A Preclinical Mouse Model of Osteosarcoma to Define the Extracellular Vesicle-mediated Communication Between Tumor and Mesenchymal Stem Cells

该实验程序的总体目标是开发一种临床前小鼠模型，以研究细胞外囊泡介导的肿瘤和间充质干细胞之间通讯的作用。这种方法可以帮助回答癌症生物学领域的几个关键问题，例如肿瘤和间充质干细胞如何通过细胞外囊泡进行交流，以及这是否支持癌症进展。该技术的主要优点是它允许研究癌症 EV 对间充质干细胞适应对体内进展和转移形成的作用。

该程序的含义延伸到我们对癌症的治疗，因为我们可以使用 GSA 来干扰 EV 通讯和雄激素信号传导来抑制癌症进展。除了提供对骨肉瘤中 EV 介导的通讯的见解外，该方法还可以应用于许多其他癌症类型。事实上，来自间充质干细胞的骨髓很容易被募集到更多部位，在那里它们可以分化成支持癌症的细胞。

首先接种 8 个 175 平方厘米的培养瓶，每个培养瓶有 300 万个 143B 细胞。使用 EV 耗尽培养基培养细胞 36 至 48 小时。当细胞汇合 80% 至 90% 时，从 8 个培养瓶中收集上清液进行 EV 分离。

接下来，使用差速离心从上清液中去除所有细胞和细胞碎片。这包括在 4 摄氏度下重复离心，具有最大的加速和减速。每个离心步骤后，收集上清液，并在离心管中留下 1 毫升上清液。

现在，将预先澄清的上清液以每管 38.5 mL 的浓度上样到超速离心管中。然后，使用 70， 000 g 的超速离心机分离 EV 一小时，缓慢休息并在 4 摄氏度下。超速离心后，小心去除上清液，留下约 1 毫升。

然后，将含 EV 的沉淀重悬于剩余体积中。汇集所有暂停。并用 PBS 洗涤混合的悬浮液。

将试管装满 38.5 毫升。然后，重复超速离心循环，但不休息。转子应在大约一小时后停止旋转。

接下来，小心地去除上清液，不要干扰沉淀，并留下 100 至 200 微升的溶液。最后，重悬 EV 沉淀，并用 PBS 将最终体积调整至 200 μL。然后可以通过 TEM 表征 EV，用染料标记用于摄取实验，或用于培养间充质干细胞进行体内实验。

在暴露于癌症 EV 之前，原代 MSC 处于正确的细胞密度至关重要。细胞应达到 70% 左右汇合度，以达到最佳细胞 EV 比率，并防止在教育期间过度生长。该实验使用适应的成年无胸腺裸体 Foxn1nu 小鼠。

手术前一天，通过饮用水提供扑热息痛。手术当天，在 PBS 中制备每微升 200， 000 个 143B 细胞。手术前 20 分钟，为动物提供丁丙诺芬。

麻醉前，将浓缩的 143B 细胞装入 10 微升注射器。确认适当的麻醉并涂抹眼药膏后，将动物仰卧，后腿朝向作者。接下来，将麻醉面罩固定在动物身上。

然后，弯曲左膝，用 70% 乙醇和聚维酮碘的三次交替磨砂膏擦拭皮肤，然后涂抹 2% 利多卡因作为局部镇痛药。现在，在膝盖下方的皮肤上做一个小切口，露出胫骨。然后，使用 0.8 millimiter 微麻花钻，在膝盖下方约 2 毫米的胫骨上打一个针孔。

避免钻穿两个胫骨皮质。在大约 5 秒内将 1 微升细胞缓慢注入孔中。然后，用一滴组织胶封闭孔，以防止悬浮液回流。

通过用缝合线和一滴组织胶闭合皮肤来完成手术。加热让动物恢复，并用扑热息痛治疗 24 小时。两天后，使用 0.5 毫米胰岛素注射器将 MSC 注射到尾静脉中。

可以目测确认尾静脉注射期间的正确给药。如果出现白色区域，或者您遇到阻力，请在前一个注射部位上方的区域再次注射。然后，每周两次，使用生物发光跟踪肿瘤生长。

通过胰岛素注射器向小鼠注射 D-荧光素，10 分钟后，使用成像系统测量肿瘤细胞产生的光子通量。当动物的肿瘤直径大于 15 毫米，或体重减轻超过 15% 时，对动物实施安乐死并收集所有相关组织。安乐死前 10 分钟，注射 D-荧光素，就像成像前所做的那样。

安乐死后，使用消毒过的剪刀和镊子收集肺、肝、脾和肾。使用 PBS 清洗器官中的血液，并将它们排列在培养皿上进行成像。使用生物发光成像系统，记录器官的两侧。

拍摄图像后，立即固定器官以备将来组织学分析。要处理照片文档，只需应用手动阈值，并计算每张照片中的结节数量。确保对每张照片使用相同的阈值，并记录来自各个方向的组织，尤其是肺部。

小鼠胫骨脱钙后，进行脱水和石蜡包埋。然后，使用切片机制备 6 微米石蜡切片，并将切片收集在载玻片上。玻片干燥后，在室温下储存过夜。

第二天，使用柠檬酸盐缓冲液进行热介导的抗原修复。然后，用 1 比 900 的抗 GFP 抗体对组织进行染色，然后进行 DAPI 复染。最后，使用荧光显微镜记录染色的组织切片。

通过电子显微镜确认分离的 EV 的纯度。这些制剂包含直径在 40 到 100 纳米之间的囊泡。为了评估癌症 EV 是否与 MSC 相互作用，用绿色荧光亲脂性接头染料标记 EV，并与 MSC 孵育过夜。

因此证实了 MSC 的有效 EV 摄取。使用基于多重 B 的细胞因子免疫测定证实了 EV 对 MSC 的免疫调节特性。与人成纤维细胞对照 EV 相比，肿瘤 EVs 导致 MSC 中 IL-8 和 IL-6 的产生增加。

接下来，在骨肉瘤的原位异种移植小鼠模型中，用 EV 诱导的 MSC 治疗的小鼠被证明肿瘤生长加速。全身注射表达 GFP 的 MSCs 后 4 天，在骨髓和肿瘤组织中检测到表达 GFP 的细胞，表明 MSC 归巢到肿瘤部位。各种器官的离体成像突出了肺结节的形成。

最终，接受 EV 教育的 MSC 的小鼠有更多的肺转移。看完这个视频，你应该对如何在体外用癌症 EV 对基质细胞进行教育有一个很好的了解，并使用临床前小鼠模型研究受过教育的基质细胞在体内的影响。一旦掌握，只要有足够的癌症 EV 可用，该程序可以在 4 周内进行。

在尝试此程序时，重要的是要提前计划并获得癌症细胞外囊泡的可重复纯化，以及使用低传代增殖间充质干细胞。