一种用于定义肿瘤细胞与间充质干细胞间由细胞外囊泡介导通讯的骨肉瘤小鼠临床前模型

本实验方案的总体目标是建立一种临床前小鼠模型，用于研究细胞外囊泡介导的肿瘤细胞与间充质干细胞之间相互作用的功能。该方法有助于解答肿瘤生物学领域中的若干关键问题，例如肿瘤细胞与间充质干细胞如何通过细胞外囊泡进行通讯，以及这种通讯是否促进癌症进展。该技术的主要优势在于，能够在体内研究肿瘤来源的细胞外囊泡对间充质干细胞功能适应性的影响，及其在肿瘤进展和转移形成中的作用。

该操作的意义延伸至我们对癌症的治疗，因为我们可以利用GSA干扰细胞外囊泡（EV）介导的通讯和雄激素信号通路，从而抑制癌症进展。除了为骨肉瘤中EV介导的细胞通讯提供深入见解外，该方法还可应用于许多其他类型的癌症。事实上，来源于间充质干细胞的骨髓微环境可被迅速募集至多个部位，并分化为支持癌症发展的细胞。

首先，在八个175平方厘米的培养瓶中分别接种300万个143B细胞。使用EV耗竭培养基培养细胞36至48小时。当细胞融合度达到80%至90%时，收集来自这八个培养瓶的上清液用于EV分离。

接下来，采用差速离心法去除上清液中的全部细胞及细胞碎片。该过程包括在4°C条件下反复进行离心，离心时采用最大加速度和最大减速度。每次离心后，收集上清液，并在离心管中留下1 mL上清液。

现在，将预清除的上清液以每管38.5毫升的量加入超速离心管中。然后，在4°C条件下，以70,000g离心1小时，使用慢速刹车，通过超速离心法分离EVs。超速离心结束后，小心移除上清液，留下约1毫升液体。

然后，将含有EV的沉淀重悬于剩余体积中。合并所有悬液，并用PBS洗涤合并后的悬液。

将试管加液至 38.5 毫升。然后重复超速离心循环，但不使用刹车。转子应在约一小时后停止旋转。

接下来，小心地移除上清液，避免扰动沉淀，同时保留100至200微升溶液。最后，重悬EV沉淀，并用PBS调节终体积至200微升。随后，可对EV进行透射电镜（TEM）表征，或用染料标记以进行摄取实验，也可用于诱导间充质干细胞，以开展体内实验。

在暴露于肿瘤来源的细胞外囊泡（EV）之前，确保原代间充质干细胞（MSCs）处于适当的细胞密度至关重要。细胞融合度应约为70%，以获得最佳的细胞与EV比例，同时防止在共培养期间细胞过度生长。本实验采用已适应环境的成年裸鼠（Athymic Nude-Foxn1nu小鼠）。

手术前一天，通过饮水给予对乙酰氨基酚。手术当天，用 PBS 将 143B 细胞配制为每微升 200,000 个细胞。手术前 20 分钟，给予动物布托啡诺。

在麻醉前，用10微升注射器吸取浓缩的143B细胞。确认动物已正确麻醉并涂抹眼膏后，将动物仰卧放置，后肢朝向操作者。接着，将麻醉面罩固定在动物身上。

然后，弯曲左膝，用70%乙醇和聚维酮碘溶液交替擦拭皮肤三次，随后注射2%利多卡因作为局部麻醉剂。现在，在膝关节下方的皮肤上做一个小切口以暴露胫骨。接着，使用0.8毫米的微型钻头在胫骨上钻一个小孔，位置大约在膝关节下方2毫米处。

避免钻穿胫骨的双侧皮质。以约五秒的时间缓慢注射一微升细胞至孔中。然后，用一滴组织胶封闭孔洞，以防止细胞悬液回流。

使用缝线和一滴组织胶闭合皮肤，完成手术。让动物在加热条件下恢复，并给予对乙酰氨基酚治疗24小时。两天后，使用0.5毫米胰岛素注射器将间充质干细胞（MSCs）注入尾静脉。

尾静脉注射给药是否正确可通过视觉确认。如果出现白色区域或遇到阻力，请在先前注射部位上方的区域重新注射。随后，每周两次使用生物发光技术监测肿瘤生长情况。

使用胰岛素注射器向小鼠注射 D-荧光素，10 分钟后利用成像系统检测肿瘤细胞产生的光子通量。当动物的肿瘤直径超过 15 毫米，或体重减轻超过 15% 时，实施安乐死并采集所有相关组织。在实施安乐死前 10 分钟，按照成像前的操作方法注射 D-荧光素。

安乐死后，使用灭菌的剪刀和镊子采集肺、肝、脾和肾。用 PBS 清洗器官上的血液，并将其放置于培养皿中用于成像。使用生物发光成像系统，记录器官的两面图像。

获取图像后，应立即固定器官，以备后续组织学分析。处理照片文档时，只需进行手动阈值设定，并统计每张照片中的结节数量。务必对每张照片使用相同的阈值，并从各个方向对组织进行记录，尤其是肺组织。

脱钙小鼠胫骨后，进行脱水和石蜡包埋。然后使用切片机制备六微米厚的石蜡切片，并将切片收集到载玻片上。待载玻片干燥后，在室温下存放过夜。

第二天，使用柠檬酸盐缓冲液进行加热介导的抗原修复。然后，用1:900稀释的抗GFP抗体对组织进行染色，再用DAPI复染。最后，采用荧光显微镜记录染色后的组织切片。

通过电子显微镜确认了分离的EVs的纯度。制备物中含有直径在40至100纳米之间的囊泡。为评估肿瘤来源的EVs是否与MSCs相互作用，将EVs用绿色荧光脂质染料标记后与MSCs共孵育过夜。

因此证实了间充质干细胞（MSCs）对细胞外囊泡（EVs）的高效摄取。通过基于多重B类细胞因子免疫测定法，证实了EVs对MSCs具有免疫调节特性。与人成纤维细胞对照EVs相比，肿瘤来源的EVs可诱导MSCs中IL-8和IL-6的产生显著增加。

接下来，在骨肉瘤的原位异种移植小鼠模型中，经EV教育的MSCs处理的小鼠显示出肿瘤生长加速。在全身注射表达GFP的MSCs四天后，可在骨髓和肿瘤组织中检测到表达GFP的细胞，表明MSCs归巢至肿瘤部位。对多种器官进行离体成像揭示了肺部结节的形成。

最终，接受经EV教育的MSC的小鼠肺转移灶更多。观看本视频后，您应能充分理解如何在体外利用肿瘤来源的EV对基质细胞进行教育，并使用临床前小鼠模型研究经教育基质细胞在体内的作用。一旦掌握该技术，只要获得足量的肿瘤来源EV，整个实验可在四周内完成。

在进行该实验操作时，必须提前规划，以实现肿瘤细胞外囊泡的可重复性纯化，并使用低传代的增殖型间充质干细胞。