Name: 酶联反应合成 l-赖氨酸手性氨基醇的研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: 学习通过酶级联反应从L-赖氨酸合成手性氨基醇的高效方法。本方案展示C-H氧化与脱羧步骤，实现高收率产物纯化，适用于有机合成与药物研发领域。

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作者感谢 Véronique de Berardinis 的有益讨论，以及 Alain Perret、Christine Pellé 和 Peggy Sirvain 提供的技术支持。

1. 酶的制备
<ol>
	<li>如前所述表达并纯化蛋白质26。 
	注意：重组蛋白的最终浓度如下：来自Catenulispora acidiphila的αKAO，UniProtKB编号：C7QJ42（KDO1），1.35 mg/mL；来自C. pinensis的αKAO，UniProtKB编号：C7PLM6（KDO2），2.29 mg/mL；来自S. rumirantium的PLP-DCs，UniProtKB编号：O50657（LDCSrum），无细胞提取物中总酶浓度为12.44 mg/mL；来自C. pinensis的PLP-DC，UniProtKB编号：C7PLM7（DCCpin），2.62 mg/mL。</li>
</ol>
2. 溶液的配制
注意：以下所有溶液均使用去离子水配制。
<ol>
	<li>配制1 M HEPES缓冲液，pH 7.5；用5 M NaOH调节pH。 
	注意：在调节pH的过程中，需佩戴防护手套、防护服、眼部保护装置和面部保护装置（P280）。若接触眼睛（P305、P351、P338），应小心用水冲洗数分钟。如可能，摘除隐形眼镜，并持续冲洗，立即联系中毒控制中心或医生（P310）。P代码指预防措施说明（危险类别和分类；参见，例如，pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ghs/）。</li>
	<li>配制100 mM L-赖氨酸、100 mM (5S)-羟基-L-赖氨酸、150 mM α-酮戊二酸、100 mM 抗坏血酸钠、10 mM 硫酸亚铁铵六水合物（莫尔盐）、100 mM 5'-磷酸吡哆醛（PLP）和100 mM 二硫苏糖醇（DTT）。</li>
	<li>用37% HCl溶液（约12 M）配制1 M、2 M和6 M盐酸（HCl）溶液，操作时遵循与2.1中所述相同的安全规程。 
	注意：α-酮戊二酸、抗坏血酸钠和硫酸亚铁铵六水合物溶液必须在使用当天新鲜配制。赖氨酸溶液可在室温下保存数月。PLP溶液可在4 °C保存一个月。DTT溶液可在-20 °C保存一个月。</li>
</ol>
3. 分析规模反应
<ol>
	<li>(5R)-羟基-L-赖氨酸脱羧反应的方法开发
	<ol>
		<li>向一个2 mL微量离心管中加入11 µL pH 7.5的1 M HEPES缓冲液（终浓度50 mM）。然后加入22 µL 100 mM的(5S)-羟基-L-赖氨酸（终浓度10 mM）、2.2 µL 100 mM的PLP（终浓度1 mM）和2.2 µL 100 mM的DTT（终浓度1 mM）。 
		注意：若反应使用LDCSrum，则无需添加DTT。</li>
		<li>加入纯化的PLP-DC（终浓度0.1 mg/mL），并用H2O补足至终体积220 µL。</li>
		<li>将反应混合物在室温下以300 rpm振荡反应3小时，管盖打开并暴露于空气中。 
		注意：在开放空气中敞口振荡可确保反应体系充分氧合，因此无需向反应体系中通入氧气。</li>
		<li>取10 µL反应混合物，按照第6步所述的反应监测程序进行分析。建议在取样后立即进行衍生化处理并直接分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>结合αKAO催化的羟基化步骤与PLP-DC催化的脱羧步骤的酶级联反应方法开发
	<ol>
		<li>向一个2 mL微量离心管中加入11 µL 1 M HEPES缓冲液（pH 7.5，终浓度50 mM）。然后加入22 µL 150 mM的α-酮戊二酸（终浓度15 mM）、5.5 µL 100 mM的抗坏血酸钠（终浓度2.5 mM）、22 µL 10 mM的莫尔盐（终浓度1 mM）以及22 µL 100 mM的L-赖氨酸（终浓度10 mM）。</li>
		<li>根据第3.2.3步中待加入的酶溶液体积，用H2O补足至终体积220 µL。</li>
		<li>根据目标区域选择性加入所需的纯化αKAO酶：KDO1用于L-赖氨酸C-3位的羟基化，KDO2用于C-4位的羟基化。纯化酶的终浓度（0.05–0.5 mg/mL）经确定可在约3小时内实现完全转化。</li>
		<li>将反应混合物在室温下以300 rpm振荡反应3小时，管盖打开并暴露于空气中。</li>
		<li>加入2.2 µL 100 mM的PLP（终浓度约1 mM）和2.2 µL 100 mM的DTT（终浓度约1 mM）。 
		注意：若反应使用LDCSrum，则无需添加DTT。</li>
		<li>加入纯化的PLP-DC，其浓度应确保在18小时内完成完全转化：在与KDO1联用的级联反应中，LDCSrum的终浓度约为0.1 mg/mL；在与KDO2联用的级联反应中，DCCpin的终浓度约为0.5 mg/mL。</li>
		<li>将反应混合物在室温下以300 rpm振荡反应18小时，管盖打开并暴露于空气中。</li>
		<li>按照第3.1.4步的方法进行反应监测。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>结合两种αKAO催化的连续羟基化步骤与PLP-DC催化的脱羧步骤的酶级联反应方法开发
	<ol>
		<li>执行第3.2.1–3.2.2步。</li>
		<li>加入KDO1，使其终浓度为0.05 mg/mL。将反应混合物在室温下以300 rpm振荡反应3小时，管盖打开并暴露于空气中。</li>
		<li>加入KDO2，其终浓度约为0.5 mg/mL（按初始反应体积计算）。将反应混合物在室温下以300 rpm振荡反应18小时，管盖打开并暴露于空气中。</li>
		<li>执行第3.2.5步。</li>
		<li>加入纯化的PLP-DC（DCCpin），其终浓度约为0.5 mg/mL（按初始反应体积计算）。将反应混合物在室温下以300 rpm振荡反应18小时，管盖打开并暴露于空气中。</li>
		<li>按照第3.1.4步的方法进行反应监测。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 半制备型一锅法生物催化反应
注意：酶促反应在250 mL敞口玻璃锥形瓶中进行，反应体系总体积为10 mL，底物为0.1 mmol的L-赖氨酸。
<ol>
	<li>单羟基化衍生物的合成
	<ol>
		<li>向烧瓶中加入 0.5 mL 1 M HEPES 缓冲液（pH 7.5，终浓度 50 mM）。然后加入 1 mL 100 mM L-赖氨酸（终浓度 10 mM）、1 mL 150 mM α-酮戊二酸（终浓度 15 mM）、0.25 mL 100 mM 抗坏血酸钠（终浓度 2.5 mM）以及 1 mL 10 mM 摩尔盐（终浓度 1 mM）。</li>
		<li>用 H2O 定容至终体积 10 mL，需考虑步骤 4.1.3 中将要加入的酶溶液的体积。</li>
		<li>根据目标区域选择性加入所需纯化的 αKAO 酶：若需在 L-赖氨酸的 C-3 位发生羟基化，则加入终浓度为 0.075 mg/mL 的 KDO1；若需在 C-4 位发生羟基化，则加入终浓度为 0.5 mg/mL 的 KDO2。纯化酶的终浓度已确定为可在约 3 小时内实现完全转化。</li>
		<li>将反应混合物在室温下以 300 rpm 振荡适当时间。当反应监测表明羟基化反应已完成（执行步骤 6 中详述的所有步骤以进行反应监测），则进入步骤 4.1.5。典型反应时间为 3 小时。</li>
		<li>向 αKAO 反应混合物中加入 100 µL 100 mM PLP（终浓度约 1 mM）。然后加入 100 µL 100 mM DTT（终浓度约 1 mM），但使用 LDCSrum 时除外。</li>
		<li>加入纯化的 PLP-DC 酶：若与 KDO1 进行级联反应，则加入终浓度约为 0.05 mg/mL 的 LDCSrum；若与 KDO2 进行级联反应，则加入终浓度约为 0.5 mg/mL 的 DCCpin。</li>
		<li>将反应混合物在室温下以 300 rpm 振荡 18 小时，随后直接进入步骤 4.3 中详述的操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>二羟基化衍生物的合成
	<ol>
		<li>加入 0.5 mL 1 M HEPES 缓冲液（pH 7.5，终浓度 50 mM）、1 mL 100 mM L-赖氨酸（终浓度 10 mM）、1 mL 150 mM α-酮戊二酸（终浓度 15 mM）、0.25 mL 100 mM 抗坏血酸钠（终浓度 2.5 mM）以及 1 mL 10 mM 摩尔盐（终浓度 1 mM）。用 H2O 定容至终体积 10 mL，需考虑步骤 4.2.2 中将要加入的酶溶液的体积。</li>
		<li>加入 KDO1 至终浓度 0.075 mg/mL。将反应混合物在室温下以 300 rpm 振荡适当时间。</li>
		<li>当反应监测表明羟基化反应已完成（参见步骤 6 中的反应监测方案），则进入步骤 4.2.5。典型反应时间为 3 小时。</li>
		<li>加入 1 mL 150 mM α-酮戊二酸（终浓度 15 mM）、0.25 mL 100 mM 抗坏血酸钠（终浓度 2.5 mM）以及 1 mL 10 mM 摩尔盐（终浓度 1 mM）。</li>
		<li>加入 KDO2 至终浓度约 0.5 mg/mL（按初始反应体积计算）。将反应混合物在室温下以 300 rpm 振荡 18 小时。</li>
		<li>当反应监测表明二羟基化反应已完成（参见步骤 6 中的反应监测方案），则进入步骤 4.2.7。典型反应时间为 18 小时。</li>
		<li>加入 100 µL 100 mM DTT（终浓度约 1 mM），但使用 LDCSrum 时除外。</li>
		<li>加入纯化的 DCCpin 至终浓度约 0.5 mg/mL（按初始反应体积计算）。</li>
		<li>将反应混合物在室温下以 300 rpm 振荡 18 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>反应终止
	<ol>
		<li>将 250 mL 玻璃锥形烧瓶置于冰浴中，使反应混合物冷却。</li>
		<li>在约 1 分钟内小心地滴加 0.25 mL 6 M HCl，同时手动轻轻摇动冷却的反应混合物。遵循与步骤 2.1 中所述相同的安全操作规程。</li>
		<li>使用带有橡胶头的玻璃巴斯德吸管将酸性混合物转移至 50 mL 圆锥底离心管中，随后在 1,680 × g 和 4 °C 条件下离心 15 分钟。</li>
		<li>吸出上清液，并暂存于 250 mL 圆底烧瓶中。</li>
		<li>向含有沉淀的圆锥底离心管中加入 10 mL 去离子水，涡旋振荡以重新悬浮沉淀。</li>
		<li>在 1,680 × g、4 °C 条件下离心 15 分钟。</li>
		<li>吸出上清液，并将其加入至含有第一次上清液（步骤 4.3.4）的 250 mL 圆底烧瓶中。</li>
		<li>通过将烧瓶浸入液氮中并持续手动旋转使其快速冷冻，随后立即将烧瓶转移至台式多歧管冷冻干燥仪中，防止样品解冻。</li>
		<li>冷冻干燥过程完成后（过夜），从冷冻干燥仪中取出烧瓶。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 从粗酶反应混合物中纯化氨基醇
<ol>
	<li>离子交换树脂
	<ol>
		<li>将冻干物溶于最小量的0.1 M盐酸水溶液（约4 mL）中，直至肉眼不可见固体颗粒。</li>
		<li>在玻璃柱（20 × 250 mm）中装填磺酸基功能团阳离子交换树脂（200–400目），于常压下依次用1 M HCl（4个柱体积）和0.1 M HCl（4个柱体积；柱体积 = 10 mL）进行淋洗平衡。</li>
		<li>使用1,000 µL移液器，将样品小心地加至玻璃柱内树脂上层的柱壁处。随后，用1 mL 0.1 M盐酸水溶液分三次冲洗盛有粗产物的锥底离心管，每次洗涤后将洗涤液以相同方式加载到柱上。</li>
		<li>用非线性梯度洗脱：4 柱体积的 0.1 M HCl，4 柱体积的水，4 柱体积的 5% NH₄OH4OH，10% NH₄Cl 溶液，4 个柱体积4OH，15% NH₄，4个柱体积4OH，20% NH₄Cl 溶液，4 个柱体积4OH，4 个柱体积的 25% NH₄OH4OH，最后用4个柱体积的28% NH₄OH4OH</li>
		<li>通过HPLC监测纯化过程（参见步骤6）。</li>
		<li>合并含有该化合物的组分（NH4OH 20-28%）并按照步骤 4.3.8–4.3.9 所述进行冻干。 
		注意：离子交换柱在用去离子水洗脱至洗脱液呈中性（约50 mL）后，可再用50 mL 1 M HCl洗脱重新平衡，从而重复使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>固相萃取
	<ol>
		<li>将冻干化合物溶于约 2 mL 的 H3PO4/水（20 µL/mL）</li>
		<li>将一个6 mL混合模式阳离子交换固相萃取柱置于连接真空泵的萃取装置上。通过装置提供的负压，用4 mL甲醇冲洗萃取柱进行活化。随后在负压条件下用4 mL H3PO4/水（20 µL/mL）。</li>
		<li>使用1,000 µL移液器将样品加至玻璃柱壁上的树脂顶端，并用0.75 mL H₂O分三次冲洗盛有产物的小瓶3PO4每次洗涤加入20 µL/mL水。以相同方式将所得洗涤液体积上样至柱中。</li>
		<li>用真空 manifold 提供的减压条件洗涤柱芯：先用 4 mL 含 2% HCOOH 的水溶液淋洗，再用 4 mL 水淋洗。随后用 NH 的梯度洗脱4水中的OH（每次洗脱4 mL，从4% NH开始）4OH：10%、15%、15%、20% 和 28%。</li>
		<li>通过高效液相色谱（HPLC）监测纯化过程，按照步骤6中所述的反应监测方案分析每个组分。根据紫外（UV）色谱图保留含有纯目标衍生物的所有组分，并进行步骤5.2.6。</li>
		<li>将含有目标化合物的组分收集至一个100 mL圆底烧瓶中，用水冲洗盛装组分的试管，并将冲洗液一并加入该100 mL圆底烧瓶中。</li>
		<li>使用旋转蒸发仪在40 °C恒温水浴条件下减压除去溶剂，旋转蒸发仪连接真空泵，真空度设为10 mbar。</li>
		<li>将固体溶于最小体积的水中，转移至已称重的25 mL圆底烧瓶中。用最小体积的水冲洗原容器，并将洗涤液并入25 mL圆底烧瓶中，然后进行步骤5.2.9。</li>
		<li>称取纯化产物的质量并计算产率。</li>
		<li>将纯化产物溶于最小体积的2M HCl中，直至肉眼不可见固体颗粒，然后按照步骤4.3.8-4.3.9所述进行冷冻干燥。 
		注意：氨基醇类化合物性质敏感，通常以其盐酸盐形式保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 反应监测与产物分析
<ol>
	<li>在高效液相色谱分析前对底物和产物进行衍生化 
	注意：底物和产物需要衍生化为芳香族衍生物，以提高其在紫外色谱检测中的灵敏度。我们使用了1-氟-2,4-二硝基苯（DNFB）进行衍生化。每个样品在衍生化完成后立即进样至高效液相色谱（HPLC）中。
	<ol>
		<li>取10 µL酶促反应液转移至1.5 mL离心管中，加入10 µL 0.25 M NaHCO₃。3 水溶液，100 µL 乙醇，以及 30 µL 浓度为 2.5 mg/mL 的 DNFB 乙醇溶液。</li>
		<li>盖上离心管，将所得溶液在65 °C、1,000 rpm条件下振荡反应1小时。加入10 µL 1 M HCl终止反应。</li>
		<li>使用1 mL鲁尔注射器，通过直径4 mm、孔径0.22 µm的亲水性聚偏二氟乙烯（PVDF）膜非无菌注射器滤器过滤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用任何能够分离衍生化氨基酸的系统对双加氧酶反应进行监测。本方案涉及通过二硝基苯（DNB）发色团对氨基酸进行衍生化，并采用紫外检测27.
	<ol>
		<li>使用C18反相色谱柱（5 µm，3 x 150 mm），末端封端为三甲基硅烷，安装至高效液相色谱仪。</li>
		<li>用（30:70）流动相B（MeCN + 0.1% TFA）与流动相A（H₂O + 0.1% TFA）平衡C18色谱柱2O + 0.1% TFA），流速为1 mL/min，温度35 °C，持续15分钟（相当于约20个柱体积）。</li>
		<li>将10 µL衍生化反应混合物（见步骤6.1）注入HPLC C18色谱柱。流动相采用乙腈与0.1%三氟乙酸水溶液的混合物2以O和0.1% TFA为流动相，采用线性梯度洗脱（比例由30:70在9分钟内升至70:30，温度35 °C，流速1 mL/min）。</li>
		<li>使用400 nm紫外检测分析色谱柱洗脱产物。DNB-赖氨酸通常在约6.5 min洗脱，羟基化DNB-赖氨酸约在5.5 min，二羟基化DNB-赖氨酸约在4.2 min，DNB-氨基二醇约在5.3 min。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 纯化氨基醇的核磁共振分析
<ol>
	<li>将纯化的氨基醇溶解于 D2O（700 µL）中，并将溶液转移至核磁共振（NMR）样品管。</li>
	<li>根据相应的核磁共振设施操作规程采集 1H 和 13C NMR 谱图28。</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露。

手性氨基醇及其衍生物具有广泛的应用，从有机合成中的手性助剂到药物治疗均有涉及。传统有机合成中制备氨基醇的多步合成方法众多，但由于繁琐的保护/脱保护步骤以及对立体化学控制的敏感性，这些方法并不总是高效16。而生物催化方法无需保护/脱保护步骤，且通常具有高度的立体选择性，因此是一种理想的替代途径。
先前的研究报道了通过动态动力学不对称转化（DYKAT）方法合成多种具有2-苯乙胺骨架的β-氨基醇。在此路线中，由苏氨酸醛缩酶催化苯甲醛及其衍生物的羟醛缩合反应，引入羟基取代的手性中心。该第一步反应的非对映选择性较低且收率中等，但随后通过L-酪氨酸脱羧酶（L-tyrosine DC）催化的立体专一性脱羧反应得以克服，从而得到对映体富集的芳香族β-氨基醇11,12。
本文报道了一种以易得的L-赖氨酸为起始原料，直接合成多种氨基醇的简便方法。尽管该方法效率较高，但由于αKAO和P...

尽管生物催化具有诸多优势，但将生物催化步骤整合到合成路线或完全生物催化路线中，目前仍主要局限于酶促动力学拆分。这类方法在不对称化学-酶法合成中常被用作初始步骤，但生物催化在官能团转化方面还具有更多潜力，可实现高立体选择性的转化1,2,3。此外，由于生物催化反应通常在相似条件下进行，因此有可能在同一个反应容器中实现级联反应4,5。
手性氨基醇是有机合成中常用的助剂或骨架分子6。氨基醇结构单元常见于次级代谢产物和活性药物成分（API）中。通过传统的化学合成方法，可由相应的α-氨基酸 readily 获得伯β-氨基醇，但获取手性γ-氨基醇或仲氨基醇通常需要繁琐的合成路线，并且对立体化学的控制要求较高7,8,9,10。由于生物催化具有高度的立体选择性，因此可能为这些手性构建单元的合成提供更优的途径11,12,13,14。
我们此前报道了通过亚铁/α-酮酸依赖性加氧酶家族（αKAO）的双加氧酶催化的非对映选择性酶促羟基化反应，合成单羟基和二羟基-L-赖氨酸的方法（图1）15。具体而言，以L-赖氨酸为起始底物时，KDO1双加氧酶催化生成(3S)-羟基衍生物（1），而(4R)-羟基衍生物（2）则由KDO2双加氧酶催化生成。KDO1与KDO2依次进行区域选择性不同的羟基化反应，可生成光学纯的(3R,4R)-二羟基-L-赖氨酸（3）。然而，这些酶的底物范围有限，限制了其在化学合成中的广泛应用，尤其是在简单胺类化合物的羟基化反应中，由于酶活性依赖于氨基α位必须含有羧酸基团16。
<img alt="含酶KDO1、KDO2的化学转化图；氨基酸反应产率显示为100%。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56926/56926fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：L-赖氨酸的生物催化转化。 在KDO1双加氧酶催化下转化为(3S)-羟基-L-赖氨酸（1）；在KDO2双加氧酶催化下转化为(4R)-羟基-L-赖氨酸（2）；以及通过KDO1和KDO2双加氧酶依次催化的级联反应生成(3R,4R)-二羟基-L-赖氨酸（3）。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56926/56926fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
脱羧是代谢中常见的反应17特别是，氨基酸脱羧酶（EC 4.1.1）是一类无辅因子（丙酮酰依赖性）或依赖磷酸吡哆醛（PLP）的酶，可在细菌和高等生物中催化氨基酸脱羧生成相应的多胺18,19,20,21,22单羟基和二羟基化合物（图3) 4-7, 10-11 对应于腐胺的羟基化产物，腐胺是由L-赖氨酸脱羧生成的二胺。腐胺是化学工业中的重要构建单元，特别是聚酰胺和聚氨酯聚合物的组分。因此，利用可再生资源通过生物法生产该二胺，作为石油基路线的替代方案已受到广泛关注，多种微生物已被用于该目的的改造。在这些代谢途径中，赖氨酸脱羧酶（LDC）是关键酶。LDC是一种依赖磷酸吡哆醛（PLP）的酶，属于丙氨酸消旋酶（AR）结构家族。23已知依赖磷酸吡哆醛（PLP）的脱羧酶（PLP-DCs）具有高度底物特异性。然而，少数酶具备一定程度的底物宽泛性，可同时对L-鸟氨酸和L-赖氨酸两种氨基酸表现出活性，例如来自 Selenomonas rumirantium （LDCSrum），对赖氨酸和鸟氨酸脱羧具有相似的动力学常数24,25这种扩展的底物特异性使该酶成为单羟基和二羟基-L-赖氨酸脱羧反应的良好候选酶。此外，为了寻找对赖氨酸羟基衍生物具有活性的脱羧酶（DCs），我们分析了编码αKAO酶基因的基因组上下文。事实上，在原核生物基因组中，参与同一生物合成途径的酶编码基因通常共定位于基因簇中。KDO2（来自 Chitinophaga pinensis) 基因被发现与编码假定的PLP-DC的基因共定位图2）。相比之下，在分析KDO1双加氧酶的基因组背景时，未发现编码DC的基因。来自PLP-DC蛋白的 C. pinensis （直流Cpin因此被选为催化级联反应脱羧步骤的有前景候选物。
<img alt="Chitinophaga pinensis 基因图谱、蛋白质功能注释、代谢通路分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56926/56926fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：C. pinensis 中 KDO2 基因的基因组上下文。 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56926/56926fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
因此，我们设计了涉及双加氧酶和脱羧酶（DCs）的酶级联反应，以实现从氨基酸合成脂肪族手性β-和γ-氨基醇（图3）。如先前报道，αKAO催化的C-H氧化反应以完全非对映选择性引入羟基取代的手性中心；而Cβ/γ手性将在脱羧步骤中得以保留，该步骤仅影响氨基酸部分的Cα碳16。
<img alt="化学反应途径，脱羧反应，羟基化，L-赖氨酸合成，分子结构图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56926/56926fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：逆合成分析。（A）由(5R)-羟基-L-赖氨酸逆合成(β-和γ-氨基醇类化合物：(R)-1,5-二氨基戊-2-醇（4）；以及由L-赖氨酸逆合成(S)-1,5-二氨基戊-2-醇（5）和1,5-二氨基戊-3-醇（6）。（B）从(5R)-羟基-L-赖氨酸出发逆合成β,γ-和β,δ-氨基二醇类化合物：(2S,3S)-1,5-二氨基戊烷-2,3-二醇（10）和(2R,4S)-1,5-二氨基戊烷-2,4-二醇（11）；以及从L-赖氨酸出发逆合成(2R,3R)-1,5-二氨基戊烷-2,3-二醇（7）。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56926/56926fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
从L-赖氨酸及其(5R)-羟基衍生物，本文报道了一种两步/三步一锅法的酶促反应流程，结合双加氧酶和PLP依赖型脱羧酶，以获得目标氨基醇。在进行实验室规模的目标分子合成之前，该方法首先在分析级规模上进行开发，以优化反应条件。 例如，酶的浓度需足以实现起始原料的完全转化；我们也展示了该操作步骤。

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>L-赖氨酸盐酸盐</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5626</td><td></td></tr><tr><td>(5&lt;em&gt;S&lt;/em&gt;)-羟基-L-赖氨酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>GPS NONH</td><td>外包</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-酮戊二酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>75892</td><td></td></tr><tr><td>抗坏血酸钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7631</td><td></td></tr><tr><td>硫酸亚铁铵六水合物</td><td>Acros</td><td>201370250</td><td></td></tr><tr><td>磷酸吡哆醛（PLP）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>82870</td><td></td></tr><tr><td>3,4-二巯基丁烷-1,2-二醇（DTT）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>1-氟-2,4-二硝基苯（DNFB）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D1529</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>VWR</td><td>20825.290</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71631</td><td></td></tr><tr><td>HCl 37%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>435570</td><td></td></tr><tr><td>HCl 0.1M</td><td>Fluka</td><td>35335</td><td></td></tr><tr><td>乙腈 HiPerSolv CHROMANORM 用于 LC-MS</td><td>VWR</td><td>83640.320</td><td></td></tr><tr><td>2,2,2-三氟乙酸</td><td>VWR</td><td>153112E</td><td></td></tr><tr><td>氨水 28%</td><td>VWR</td><td>21182.294</td><td></td></tr><tr><td>甲醇 HiPerSolv CHROMANORM 用于 LC-MS</td><td>VWR</td><td>83638.32</td><td></td></tr><tr><td>甲酸</td><td>Acros</td><td>270480010</td><td></td></tr><tr><td>磷酸 85%</td><td>Acros</td><td>201145000</td><td></td></tr><tr><td>重水</td><td>Acros</td><td>320,710,075</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>C18 HPLC 色谱柱</td><td>Phenomenex</td><td>00F-4601-Y0</td><td></td></tr><tr><td>Accela UHPLC 系统</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accela PDA 检测器</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>一次性 4 mm 注射器滤器 - 0.22&amp;micro;m - PVDF</td><td>Merck</td><td>SLGVR04NL</td><td></td></tr><tr><td>带毫升刻度、鲁尔接头的一次性结核菌素注射器</td><td>VWR</td><td>HSWA5010.200V0</td><td></td></tr><tr><td>阳离子交换树脂 100-200&amp;nbsp;目</td><td>Sigma Aldrich</td><td>217506</td><td></td></tr><tr><td>混合模式阳离子交换固相萃取小柱 6 mL</td><td>Waters</td><td>186000776</td><td></td></tr><tr><td>固相萃取装置</td><td>Waters</td><td>WAT200609</td><td></td></tr><tr><td>旋转蒸发仪</td><td>B&amp;uuml;chi</td><td>531-0103</td><td></td></tr><tr><td>冷冻干燥机 alpha 1-2 LDplus</td><td>Christ</td><td>L083302</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器 20 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3121000031</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器 100 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3121000074</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器 500 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3121000112</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器 1000 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3121000120</td><td></td></tr><tr><td>300 MHz 核磁共振波谱仪</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 mL 微量离心管</td><td>CLEARLine</td><td>CL20.002.0500</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 圆锥底离心管</td><td>Fischer Scientific</td><td>05-539-8</td><td></td></tr><tr><td>25 mL 圆底烧瓶 14/23</td><td>Fischer Scientific</td><td>10353331</td><td></td></tr><tr><td>100 mL 圆底烧瓶 29/32</td><td>Fischer Scientific</td><td>11786183</td><td></td></tr><tr><td>250 mL 圆底烧瓶 29/32</td><td>Fischer Scientific</td><td>11786183</td><td></td></tr><tr><td>250 mL 锥形瓶</td><td>Fischerbrand</td><td>15496143</td><td></td></tr></tbody></table>

利用酶级联反应由l-赖氨酸合成手性氨基醇

Enzymatic Cascade Reactions for the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from L-lysine

氨基醇是一类用途广泛的化合物，具有多种应用。例如，它们已被用作有机合成中的手性骨架。通过传统有机化学方法合成氨基醇通常需要繁琐的多步反应过程，且难以控制其立体化学结果。本文介绍一种利用易得的L-赖氨酸为起始原料，通过酶促方法在48小时内合成氨基醇的实验方案。该方案结合了两个传统有机合成中极难实现的化学反应。第一步由双加氧酶催化赖氨酸侧链上未活化C-H键的区域和非对映选择性氧化；第二步由具有区域选择性差异的双加氧酶进一步催化，生成1,2-二醇。最后一步通过磷酸吡哆醛（PLP）依赖的脱羧酶（DC）切除α-氨基酸的羧基。该脱羧反应仅作用于氨基酸的α-碳，从而保留了位于β/γ位的羟基取代手性中心，因此所得氨基醇具有较高的光学纯度。该方法已成功应用于四种氨基醇的半制备规模合成。反应进程通过高效液相色谱法（HPLC）进行监测，样品经1-氟-2,4-二硝基苯衍生产生信号。通过固相萃取（SPE）进行简单纯化后，氨基醇的收率优异（93%至&#62;95%）。

我们此前已报道过通过铁(II)/αKAO家族双加氧酶催化的非对映选择性酶促羟基化反应合成单羟基-L-赖氨酸和二羟基-L-赖氨酸的方法（图1）16。为了优化本文所展示的整个级联反应方案（该方案包含由αKAO催化的一步或两步羟基化反应，随后是由PLP-DC催化的脱羧反应），我们调整了反应条件，以同时满足两种酶促反应的需求。我们首先研究了两种脱羧酶LDCSrum和DCCpin对市售的(5R)-羟基-L-赖氨酸的催化活性。随后，我们将这两种脱羧酶与相应的αKAO催化的氧化步骤组成级联反应，检测其对单羟基衍生物3-羟基-L-赖氨酸（1）和4-羟基-L-赖氨酸（2）的脱羧活性。表1列出了单羟基-L-赖氨酸生物催化脱羧反应的结果。通过DNFB对反应混合物进行衍生化，生成相应的DNB标记底物和产物，再经HPLC测定转化率...

手性氨基醇是有机合成中可用作骨架的多功能分子。以L-赖氨酸为起始原料，我们通过酶级联反应合成氨基醇：该反应首先由双加氧酶催化实现非对映选择性的C-H氧化，随后由脱羧酶裂解相应羟基氨基酸的羧酸部分。

利用酶级联反应由L-赖氨酸合成手性氨基醇

氨基醇是一类用途广泛的化合物，具有多种应用。例如，它们已被用作有机合成中的手性骨架。

本实验的总体目标是合成并纯化手性氨基醇，这类化合物具有广泛的应用，从作为有机合成中的手性助剂到用于药物治疗。该方法是一种高效且一步完成的工艺，可通过两步或三步酶促反应，以天然氨基酸赖氨酸为原料制备手性氨基醇。该方法的主要优势在于其实验步骤简单，且纯化过程高效。本实验操作将由我实验室的技术员 Aurelie Fossey-Jouenne 演示。为合成二羟基化赖氨酸衍生物，向一个 250 ml 的锥形瓶中加入 hepes 缓冲液、l-赖氨酸、alpaquita 戊二酸、抗坏血酸钠以及更多的盐。然后加水至终体积为 10 ml，计算时需计入后续将加入的酶溶液的体积。加入脱氧酶 KD-01，使其终浓度为每毫升 0.075 mg。在室温下以 300 rpm 振荡反应混合物，持续适当时间。混合后，取 10 µl 反应混合物转移至 1.5 ml 离心管中。然后，加入碳酸氢钠水溶液、乙醇以及浓度为2.5 mg/mL的DNFB乙醇溶液。盖紧微量离心管，于1000 rpm、65 °C条件下振荡反应1小时。反应结束后，使用小型离心机将溶液离心沉淀。用 10 µL 的 1 M 盐酸淬灭反应混合物。涡旋振荡溶液，然后使用小型离心机离心沉淀。使用 1 mL 鲁尔注射器，通过直径为 4 mm、孔径为 0.22 µm 的亲水性聚偏氟乙烯膜针式过滤器（非无菌）过滤混合物。随后，将衍生化后的反应混合物样品放入高效液相色谱仪中。使用紫外检测器，在400纳米波长下，将10 µL样品注入C-18柱以分析产物。当反应监测显示反应完成后，向烧瓶中加入α-酮戊二酸钠、抗坏血酸钠以及更多的盐。加入脱氧酶KD-02，使其终浓度约为每毫升0.5毫克，根据初始反应体积计算。在室温下以300 rpm振荡反应混合物，持续18小时。当反应监测表明反应完成时，向反应混合物中加入100 µL 100毫摩尔的DTT。再加入100 µL 100毫摩尔的PLP。加入纯化的脱羧酶Dccpin，使其终浓度约为0.5 mg/mL。根据初始反应体积进行计算。然后，在室温下以 300 rpm 的速度振荡反应混合物 18 小时。反应完成后，将烧瓶置于冰浴中冷却混合物。小心加入 0.25 ml 的 6 摩尔 HCl，并在加入过程中轻轻摇动冷却的反应混合物。随后，使用玻璃巴氏德吸管将酸性混合物转移至 50 ml 锥底离心管中。在 4 摄氏度条件下，以 1,680 ×g 离心 15 分钟。离心后，将上清液转移至250 ml圆底烧瓶中。接着，向含有沉淀的离心管中加入10 ml去离子水。涡旋振荡以重新悬浮沉淀。离心样品后，将上清液转移至含有第一份上清液的圆底烧瓶中。通过将烧瓶浸入液氮中并持续手动旋转，冷冻收集的上清液。立即将烧瓶转移至台式多歧管冷冻干燥机中，以防止样品解冻。冻干过程完成后，从冻干机中取出烧瓶并进行纯化步骤。对于单羟基 L-赖氨酸的生物催

enzymatic-cascade-reactions-for-synthesis-chiral-amino-alcohols-from

Research

科研

JoVE Journal

Chemistry

化学

酶联反应合成 l-赖氨酸手性氨基醇的研究

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裂分与混合合成及肽类叔酰胺库的表征

通过SPOT方法合成的多肽阵列可用于分析蛋白质赖氨酸甲基转移酶（PKMTs）的底物特异性，并确定PKMTs的底物谱，从而理解其生物学功能。本实验方案描述了如何合成多肽阵列，使用PKMTs进行甲基化反应，并对结果进行分析。...

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离子液体（ILs）可实现快速、简便且低成本地获得高非对映选择性和良好产率的1,6-酮酯。该反应方法稳定可靠，经过简单的过滤操作即可获得克级规模的1,6-酮酯产物。此外，这些1,6-酮酯在烃类溶剂中表现出显著的凝胶化能力。...

离子液体介导的高立体选择性合成1,6-酮酯：一种三组分反应实现快速获取新型小分子凝胶剂

为了以高特异性将抗癌药物递送至肿瘤部位并减少副作用，需要基于纳米颗粒的新方法。本文描述了可通过过氧化氢介导的氧化反应简便制备的二硫键交联胶束，该胶束在还原性的肿瘤微环境中能有效解离，从而释放所载药物。...

一种简便高效的可逆二硫键交联胶束制备方法

本文介绍了一种在同一序列中合成具有混合阳离子功能的肽模拟物（赖氨酸型和精氨酸型单体）的方案，并描述了这些化合物对引起皮肤利什曼病的原虫寄生虫Leishmania...

一种高效合成含混合型赖氨酸/精氨酸单体的肽拟物及其抗利什曼原虫活性评价方法

本文介绍了一种高效的方法，用于水解从镍-席夫碱配合物中分离得到的氨基酸，并随后进行Fmoc保护。本文所述的水解条件适用于需要保留对酸敏感的侧链保护基团的情况。该技术可适用于多种非天然氨基酸底物。...

使用适用于保留酸敏感保护基条件的镍-席夫碱配合物水解反应

我们介绍一种利用光诱导的硫醇-烯/硫醇-炔加硫醇化反应构建含硫醚/乙烯基硫醚连接的螺旋肽的实验方案。...

通过光诱导硫醇-烯/炔加硫醇化反应构建含硫醚/乙烯基硫醚连接的螺旋肽

本文描述了一种两步一锅法，用于将酮的烯醇化物发生极性反转生成烯醇阳离子中间体，并实现亲核试剂对α位的加成反应。适用的亲核试剂包括氯离子、叠氮化物、唑类、烯丙基硅烷以及芳香族化合物。...

通过烯醇鎓中间体对酮进行反极性官能团化的两步法方案

通过简单的有机催化1,3-偶极环加成反应，可不对称合成对映体富集的双螺环[γ-丁内酯-吡咯烷-4,4'-吡唑啉酮]骨架。...

通过α-亚氨基-γ-内酯与亚烷基吡唑啉酮的有机催化环加成高效构建类药双螺环骨架

微波辅助分子内脱氢Diels-Alder（DA）反应可高效构建官能团化的环戊二烯并[b萘类构筑单元。通过布赫瓦尔德-哈特维希钯催化偶联反应，将脱氢DA加成产物一步转化为新型溶致变色荧光染料，展示了该方法的实用性。...

微波辅助分子内脱氢Diels-Alder反应合成功能化萘类化合物/溶致变色染料

学习通过酶级联反应从L-赖氨酸合成手性氨基醇的高效方法。本方案展示C-H氧化与脱羧步骤，实现高收率产物纯化，适用于有机合成与药物研发领域。

利用酶级联反应由L-赖氨酸合成手性氨基醇

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