Drosophila guttifera 蛹期分期方法及翅色素沉积测量

本实验的总体目标是对斑腹果蝇（Drosophila guttifera）的蛹期进行分期，并测量其翅膀色素沉积情况。该方法有助于回答进化发育生物学领域中的关键问题，例如果蝇色素模式是如何形成的。该技术的主要优势在于，我们可以获得关于形态发育和色素沉积过程的详细信息。

尽管该方法可用于研究圆斑果蝇（Drosophila guttifera）的形态发育和色素沉积过程，但也适用于其他果蝇物种。开始剥离蛹壳时，先将一片双面胶贴在一张纸巾上。将一个蛹置于双面胶上，腹面朝上。

找到蛹壳前端与内部蛹体之间的空隙。用镊子夹住并从此处去除蛹壳，暴露蛹头部的前端。

将镊子的尖端沿前后轴方向平行插入，抬起镊子尖端，局部破坏蛹壳，重复此操作，直至破裂延伸至蛹壳的后部。

确保蛹壳与蛹的腿部之间形成间隙。在尽量减少对内部蛹体损伤的情况下，打开蛹壳的腹侧。在尽可能破开蛹壳后，使用精细的画笔将蛹取出。

将蛹置于已用ddH₂O润湿并放置在塑料培养皿中的滤纸上。立即拍照，因为暴露的蛹容易失水干燥。随后进行图像制备，用镊子去除蛹壳的前端部分。

取出蛹并将其放入塑料培养皿中的磷酸盐缓冲液（PBS）中。接着，剪下翅膀的基部关节。由于翅膀处于折叠状态，将其放入盛有ddH₂O的塑料培养皿中，利用渗透压使其展开。

每隔10分钟从种群中收集一次新羽化的成虫。使用CO2麻醉垫对果蝇进行麻醉。通过观察其不动状态确认麻醉成功，随后剪切翅基部关节。

在玻璃载玻片上滴加10微升PBS。将翅膀置于液滴中，然后用盖玻片覆盖液滴。

接下来，打开体视显微镜的光源并调至最大亮度。将物镜倍数设为11.5倍，光圈调至最开放状态。然后，打开相机并进行相机设置。

通过调节显微镜的调焦旋钮对样本进行对焦。按下遥控单元的快门按钮以拍摄图像。拍摄一张以盘状感器为中心的翅部图像，使翅的远端位于左侧，翅的内侧位于上方。

打开一张图像，使钟形感器斑点位于图像中心。点击图像，类型 1，8 位，将图像转换为 8 位图像。点击区域选择工具中的矩形，绘制一个矩形。

调整矩形的右侧，使其位于盘状感器斑点的右侧。点击“编辑”、“选择”、“添加到管理器”，然后勾选“显示全部”列。接着，在线条选择工具中点击角度工具。

在第三条纵脉的后线上绘制第一条线。将该线的左端点置于先前绘制的矩形的顶点处。在矩形的上侧绘制第二条线。

按下 M 键以测量此步骤中绘制的两条线之间的角度。单击计算机屏幕上图像的窗口。单击编辑、选择、添加到管理器。

在区域选择工具中点击矩形，绘制一个大小约为图像窗口九分之一的矩形。点击“编辑”、“选择”、“旋转”，在“角度”栏中输入先前测量角度的负值，然后点击“确定”以旋转本步骤中绘制的矩形。

使用方向键移动矩形，并将左侧第二条纵脉后缘的终点设置在矩形的该侧边上。矩形的下边需贴合第三条纵脉的后缘。确认已绘制从第二条纵脉终点至第三条纵脉后缘的垂线。

将垂线的垂足定义为点 A。将光标置于点 A 上时，在区域选择工具下方显示的坐标处记录点 A 的 X 坐标和 Y 坐标。打开以点 A 为中心的图像。点击图像，类型，8 位，将图像转换为 8 位图像。点击区域选择工具中的矩形工具，绘制一个大小约为图像窗口 1/9 的矩形。

单击“编辑”、“选择”、“指定”。勾选“椭圆”和“居中”列。在宽度和高度列中输入 100 像素。

将点A的X坐标写入X坐标列，将点A的Y坐标写入Y坐标列，然后点击确定。接下来，点击分析并测量。如果校准已完成，则光密度值将显示在平均值列中。比较多个阶段的数据发现，P12阶段是色素沉着开始的时间点，且在羽化后12小时完成色素沉着。

该技术建立后，为进化发育生物学领域的研究人员探索不同果蝇物种间蛹期发育及体色形成过程的差异开辟了道路。