 100 milimolar DTT。加上 100 mcl 的 100 milimolar PLP。加入纯化的脱羧酶 Dccpin，终浓度约为 0.5 mg/ml。

使用初始反应体积计算。然后，在室温下以 300 rpm 振荡反应混合物 18 小时。反应完成后，将培养瓶放入冰浴中冷却混合物。

小心加入 0.25ml 6 molar hcl，加药过程中轻轻摇动冷反应混合物。现在，使用玻璃牧场移液器将 acdic 混合物转移到 50ml 锥形底离心管中。将混合物以 1， 680 倍重力和 4 摄氏度离心 15 分钟。

离心后，将上清液转移至 250 ml 圆底瓶中。接下来，将 10 毫升去离子水加入装有沉淀的离心管中。涡旋以重新悬浮沉淀。

离心样品后，将上清液转移至包含第一个上清液的圆底培养瓶中。通过将培养瓶中浮出液氮，不断用手旋转来冷冻收集的上清液。立即将培养瓶转移到台式歧管冷冻干燥器中，以防止材料解冻。

冷冻干燥过程完成后，从冷冻干燥机中取出烧瓶并执行纯化步骤。对于单羟基 L-赖氨酸的生物催化脱羧，来自 S Rhumerentium 的 DC 对所有单羟基赖氨酸表现出活性。其中观察到的相应手性羟基二胺的 3 和 5 衍生物的最佳转化率。

正如预期的那样，Dccpin 最适合 4R-羟基-L-赖氨酸 2 的脱羧。在标准反应条件下，3S-羟基-L-赖氨酸 1 转化为其脱羧对应物 5，与 DCcpin 的转化率较低。未观察到对 5R-羟基-L-赖氨酸的活性。

对于脱羟基-L-赖氨酸的生物催化脱羧，在标准反应条件下，仅将 3R、4R、二羟基-L-赖氨酸 3 定量转化为相应的二羟基二胺 7。45-二羟基-L-赖氨酸 8 的转化率适中，但通过增加酶负载而得到改善。两种 PLP-DC 均对 35-二羟基-L-赖氨酸 9 没有活性。

通过 HPLC 监测确定表现出定量转化的酶级联反应已成功放大。从复杂的酶促反应混合物和优良的混合物中纯化氨基醇，并通过 NMR 表征。一旦掌握了这种酶促级联合成和随后的纯化，如果制备得当，可以在 48 小时内完成。

在尝试此过程时，重要的是要记住，反应主要体的良好氧合对于双氧合反应至关重要。以及仔细监测，以确保在添加二羧酶之前消耗掉所有赖氨酸。该方案的主要缺点是双加氧酶和脱羧酶的补贴范围有限。

然而，可以通过使用一组不同的酶来探索从氨基酸中合成各种氨基醇的生物特性。观看此视频后，您应该对如何进行酶促级联反应以及如何从复杂反应混合物中纯化氨基醇有很好的了解。不要忘记，使用 DNFB 可能很危险，否则应采取预防措施，例如佩戴个人防护装备和在通风橱中进行反应。