Name: 骨肉瘤前小鼠模型对肿瘤与间充质干细胞细胞外囊泡介导通信的定义 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: 了解肿瘤来源细胞外囊泡与间充质干细胞通信机制，使用临床前小鼠模型研究骨肉瘤进展。该方法可实时观察EV介导的肿瘤微环境相互作用，为癌症治疗提供新靶点。

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S.R. Baglio 获得了意大利癌症研究协会（Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro，AIRC）提供的博士后奖学金资助，该奖学金由欧盟共同资助。此外，本项目还获得了欧盟“地平线2020”研究与创新计划在玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里资助协议 No 660200（授予 S.R. Baglio）下的资金支持。&#160;

用于分离间充质干细胞的人类脂肪组织在获得机构伦理委员会批准并取得书面知情同意后，由荷兰希尔弗瑟姆特尔戈伊医院（Tergooi Hospital）整形外科提供。GFP阳性的脂肪间充质干细胞由摩德纳和雷焦艾米利亚大学（University of Modena and Reggio Emilia）儿童与成人内外科科学系提供。
动物实验遵循荷兰动物实验法进行，实验方案经荷兰阿姆斯特丹VU大学医学中心动物实验委员会批准。
1. 肿瘤分泌的细胞外囊泡的分离。
<ol>
	<li>使用超速离心转头，在 4 °C 条件下以 70,000 × g 离心胎牛血清（FBS）过夜（16 小时），不启用刹车功能（减速过程预计需 1 小时）。小心收集上清液（即去外泌体 FBS），避免扰动沉淀。使用 0.22 µm 滤器过滤去外泌体 FBS。</li>
	<li>通过在 Iscove 改良 Dulbecco 培养基（IMDM）中添加 100 U/mL 青霉素、100 µg/mL 链霉素、2 mM 谷氨酰胺（1× P/S/G）以及 5% 去外泌体 FBS，制备去外泌体培养基。</li>
	<li>将 3 × 106 个 143B 细胞接种于 175 cm2 培养瓶中，并在含 5% CO2 的 37 °C 培养箱中，使用去外泌体培养基进行培养。当细胞融合度达到 80–90% 时（通常在 36 至 48 小时后），收集来自 8 个 175 cm2 培养瓶（每瓶 28 mL）的上清液用于外泌体（EV）分离。</li>
	<li>通过差速离心法对细胞上清液进行预清除，以去除细胞及细胞碎片（每次离心后均取上一次离心所得上清液进行下一步操作），具体步骤如下：
	<ol>
		<li>以 500 × g 离心上清液两次，每次 10 分钟。</li>
		<li>以 2000 × g 离心上清液两次，每次 15 分钟。</li>
		<li>以 10,000 × g 离心上清液两次，每次 30 分钟。</li>
		<li>所有离心步骤均在 4 °C 下进行，并设置为最大加速度和减速度。每步完成后，小心收集含外泌体的上清液，保留约 1 mL 液体。立即进入步骤 1.5，或在 -80 °C 下保存预清除后的条件培养基，待后续进行外泌体分离。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将预清除后的条件培养基转移至超速离心管（每管终体积为 38.5 mL），使用超速离心转头在 4 °C 下以 70,000 × g 离心 1 小时，采用慢速刹车模式，以分离外泌体（EVs）。</li>
	<li>小心移除上清液，保留约 1 mL 液体，将含外泌体的沉淀重悬于残留液体中，合并所有样品至同一超速离心管中，并加入磷酸盐缓冲液（PBS）至完全充满（终体积为 38.5 mL）。</li>
	<li>再次在 4 °C 下以 70,000 × g 离心 1 小时，不启用刹车（减速过程预计需 1 小时）。小心移除上清液，避免扰动沉淀，保留 100–200 µL 液体。</li>
	<li>将外泌体沉淀重悬，并用 PBS 调整终体积至 200 µL（所有外泌体分离均标准化为此体积）。外泌体制剂可立即使用，或保存于 -80 °C 待用22。 
	注意：外泌体可在 -80 °C 下保存长达 6 个月。</li>
</ol>
2. 细胞外囊泡表征。
纯化的细胞外囊泡（EVs）可通过透射电子显微镜（TEM）进行观察23。
<ol>
	<li>将EV样本与等体积的4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液混合。</li>
	<li>在室温下，用5 µL EV悬液孵育200目Formvar-碳支持膜镍网20分钟。</li>
	<li>用含1%戊二醛的0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.0）固定TEM载网上的EV样本，以草酸铀酰（pH 7.0）进行对比染色，并在冰上用4%醋酸铀酰与2%甲基纤维素按1:9比例混合液包埋。</li>
	<li>使用不锈钢金属环取出载网，并用滤纸吸去多余液体，以确保甲基纤维素膜具有适当厚度。</li>
	<li>干燥后，使用透射电子显微镜观察载网，并通过连接相应图像软件的数字相机采集图像。</li>
</ol>
3. 肿瘤来源的细胞外囊泡对间充质干细胞的教育作用。
<ol>
	<li>通过在α-最小必需培养基（alpha-MEM）中添加4% 去除细胞外囊泡的人血小板裂解液（hPL），制备MSC培养基24，肝素（10 U/mL）和1×青霉素/链霉素/谷氨酰胺（P/S/G）。 
	注意：无细胞外囊泡的hPL是根据第1.1节所述步骤制备的。</li>
	<li>种子 1.4 x 106 每75 cm²的脂肪来源的MSCs2 烧瓶，并在37 °C、5% CO2的培养箱中，用去除EV的MSC培养基进行培养。</li>
	<li>当细胞达到70%融合度时，加入143B骨肉瘤细胞或对照人成纤维细胞（hf）-EVs，每平方厘米加入10 µL EV制备物2 培养瓶中孵育24小时，然后加入等量的EVs，继续孵育6小时。注：人成纤维细胞在含10%胎牛血清的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中培养，EVs的分离方法见第1节。</li>
	<li>收集MSC上清液，于4 °C以500 × g离心1次，5分钟（离心机加速度和减速度均设为最大），转移至新离心管，将澄清的上清液于-80 °C保存，用于后续细胞因子分析（第5节）。</li>
	<li>对于 体内 实验（第6节），培养GFP阳性MSCs25 如第3.1至3.3节所述，收集细胞并将其重悬于PBS中，终浓度为106 每 100 µL 含相应细胞数。细胞在注射前需置于冰上保存。</li>
</ol>
4. 细胞外囊泡内化实验。
为了观察间充质干细胞（MSCs）对细胞外囊泡（EV）的摄取，按照生产商的方案，使用绿色荧光连接染料（GFLD）（可商业获得）对EV进行标记：
<ol>
	<li>简而言之，向200 µL EV样本中加入180 µL稀释液。将1 µL GFLD染料溶于50 µL稀释液中，取20 µL稀释后的染料加入稀释后的EV样本中。</li>
	<li>用移液器轻轻混匀，室温避光孵育3分钟。</li>
	<li>加入5 mL含0.1% BSA的PBS，转移至超速离心管中，并用PBS加满离心管（终体积为38.5 mL/管）。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 70,000 × g 离心 1 小时（无刹车，预计减速耗时 1 小时）。小心吸去上清液，并将标记的 EV 沉淀重悬于终体积为 200 µL 的溶液中（用 PBS 调整体积）。</li>
	<li>添加&#160;将标记的EVs加入MSC培养物中，或于-80 °C保存。经一夜孵育后，通过荧光显微镜和流式细胞术评估囊泡的内化情况7.</li>
</ol>
5. 评估间充质干细胞的细胞因子表达谱。
<ol>
	<li>为了在间充质干细胞条件培养基（参见步骤3.4）中对白细胞介素-8（IL-8）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-10（IL-10）、肿瘤坏死因子（TNF）和白细胞介素-12p70（IL-12p70）蛋白水平进行多重定量，可使用市售的人类炎症性细胞因子流式微球阵列（CBA）试剂盒，并按照制造商提供的说明书操作。</li>
	<li>简言之，混匀抗体偶联的捕获微球后，将其加入所有检测管中；随后向各管中加入细胞因子标准品稀释液或条件培养基样本。</li>
	<li>加入检测试剂，在室温下孵育3小时。</li>
	<li>使用提供的洗涤液洗涤微球，然后通过流式细胞仪检测样本，并根据制造商说明书分析数据。</li>
</ol>
6. 骨肉瘤异种移植小鼠原位模型的建立。
<ol>
	<li>让6周龄的雌性Athymic Nude-Foxn1nu小鼠在开始实验操作前适应环境至少一周。</li>
	<li>手术前一天及围手术期镇痛期间，将对乙酰氨基酚加入饮水中稀释使用。 &#34;儿童用对乙酰氨基酚溶液&#34; （参见 材料表) 加水至终浓度为 2 mg/mL。根据平均饮水量 150 mL/kg/天和平均体重 20 g，该剂量足以达到每只小鼠 6 mg/天（300 mg/kg/天）的给药量。</li>
	<li>术后继续给予镇痛治疗至24小时，若动物仍表现出疼痛症状，则应延长镇痛时间。</li>
	<li>手术当天，通过300 × g离心10分钟收集培养的荧光素酶阳性（Fluc）143B细胞（此前通过慢病毒转导获得），并将细胞重悬于浓度为2 × 10⁶细胞/毫升的悬液中。5 细胞/µL，置于PBS中，冰上保存不超过6小时。</li>
	<li>高压灭菌手术器械。准备并清洁操作区域，将灭菌的剪刀和镊子放置在无菌纱布上。手术前20分钟（步骤6.8），使用0.5 mL胰岛素注射器（29号针头）皮下注射布托啡诺（0.05 mg/kg，用0.9%生理盐水稀释）作为镇痛剂&#160;针）</li>
	<li>在对每只动物进行麻醉前，用10 µL注射器吸取至少1 µL浓缩的（Fluc）143B细胞悬液（见步骤6.4）。</li>
	<li>使用异氟烷吸入麻醉（氧气中浓度为 2 - 3%）对动物进行麻醉。通过夹捏足趾检查动物的麻醉深度，当动物对夹捏无反应时， 即， 动物深度麻醉后，需在眼睛上涂抹眼膏以防止麻醉期间角膜干燥。</li>
	<li>将动物仰卧位固定，头部置于麻醉面罩中，四肢朝向操作者。屈曲左侧膝关节。用70%乙醇擦拭皮肤，并用棉签蘸取利多卡因（2%）涂抹3次，作为局部镇痛。</li>
	<li>使用无菌外科手术刀在膝关节下方皮肤处做一个小切口（约5 mm），以暴露胫骨。在距膝关节约2 mm处，使用0.8 mm微型麻花钻在胫骨上钻一个小孔。注意避免穿透胫骨双侧皮质。</li>
	<li>注射1 µL细胞悬液（约2 x 105 使用26号针头在约5秒内缓慢将细胞注入孔中。用一滴组织胶封闭孔洞，以防止悬液回流。</li>
	<li>用单丝缝线缝合皮肤，并涂抹一滴组织胶。将动物置于加热良好的环境中恢复（可使用加热灯）。在动物恢复足够意识、能够维持胸卧位之前，不得无人看管。只有在动物完全从麻醉中恢复后，方可将其放回原有笼具中。</li>
	<li>肿瘤接种后两天，注射经细胞外囊泡（EV）诱导或未经诱导的GFP阳性MSCs（106 用0.5 mL胰岛素注射器将100 µL PBS中的细胞静脉注射，参见步骤3.5&#160;小鼠尾静脉</li>
	<li>通过生物发光成像监测肿瘤生长26&#160;每周两次。为此，使用胰岛素注射器向小鼠腹腔注射 150 µL D-荧光素钠（30 mg/mL）。注射后 10 分钟，将动物置于生物发光成像系统中，检测肿瘤细胞产生的光子通量。</li>
	<li>此外，使用游标卡尺测量原发性骨肿瘤的直径。肿瘤体积（单位：mm3通过宽度乘以长度来估算2 × 0.5</li>
	<li>注：人道终点定义为肿瘤直径 &#62;15 毫米或体重减轻 &#62;15%.</li>
</ol>
7. 肺结节数量的评估
<ol>
	<li>当某只动物达到第6.14步中定义的人道终点（大约在3至4周内），终止实验并收集和分析所有相关组织。</li>
	<li>在实施安乐死前10分钟，使用0.5 mL胰岛素注射器注射150 µL D-荧光素（30 mg/mL）。</li>
	<li>使用异氟烷吸入麻醉法对动物进行麻醉（参见第6.7步）。通过轻捏脚趾无反应来确认小鼠麻醉深度。采用颈椎脱位法处死小鼠27。</li>
	<li>使用灭菌剪刀和镊子收集肺、肝、脾和肾。用PBS冲洗器官以去除血迹，并将其置于培养皿中。</li>
	<li>将装有器官的培养皿放入生物发光成像系统中。检测器官两侧的生物发光信号。测量完成后，立即将器官浸入4%甲醛溶液中固定&#160;（24–72小时，室温），以备后续组织学分析。</li>
	<li>使用适当的成像软件对获得的图像进行手动阈值处理。统计每张图像中肺结节数量，并计算双侧肺组织中肺结节的总数。</li>
</ol>
8. 组织学分析
<ol>
	<li>肺组织的组织学分析：
	<ol>
		<li>将经甲醛固定的器官包埋于石蜡中，并制备6 µm厚的组织切片。</li>
		<li>对肺组织切片进行脱蜡处理，并在0.01 M柠檬酸缓冲液（pH 6）中煮沸15分钟以进行抗原修复。</li>
		<li>将切片在室温下水平孵育，使用抗体稀释液（商品化产品）将抗人波形蛋白抗体（200 µg/mL）按1:150比例稀释，随后加入HRP标记的二抗（0.5 mg/mL，稀释比例1:500）。用3'-二氨基联苯胺（DAB）染色，并以苏木精复染。</li>
		<li>使用配备相应相机和图像软件的光学显微镜观察染色后的组织切片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>检测小鼠胫骨中GFP阳性间充质干细胞的存在：
	<ol>
		<li>使用0.24 M乙二胺四乙酸（EDTA）溶液（pH 7.2–7.4）对胫骨进行脱钙处理。每隔一天更换一次EDTA缓冲液，直至骨骼变软（约1周）。</li>
		<li>对胫骨进行脱水并浸润石蜡。将胫骨（包括骨肉瘤组织）包埋于石蜡块中。</li>
		<li>使用切片机制备6 µm厚的石蜡切片，并将切片转移至载玻片上。干燥后，在室温下存放过夜。</li>
		<li>采用加热介导的抗原修复方法（参见8.1.2），使用抗体稀释液将抗GFP抗体（全抗血清）按1:900比例稀释后对组织进行染色，并用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）进行复染。</li>
		<li>使用配备相应成像软件的荧光显微镜观察组织切片。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

肿瘤分泌的细胞外囊泡（EVs）可改变局部和远端间充质细胞的生理状态，从而形成支持肿瘤生长的微环境。本文描述了一种骨肉瘤的临床前小鼠模型的建立方法，该模型可用于解析肿瘤细胞与间充质干细胞（MSCs）之间由EV介导的相互作用。 体内我们证明，在携带骨肉瘤异种移植瘤的小鼠中，全身注射经人肿瘤细胞外囊泡（EV）诱导的间充质干细胞可显著促进肿瘤生长和转移形成，其机制是通过激活IL-6/STAT3信号通路。7.
近期研究表明，肿瘤来源的细胞外囊泡可促进转移前微环境的形成&#160;通过改变局部或骨髓来源的基质细胞的行为16,28,29这些研究大多通过将肿瘤来源的囊泡直接注射到受体小鼠体内进行，这使得难以确定介导促瘤效应的具体细胞类型。在本方案中，间充质干细胞（MSCs）与肿瘤来源的细胞外囊泡（EVs）的共培养过程发生于体外 体外</em...

肿瘤微环境积极参与肿瘤发生和癌症进展的大多数（即使不是全部）方面，包括转移灶的形成以及对治疗药物耐药性的产生1。这凸显了建立临床前原位癌症小鼠模型的重要性，此类模型可用于解析肿瘤微环境中复杂的肿瘤-间质相互作用。
在肿瘤微环境的多种细胞成分中，间充质干细胞（MSCs）在包括乳腺癌、前列腺癌、脑肿瘤、多发性骨髓瘤和骨肉瘤在内的多种癌症类型中显著促进癌症进展2,3,4,5,6,7. 间充质干细胞（MSCs）是存在于多种成体和胎儿组织（包括骨髓、脂肪组织、胎盘、脐带血等）中的多能干细胞8,9在癌症引发的炎症信号刺激下，间充质干细胞（MSCs）会迁移至肿瘤部位，融入肿瘤微环境，并最终分化为支持癌症发展的细胞。10。这些与癌症相关的MSC提供了必要的因子（即， 生长因子、趋化因子、细胞因子和免疫抑制介质）通过作用于肿瘤细胞及周围间质，促进肿瘤进展2,3,11,12,13尽管癌症相关间充质干细胞（MSCs）的促肿瘤作用已在多种癌症模型中得到研究，但肿瘤细胞重编程MSCs以形成促癌微环境的机制仍不清楚。本文描述了一种原位异种移植模型的建立，该模型可特异性地用于研究骨癌细胞与间充质干细胞通过细胞外囊泡（EVs）介导的促肿瘤发生相互作用。
细胞外囊泡（EVs）是肿瘤细胞与基质细胞之间细胞间通讯的关键介质14。EVs 携带来源细胞的功能性生物分子，包括蛋白质、脂质和调控性 RNA。一旦释放到细胞外空间，这些囊泡可被周围细胞摄取，或通过血液或淋巴循环运输至远端部位，从而显著影响靶细胞的行为15,16,17。例如，癌细胞来源的 EVs 被基质成纤维细胞摄取后，可能诱导其向肌成纤维细胞分化，从而在体内促进血管生成并加速肿瘤生长in vivo18,19；被内皮细胞内化后可刺激肿瘤血管生成并增加血管通透性16,20；与免疫细胞相互作用则可能导致抗肿瘤免疫反应受到抑制21。
我们最近利用骨肉瘤的生物发光原位异种移植小鼠模型证明，肿瘤细胞释放大量细胞外囊泡（EVs），可诱导间充质干细胞（MSCs）获得促肿瘤和促转移表型。该效应源于MSCs细胞因子表达谱的显著改变（称为 &#34;间充质干细胞教育&#34;），可通过给予治疗性白细胞介素-6受体（IL-6R）抗体加以预防7我们的研究证明，肿瘤来源的细胞外囊泡（EV）是间充质干细胞（MSC）行为的关键调节因子，从而为靶向微环境以抑制骨肉瘤进展的策略提供了理论依据。本文中，我们描述了一种逐步研究EV介导的肿瘤-MSC相互作用的实验方案。 体内该模型旨在：1）明确定义肿瘤微环境中由癌症来源的细胞外囊泡（EV）诱导的间充质干细胞（MSC）行为改变；2）评估这种相互作用如何促进骨肿瘤生长及转移灶形成；3）研究干扰EV介导的细胞间通讯是否能够抑制上述过程。 体内 抑制癌症进展。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>超速离心机</td><td>贝克曼</td><td>Optima L-90K</td><td></td></tr><tr><td>转子 SW32Ti</td><td>贝克曼</td><td>369650</td><td>在文稿中称为超速摆动桶转子</td></tr><tr><td>透射电子显微镜</td><td>Zeiss</td><td>EM109</td><td>或类似的透射电子显微镜</td></tr><tr><td>数码相机</td><td>尼康</td><td>DMX 1200F</td><td>或类似型号的相机</td></tr><tr><td>成像软件 TEM&amp;nbsp;</td><td>尼康</td><td>ACT-1</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Imager.D2</td><td>荧光显微镜或类似设备</td></tr><tr><td>成像软件 FM</td><td>Zeiss</td><td>ZEN Blue</td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td>Nuaire</td><td>4750E</td><td></td></tr><tr><td>离心</td><td>Hettick</td><td>ROTANTA 460R</td><td></td></tr><tr><td>-80℃ 冰箱</td><td>Thermo Electro Corporation</td><td>未提供</td><td></td></tr><tr><td>FACS</td><td>BD</td><td>BD FACScalibur</td><td>或类似的流式细胞仪</td></tr><tr><td>钻孔</td><td>费米</td><td>FCT-300</td><td>使用0.8 mm钻头</td></tr><tr><td>HSS 微型麻花钻，0.8 mm</td><td>Proxxon</td><td>28 852</td><td>0.8 mm 钻头</td></tr><tr><td>IVIS 相机</td><td>Xenogen</td><td>Ivis Lumina</td><td>在文稿中称为生物发光相机。Xenogen 现已并入 Perkin Elmer。</td></tr><tr><td>活体成像软件2.60</td><td>Xenogen / Igor Por</td><td>无</td><td>Xenogen 现为 Perkin Elmer 的一部分</td></tr><tr><td>10 &amp;micro;L型注射器</td><td>Hamilton</td><td>Neuros Model 1701 RN</td><td></td></tr><tr><td>针头：Hamilton RN 注射器针头，26 号规格，AS 型针尖，定制长度 2 cm</td><td>Hamilton</td><td>未提供</td><td></td></tr><tr><td>Caliper</td><td>Mitutoyo</td><td>G08004463</td><td></td></tr><tr><td>高压灭菌</td><td>Astell</td><td>无可用数据</td><td></td></tr><tr><td>加热灯</td><td>飞利浦</td><td>未提供</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;培养基&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Hyclone</td><td>RYG35912</td><td></td></tr><tr><td>血小板裂解液</td><td>未提供</td><td>未提供</td><td></td></tr><tr><td>IMDM培养基</td><td>Lonza</td><td>BE12-722F</td><td></td></tr><tr><td>α-MEM 培养基</td><td>Lonza</td><td>BE02-002F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 培养基</td><td>Lonza</td><td>BE12-614F</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素/谷氨酰胺</td><td>GIBCO</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>肝素</td><td>LEO</td><td>012866-08</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶/EDTA（10倍浓缩液）</td><td>GIBCO</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;细胞&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>脂肪来源的间充质干细胞</td><td>未提供</td><td>未提供</td><td></td></tr><tr><td>GFP阳性MSCs</td><td>未提供</td><td>未提供</td><td></td></tr><tr><td>人成纤维细胞</td><td>无</td><td>未提供</td><td></td></tr><tr><td>143B 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-8303</td><td></td></tr><tr><td>FLUC-143B 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-8303</td><td>转导的</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;一次性用品&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>175 cm² 培养瓶</td><td>CELLSTAR</td><td>660175</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>Greiner bio-one</td><td>210261</td><td></td></tr><tr><td>冻存管</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>377224</td><td></td></tr><tr><td>超透明管</td><td>贝克曼</td><td>344058</td><td>在文稿中称为超速离心管</td></tr><tr><td>0,22 &amp;micro;m 滤膜</td><td>Millex</td><td>SLGV033RS</td><td></td></tr><tr><td>200目 Formvar-碳支持膜镍网</td><td>电子显微镜科学公司（Electron Microscopy Sciences）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5 mL 胰岛素注射器，带 29G 针头</td><td>Terumo</td><td>U-100&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7612</td><td></td></tr><tr><td>滤纸&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>50363215</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;试剂/试剂盒&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Alfa Aeser</td><td>43368.9M</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>布劳恩</td><td>220/12257974/110</td><td></td></tr><tr><td>戊二醛</td><td>电子显微镜科学公司（Electron Microscopy Sciences）</td><td>16300</td><td></td></tr><tr><td>草酸铀酰</td><td>电子显微镜科学公司（Electron Microscopy Sciences）</td><td>22510</td><td></td></tr><tr><td>醋酸铀</td><td>电子显微镜科学公司（Electron Microscopy Sciences）</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>甲基纤维素</td><td>电子显微镜科学公司（Electron Microscopy Sciences）</td><td>1560</td><td></td></tr><tr><td>PKH67</td><td>Sigma</td><td>mini67-1kt</td><td>在文稿中称为 GFLD</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A8412</td><td></td></tr><tr><td>CBA - 人炎症性细胞因子检测试剂盒</td><td>BD</td><td>551811</td><td></td></tr><tr><td>甲醛 37%</td><td>VWR</td><td>104003100</td><td></td></tr><tr><td>碳钢外科手术刀片</td><td>Swann-Morton</td><td>206</td><td>在文稿中称为手术刀</td></tr><tr><td>抗人波形蛋白抗体</td><td>圣克鲁斯</td><td>sc-6260</td><td>克隆 V9</td></tr><tr><td>抗体稀释液</td><td>DAKO</td><td>S0809</td><td></td></tr><tr><td>HRP标记的抗小鼠IgG抗体</td><td>Life Technologies</td><td>32230</td><td></td></tr><tr><td>DAB试剂盒</td><td>DAKO</td><td>K500711</td><td></td></tr><tr><td>苏木精</td><td>Sigma</td><td>GHS232</td><td></td></tr><tr><td>EDTA缓冲液</td><td>未提供</td><td>无可用数据</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸盐缓冲液</td><td>未提供</td><td>未提供</td><td></td></tr><tr><td>兔多克隆抗GFP抗体</td><td>Abcam</td><td>无可用数据</td><td>Ab290</td></tr><tr><td>DAPI&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>对乙酰氨基酚，120 mg / 5 ml 糖浆</td><td>拜耳</td><td>未提供</td><td>Sinaspril，儿童用对乙酰氨基酚溶液</td></tr><tr><td>异氟烷 1000 mg/g</td><td>范德比尔特大学医学中心药房</td><td>无可用数据</td><td></td></tr><tr><td>盐酸丁丙诺啡，0.3 mg/ml</td><td>Indivior UK Limited</td><td>未提供</td><td></td></tr><tr><td>利多卡因-HCL 2%</td><td>范德比尔特大学医学中心药房</td><td>未提供</td><td></td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td>VWR</td><td>93003.1006</td><td></td></tr><tr><td>组织胶</td><td>Derma+Flex，配方医用氰基丙烯酸酯</td><td>Vygon</td><td>LB604060</td></tr><tr><td>滴眼液：Vidisec Carbogel，2 mg/ml</td><td>博士伦</td><td>未提供</td><td></td></tr><tr><td>D-荧光素钾盐</td><td>Gold Biotechnology</td><td>LUCK-1</td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>630-0954</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢环&amp;nbsp;</td><td>未提供</td><td>未提供</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;小鼠实验&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>小鼠，Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu&amp;nbsp; 雌性，6周龄到达，细菌状态符合FELASA标准</td><td>ENVIGO</td><td>未提供</td><td></td></tr><tr><td>纸浆智能家居（笼内环境丰富化）</td><td>生物服务</td><td>未提供</td><td></td></tr><tr><td>Alpha-dri 垫料材料</td><td>谢泼德特种纸业</td><td>未提供</td><td></td></tr><tr><td>小鼠饲料：Teklad 全球 18% 蛋白质啮齿类动物饮食</td><td>ENVIGO</td><td>2918-11416M</td><td></td></tr><tr><td>缝合线</td><td>Ethicon</td><td>V926H</td><td></td></tr><tr><td>剪刀</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3146-1EA</td><td>（或类似物）</td></tr><tr><td>镊子</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4142-1EA</td><td>（或类似物）</td></tr></tbody></table>

一种用于定义肿瘤细胞与间充质干细胞间由细胞外囊泡介导通讯的骨肉瘤小鼠临床前模型

A Preclinical Mouse Model of Osteosarcoma to Define the Extracellular Vesicle-mediated Communication Between Tumor and Mesenchymal Stem Cells

在肿瘤微环境中，定植或募集而来的间充质干细胞（MSCs）可促进多种癌症类型的恶性进展。在特定环境信号的影响下，这些成体干细胞能够释放旁分泌介质，从而加速肿瘤生长和转移。明确肿瘤细胞与间充质干细胞之间的相互作用，对于理解癌症进展的潜在机制并确定新的治疗干预靶点具有重要意义。
癌细胞会产生大量细胞外囊泡（EVs），这些囊泡可显著影响肿瘤微环境中或远端部位靶细胞的行为。肿瘤来源的EVs包裹着多种功能性生物分子，包括炎性RNA和（致癌）蛋白，能够“教育”间充质干细胞（MSCs），促进癌细胞的转移行为，或参与转移前微环境的形成。本文中，我们描述了一种可临床前应用的小鼠癌症模型的建立方法，该模型可用于特异性评估肿瘤细胞与间充质干细胞之间由EV介导的相互作用。首先，我们介绍了肿瘤细胞分泌的EVs的纯化与表征方法，以及MSCs对EVs内吞作用的检测。随后，采用基于多重微球的免疫分析法，评估癌源性EVs诱导的MSCs细胞因子表达谱的改变。最后，我们展示了构建发光标记的原位骨肉瘤异种移植小鼠模型的方法，该模型可真实再现肿瘤细胞与MSCs之间的相互作用，并揭示经EV“教育”后的MSCs在肿瘤生长和转移形成中的作用。
我们的模型为阐明癌症来源的细胞外囊泡（EV）如何塑造支持肿瘤的微环境提供了机会，并可用于评估阻断肿瘤细胞与间充质干细胞（MSCs）之间EV介导的通讯是否能够防止癌症进展。

本研究探讨了骨肉瘤分泌的细胞外囊泡（EV）将间充质干细胞（MSCs）诱导为促肿瘤和促转移表型的能力。我们发现骨肉瘤细胞释放出类似外泌体的EV，这些EV可被MSCs内化。我们检测了肿瘤来源EV诱导的MSC细胞因子表达谱的改变，并评估了经EV诱导后的MSC对肿瘤生长和转移形成的影响。研究设计的整体示意图见图1。
通过差速离心法纯化了143B骨肉瘤细胞或对照人成纤维细胞释放的细胞外囊泡（EVs）。通过电子显微镜确认EVs的纯度，结果显示制备物主要包含直径在40 - 100 nm之间的囊泡（图2A）。为了评估肿瘤来源的EVs是否与间充质干细胞（MSCs）发生相互作用，我们使用绿色荧光脂质亲和性标记染料（GFLD）对囊泡进行标记，并与靶细胞共孵育过夜。荧光显微镜观察显示MSCs能够高效摄取EVs（<strong...

直接注射癌源性细胞外囊泡（EVs）可导致骨髓重编程，从而促进肿瘤进展；然而，介导这一效应的具体细胞类型尚不明确。本文中，我们描述了一种逐步操作的实验方案，用于研究EV介导的肿瘤-间充质干细胞（MSC）相互作用。 体内，揭示了经细胞外囊泡教育的间充质干细胞在转移中的关键作用。

在肿瘤微环境中，定植或募集而来的间充质干细胞（MSCs）可促进多种癌症类型的恶性进展。在……条件下

本实验方案的总体目标是建立一种临床前小鼠模型，用于研究细胞外囊泡介导的肿瘤细胞与间充质干细胞之间相互作用的功能。该方法有助于解答肿瘤生物学领域中的若干关键问题，例如肿瘤细胞与间充质干细胞如何通过细胞外囊泡进行通讯，以及这种通讯是否促进癌症进展。该技术的主要优势在于，能够在体内研究肿瘤来源的细胞外囊泡对间充质干细胞功能适应性的影响，及其在肿瘤进展和转移形成中的作用。该操作的意义延伸至我们对癌症的治疗，因为我们可以利用GSA干扰细胞外囊泡（EV）介导的通讯和雄激素信号通路，从而抑制癌症进展。除了为骨肉瘤中EV介导的细胞通讯提供深入见解外，该方法还可应用于许多其他类型的癌症。事实上，来源于间充质干细胞的骨髓微环境可被迅速募集至多个部位，并分化为支持癌症发展的细胞。首先，在八个175平方厘米的培养瓶中分别接种300万个143B细胞。使用EV耗竭培养基培养细胞36至48小时。当细胞融合度达到80%至90%时，收集来自这八个培养瓶的上清液用于EV分离。接下来，采用差速离心法去除上清液中的全部细胞及细胞碎片。该过程包括在4°C条件下反复进行离心，离心时采用最大加速度和最大减速度。每次离心后，收集上清液，并在离心管中留下1 mL上清液。现在，将预清除的上清液以每管38.5毫升的量加入超速离心管中。然后，在4°C条件下，以70,000g离心1小时，使用慢速刹车，通过超速离心法分离EVs。超速离心结束后，小心移除上清液，留下约1毫升液体。然后，将含有EV的沉淀重悬于剩余体积中。合并所有悬液，并用PBS洗涤合并后的悬液。将试管加液至 38.5 毫升。然后重复超速离心循环，但不使用刹车。转子应在约一小时后停止旋转。接下来，小心地移除上清液，避免扰动沉淀，同时保留100至200微升溶液。最后，重悬EV沉淀，并用PBS调节终体积至200微升。随后，可对EV进行透射电镜（TEM）表征，或用染料标记以进行摄取实验，也可用于诱导间充质干细胞，以开展体内实验。在暴露于肿瘤来源的细胞外囊泡（EV）之前，确保原代间充质干细胞（MSCs）处于适当的细胞密度至关重要。细胞融合度应约为70%，以获得最佳的细胞与EV比例，同时防止在共培养期间细胞过度生长。本实验采用已适应环境的成年裸鼠（Athymic Nude-Foxn1nu小鼠）。手术前一天，通过饮水给予对乙酰氨基酚。手术当天，用 PBS 将 143B 细胞配制为每微升 200,000 个细胞。手术前 20 分钟，给予动物布托啡诺。在麻醉前，用10微升注射器吸取浓缩的143B细胞。确认动物已正确麻醉并涂抹眼膏后，将动物仰卧放置，后肢朝向操作者。接着，将麻醉面罩固定在动物身上。然后，弯曲左膝，用70%乙醇和聚维酮碘溶液交替擦拭皮肤三次，随后注射2%利多卡因作为局部麻醉剂。现在，在膝关节下方的皮肤上做一个小切口以暴露胫骨。接着，使用0.8毫米的微型钻头在胫骨上钻一个小孔，位置大约在膝关节下方2毫米处。避免钻穿胫骨的双侧皮质。以约五秒的时间缓慢注射一微升细胞至孔中。然后，用一滴组织胶封闭孔洞，以防止细胞悬液回流。使用缝线和一滴组织胶闭合皮肤，完成手术。让动物在加热条件下恢复，并给予对乙酰氨基酚治疗24小时。两天后，使用0.5毫米胰岛素注射器将间充质干细胞（MSCs）注入尾静脉。尾静脉注射给药是否正确可通过视觉确认。如果出现白色区域或遇到阻力，请在先前注射部位上方的区域重新注射。随后，每周两次使用生物发光技术监测肿瘤生长情况。使用胰岛素注射器向小鼠注射 D-荧光素，10 分钟后利用成像系统检测肿瘤细胞产生的光子通量。当动物的肿瘤直径超过 15 毫米，或体重减轻超过 15% 时，实施安乐死并采集所有相关组织。在实施安乐死前 10 分钟，按照成像前的操作方法注射 D-荧光素。安乐死后，使用灭菌的剪刀和镊子采集肺、肝、脾和肾。用 PBS 清洗器官上的血液，并将其放置于培养皿中用于成像。使用生物发光成像系统，记录器官的两面图像。获取图像后，应立即固定器官，以备后续组织学分析。处理照片文档时，只需进行手动阈值设定，并统计每张照片中的结节数量。务必对每张照片使用相同的阈值，并从各个方向对组织进行记录，尤其是肺组织。脱钙小鼠胫骨后，进行脱水和石蜡包埋。然后使用切片机制备六微米厚的石蜡切片，并将切片收集到载玻片上。待载玻片干燥后，在室温下存放过夜。第二天，使用柠檬酸盐缓冲液进行加热介导的抗原修复。然后，用1:900稀释的抗GFP抗体对组织进行染色，再用DAPI复染。最后，采用荧光显微镜记录染色后的组织切片。通过电子显微镜确认了分离的EVs的纯度。制备物中含有直径在40至100纳米之间的囊泡。为评估肿瘤来源的EVs是否与MSCs相互作用，将EVs用绿色荧光脂质染料标记后与MSCs共孵育过夜。因此证实了间充质干细胞（MSCs）对细胞外囊泡（EVs）的高效摄取。通过基于多重B类细胞因子免疫测定法，证实了EVs对MSCs具有免疫调节特性。与人成纤维细胞对照EVs相比，肿瘤来源的EVs可诱导MSCs中IL-8和IL-6的产生显著增加。接下来，在骨肉瘤的原位异种移植小鼠模型中，经EV教育的MSCs处理的小鼠显示出肿瘤生长加速。在全身注射表达GFP的MSCs四天后，可在骨髓和肿瘤组织中检测到表达GFP的细胞，表明MSCs归巢至肿瘤部位。对多种器官进行离体成像揭示了肺部结节的形成。最终，接受经EV教育的MSC的小鼠肺转移灶更多。观看本视频后，您应能充分理解如何在体外利用肿瘤来源的EV对基质细胞进行教育，并使用临床前小鼠模型研究经教育基质细胞在体内的作用。一旦掌握该技术，只要获得足量的肿瘤来源EV，整个实验可在四周内完成。在进行该实验操作时，必须提前规划，以实现肿瘤细胞外囊泡的可重复性纯化，并使用低传代的增殖型间充质干细胞。

a-preclinical-mouse-model-osteosarcoma-to-define-extracellular

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骨肉瘤前小鼠模型对肿瘤与间充质干细胞细胞外囊泡介导通信的定义

本研究报道的新方案通过联合方法实现了在小鼠中以单细胞分辨率选择性检测肺转移灶 原位 肺灌注与固定及X-Gal染色...

通过联合方法在单细胞分辨率下实现小鼠肺转移灶的优化可视化 原位 肺组织灌注与X-Gal染色 lacZ-标记的肿瘤细胞

本视频展示了用于影像引导下肿瘤切除及植入经基因工程改造、表达肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）的间充质干细胞（MSCs）的生物支架的外科手术操作。这类治疗性间充质干细胞在脑肿瘤治疗中具有潜在应用价值。...

荧光引导的肿瘤切除与间充质干细胞接种支架植入小鼠模型：一种将治疗性间充质干细胞递送至小鼠脑肿瘤切除腔的外科手术方法

本文介绍了一种从李-佛美尼综合征（Li-Fraumeni Syndrome, LFS）患者来源的成纤维细胞诱导生成诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs），通过间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）将iPSCs分化为成骨细胞，并建立疾病模型的方法 体内 使用LFS患者来源的成骨细胞研究肿瘤发生。...

利用Li-Fraumeni综合征患者来源的诱导性多能干细胞建立骨肉瘤模型

骨细胞外基质（BEM）骨肉瘤（OS）模型已得到充分建立，如图所示。该模型可作为模拟原发性肿瘤生长的合适支架 体外...

三维骨细胞外基质骨肉瘤模型

本文描述了采用甲基化特异性探针扩增法分析经骨肉瘤来源的细胞外囊泡处理的间充质干细胞中LINE-1元件甲基化水平的方法。同时展示了常用于从胎牛血清中分离细胞外囊泡的超速离心法。...

骨肉瘤来源细胞外囊泡处理的间充质干细胞中LINE-1甲基化分析

在本方案中，我们描述了一种用于测试（新）辅助治疗的软组织肉瘤不完全手术切除的小鼠模型。...

一种用于测试（新）辅助治疗的软组织肉瘤不完全切除小鼠模型

本文描述了一种同基因型原位移植后行截肢手术的小鼠骨肉瘤伴自发性肺转移模型，可用于转移生物学的临床前研究及新型治疗药物的开发。...

一种用于控制转移率的同系正位骨肉瘤Sprague Dawley大鼠截肢模型

本实验方案描述了通过胫骨内注射骨肉瘤细胞，建立携带原位骨肉瘤及肺转移病灶的小鼠模型。...

胫骨内骨肉瘤细胞注射法建立原位骨肉瘤及肺转移小鼠模型

该方案以骨肉瘤小鼠模型中益气解毒汤的煎剂配制及灌胃技术为例，提供了详细的标准化操作流程。方案阐述了动物保护措施，提升了研究数据的可靠性，为探究中药煎剂方剂的治疗效果及分子作用机制提供了有效的研究策略。 体内.

骨肉瘤模型小鼠中成药汤剂灌胃给药策略

本方案描述了利用人骨肉瘤组织建立患者来源的异种移植（PDX）小鼠模型的方法。...

建立人骨肉瘤组织来源的患者异种移植小鼠模型

了解肿瘤来源细胞外囊泡与间充质干细胞通信机制，使用临床前小鼠模型研究骨肉瘤进展。该方法可实时观察EV介导的肿瘤微环境相互作用，为癌症治疗提供新靶点。

一种用于定义肿瘤细胞与间充质干细胞间由细胞外囊泡介导通讯的骨肉瘤小鼠临床前模型

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