Name: 用触印细胞学方法快速获得临床病理标本中高质量肿瘤 DNA (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: 学习使用触印细胞学方法从临床病理标本中快速获取高质量肿瘤DNA。该技术简化肿瘤细胞富集流程，支持二代测序分析，为癌症研究和临床诊断提供高效可靠的分子检测方案。

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我们感谢医院的所有医务人员和辅助人员，以及同意参与本研究的患者。我们感谢Edanz集团（www.edanzediting.com/ac）的Gabrielle White Wolf博士对本报告初稿进行编辑。本研究得到了山梨县基因组研究项目资助（Y.H. 和 M.O.）以及安田医学基金会资助（Y.H.）的支持。

1. 使用普通载玻片进行快速显微评估的组织印片制备
<ol>
	<li>在获得临床病理组织材料后，应尽快进行TIC制备。若无法立即制备TIC标本，需将组织材料用生理盐水浸湿的无菌纱布覆盖，并置于冰箱中保存，以防止组织干燥。</li>
	<li>准备体积约为5 mm3的组织材料，例如通过手术或内镜临床获取的实体瘤（例如，肝、肺和乳腺组织）。
	<ol>
		<li>若组织表面血液较多，应用生理盐水润湿的无菌纱布轻轻擦拭组织表面，并去除血液。</li>
		<li>对于活检等显微标本，应使用浸有生理盐水的无菌纱布保持样本湿润。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>若肿瘤团块肉眼不可见，应用修整刀切除并修整正常组织，暴露肿瘤病灶的表面。</li>
	<li>戴手套用手将切除标本的肿瘤表面多次轻触普通玻璃载片。肉眼确认接触区域覆盖普通玻璃载片面积超过80%。</li>
	<li>将普通玻璃载片轻轻按压在聚萘二甲酸乙二醇酯（PEN）膜载片上，并戴手套轻柔摩擦2–3次。肉眼确认细胞已从普通玻璃载片转移至PEN膜载片。</li>
	<li>将玻璃载片和PEN膜载片在室温下自然干燥5分钟。</li>
	<li>对普通玻璃载片进行染色，用于直接细胞学检查。先将载片浸入固定液中5秒，随后用吉姆萨染色液染色15秒。</li>
	<li>在显微镜下全面评估普通玻璃载片上的肿瘤成分和细胞密度，进行快速筛查。根据以下多个标准评估肿瘤细胞：细胞核增大、核型异常、染色质丰富、细胞分布不均、核质比、细胞大小及细胞极性。</li>
</ol>
2. 基因检测用PEN膜载玻片薄膜的制备
<ol>
	<li>如果通过快速显微镜评估（步骤 1.8）发现样本的肿瘤细胞含量超过 60%，则使用刀片和戴手套的手将 PEN 膜切片上接触肿瘤的部分薄膜切下用于 DNA 提取。用镊子和戴手套的手将切下的薄膜转移至无菌微量离心管中。</li>
	<li>如果通过快速显微镜评估（步骤 1.8）确定肿瘤细胞含量较低（肿瘤成分少于 60%），则使用激光捕获显微切割技术获取肿瘤样本。
	<ol>
		<li>采用标准操作流程进行吉姆萨染色，以识别肿瘤细胞。</li>
		<li>使用适当的激光捕获显微切割技术切割 PEM 膜切片上的薄膜。</li>
		<li>用镊子和戴手套的手将切割后的薄膜转移至无菌微量离心管中。</li>
		<li>将含有薄膜的微量离心管储存于 4 °C，直至进行 DNA 提取（此处可暂停本方案）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. DNA 提取
<ol>
	<li>使用FFPE DNA提取试剂盒，按照制造商说明书并稍作修改，从TIC或FFPE组织样本中进行DNA提取。FFPE DNA提取步骤可使用等效试剂盒。</li>
	<li>用200 µL手动移液器向含有组织切片的微量离心管中加入180 µL组织裂解缓冲液（pH = 8.3）。用20 µL手动移液器加入20 µL蛋白酶K，并使用涡旋振荡器在最大速度（约2,500 rpm）下涡旋混匀5秒。</li>
	<li>将样本置于空气恒温培养箱中，在56 °C下孵育过夜。</li>
	<li>将FFPE和TIC样本分别置于金属浴中，在90 °C下孵育1小时和10分钟。使用小型离心机在室温下以1,500 × g短暂离心5秒。</li>
	<li>用200 µL移液器向样本中加入200 µL裂解缓冲液，并在最大速度下涡旋振荡5秒，充分混匀。</li>
	<li>用200 µL移液器加入200 µL乙醇（96–100%），并在最大速度下涡旋振荡5秒，充分混匀。使用小型离心机在室温下以1,500 × g短暂离心5秒。</li>
	<li>用1,000 µL移液器小心地将全部裂解液转移至离心柱中，并在25 °C下以6,000 × g离心1分钟。</li>
	<li>戴手套将离心柱转移至新的2 mL收集管中，并将含有穿流液的旧收集管丢弃至塑料废弃物盒中。</li>
	<li>用1,000 µL移液器向离心柱中加入500 µL洗涤缓冲液，并在25 °C下以6,000 × g离心1分钟。</li>
	<li>戴手套将离心柱转移至新的2 mL收集管中，并将含有穿流液的旧收集管丢弃至塑料废弃物盒中。</li>
	<li>用1,000 µL移液器向离心柱中加入500 µL洗涤缓冲液，并在25 °C下以6,000 × g离心1分钟。</li>
	<li>将含有穿流液的收集管丢弃至塑料废弃物盒中。戴手套将离心柱转移至新的1.5 mL微量离心管中，并在25 °C下以20,000 × g离心3分钟，以干燥膜。</li>
	<li>戴手套将离心柱转移至DNA低吸附管中。
	<ol>
		<li>用100 µL移液器向膜中心加入40–50 µL洗脱缓冲液。</li>
		<li>室温孵育5分钟，然后在25 °C下以20,000 × g离心1分钟。</li>
		<li>将DNA样本储存于-20 °C，直至进行下一步（本方案可在此暂停）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 通过定量实时 PCR 评估 DNA 质量
<ol>
	<li>在无菌微量离心管中用移液器配制主混合液，具体如下：10 µL 的 2x 实时荧光定量 PCR 主混合液，1 µL 的 20x RNase P 引物-探针混合液（扩增子大小：87 bp），以及 8 µL 的无菌无核酸酶水。</li>
	<li>在另一无菌微量离心管中配制第二种主混合液，具体如下：10 µL 的 2x 实时荧光定量 PCR 主混合液，1 µL 的 20x RNase P 引物-探针混合液（扩增子大小：268 bp），以及 8 µL 的无菌无核酸酶水。</li>
	<li>对试剂盒中提供的对照人基因组 DNA 进行 4 次连续稀释，以建立五点标准曲线，并测定其绝对 DNA 浓度13。</li>
	<li>用 20 µL 移液器将步骤 4.1 和 4.2 中制备的两种主混合液各取 19 µL，分别加入光学 96 孔反应板的不同孔中。</li>
	<li>用 2 µL 移液器向含有反应混合液的不同孔中分别加入 1 µL 的 FFPE DNA 或 TIC DNA。另取一孔加入 1 µL 无核酸酶水作为无模板对照。</li>
	<li>握住光学粘性封板膜的非粘附面，从膜的中心位置剥离保护衬垫。轻轻推动压膜器，将封板膜平整地密封在 96 孔板上。</li>
	<li>在室温下使用 96 孔板混匀器以 2,000 rpm 轻柔混匀 96 孔板 10 秒。随后在室温下以 1,000 x&#160;g 短暂离心 3 分钟。</li>
	<li>开启实时荧光定量 PCR 仪器，将 96 孔板放入仪器中。运行以下 PCR 程序：95 °C 预变性 20 秒，随后进行 45 个循环（95 °C 变性 1 秒，60 °C 退火/延伸 20 秒）。选择 &#34;标准曲线&#34; 和 &#34;快速模式&#34;。</li>
	<li>通过长扩增子（268 bp）与短扩增子（87 bp）所测得的 DNA 相对定量值（RQ）之比评估 DNA 断裂程度。RQ 值为长扩增子的平均值除以短扩增子的平均值13。</li>
</ol>
5. 下一代测序文库的制备
<ol>
	<li>根据制造商的说明制备用于下一代测序的测序文库。</li>
	<li>在无菌微量离心管中按每份样本配制多重PCR预混液，具体如下：加入4 µL 5x多重PCR反应液、4 µL 5x引物混合液、≤6 µL TIC或FFPE DNA（1–100 ng），再用无核酸酶水补足至20 µL。
	<ol>
		<li>将多重 PCR 预混液加入 PCR 管中，轻轻敲击管壁混匀。</li>
		<li>使用小型离心机在室温下以1,500 x g离心5秒，短暂离心微离心管。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用以下程序进行PCR反应：99 °C 预变性2 min，随后进行20个循环（99 °C 变性15 s，60 °C 退火延伸4 min），最后在10 °C 保存。将PCR管在室温下用小型离心机以1,500 × g离心5 s，短暂离心收集反应液。 
	注意：根据引物对的数量确定循环次数。</li>
	<li>打开PCR管管盖，用2 µL移液器加入2 µL限制性内切酶。盖紧PCR管管盖，轻轻敲击PCR管混匀。将PCR管放入小型离心机中，于室温下以1,500 × g离心5秒。</li>
	<li>使用以下程序运行PCR反应：50 °C 10分钟，55 °C 10分钟，60 °C 20分钟，然后置于10 °C保存。将PCR管在室温下用小型离心机以1,500 × g离心5秒。</li>
	<li>将连接接头预混液用移液器加入含有已消化PCR扩增子的各孔中，具体成分为：4 µL 接头连接溶液、0.5 µL 条形码、0.5 µL 接头、2 µL 无核酸酶水和 2 µL DNA连接酶。盖紧PCR管盖，轻轻敲击混匀。使用小型离心机在室温下以1,500 × g离心5秒，使液体沉降至管底。</li>
	<li>使用以下程序运行PCR反应：30分钟22 °C，5分钟68 °C，5分钟72 °C，最后在10 °C保存。</li>
	<li>根据制造商说明书，使用磁珠纯化测序文库。</li>
	<li>将连接接头的文库溶液转移至1.5 mL DNA低吸附离心管中。向DNA低吸附离心管中加入45 µL磁珠，用于1st 纯化。轻轻敲击离心管混匀，室温孵育5分钟。</li>
	<li>将DNA低吸附管置于磁力架上，室温孵育2分钟，直至溶液澄清。用200 µL移液器小心吸除上清液，注意勿扰动磁珠。</li>
	<li>加入150 µL freshly prepared 70%乙醇，使用200 µL移液器，将管子在磁铁上来回移动以洗涤磁珠。小心弃去上清液，避免扰动磁珠。</li>
	<li>重复步骤 5.11 进行第二次洗涤。</li>
	<li>用小型离心机在室温下以1,500 × g离心5秒，短暂离心收集管内液体。将DNA低吸附管置于磁力架上，用10 µL移液器小心弃去乙醇液滴。</li>
	<li>向含有磁珠沉淀的DNA低吸附管中加入50 µL低TE缓冲液以分散磁珠。室温孵育2分钟。</li>
	<li>将DNA低吸附管置于磁力架上，室温孵育2分钟，直至溶液变澄清。</li>
	<li>将50 µL上清液转移至新的DNA低吸附管中，使用100 µL移液器加入75 µL磁珠，用于后续步骤2nd 纯化。轻轻敲击离心管混匀，室温孵育5分钟。</li>
	<li>将DNA低吸附管置于磁力架上，室温孵育2分钟，直至溶液澄清。用200 µL移液器小心吸除上清液，注意勿扰动磁珠。</li>
	<li>加入150 µL freshly prepared 70%乙醇，使用200 µL移液器，将管子在磁铁上来回移动以洗涤磁珠。小心弃去上清液，避免扰动磁珠。</li>
	<li>重复步骤 5.18 进行第二次洗涤。</li>
	<li>用小型离心机在室温下以1,500 × g离心5秒，短暂离心收集管内液体。将DNA低吸附管置于磁力架上，小心用10 µL移液器弃去乙醇液滴。</li>
	<li>向含有磁珠沉淀的DNA低吸附管中加入50 µL低TE缓冲液以分散磁珠。室温孵育2分钟。</li>
	<li>将DNA低吸附管置于磁力架上，室温孵育2分钟，直至溶液变澄清。</li>
	<li>将含有纯化文库的45 µL上清液用100 µL移液器转移至新的DNA低吸附管中。</li>
</ol>
6. 通过定量实时 PCR 定量文库浓度
<ol>
	<li>根据制造商说明书测定每个文库的浓度13。
	<ol>
		<li>配制20倍稀释液：在DNA低吸附管中，使用2 µL和100 µL移液器将2 µL纯化文库与38 µL无核酸酶水混合。</li>
		<li>将未稀释的文库在-20 °C保存，直至步骤7.3。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制200倍稀释液：在DNA低吸附管中，将5 µL 20倍稀释的纯化文库（步骤6.1制备）与45 µL无核酸酶水混合。</li>
	<li>配制2,000倍稀释液：在DNA低吸附管中，将5 µL 200倍稀释的纯化文库（步骤6.2制备）与45 µL无核酸酶水混合。</li>
	<li>配制反应主混合液：在无菌微量离心管中，使用移液器将10 µL 2x主混合液与1 µL 20x引物-探针检测试剂混合，轻轻敲击管壁混匀。将11 µL反应主混合液加入光学96孔反应板的各孔中。</li>
	<li>使用10 µL移液器向各孔中加入9 µL 2,000倍稀释的文库、9 µL各标准对照或9 µL无核酸酶水。</li>
	<li>握住光学粘性封膜的非粘附面，从膜中心剥离保护背衬。
	<ol>
		<li>轻轻将压膜器在膜上拖动，将封膜密封于96孔板上。</li>
		<li>在室温下使用96孔板混匀仪轻柔混匀96孔板，持续10秒。</li>
		<li>在室温下以1,000 x&#160;g短暂离心3分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>开启实时PCR仪，插入96孔板。运行以下PCR程序：50 °C 2分钟，95 °C 20秒，随后进行40个循环（95 °C 1秒，60 °C 20秒）。选择&#34;标准曲线&#34;和&#34;快速模式&#34;。</li>
	<li>将qPCR测定的浓度乘以2,000，计算未稀释文库的浓度。</li>
</ol>
7. 下一代测序
<ol>
	<li>规划运行条件并在软件中设置运行参数。
	<ol>
		<li>点击[计划]选项卡和[模板]，选择合适的运行方法。</li>
		<li>选择应用类型和技术类型，然后点击[下一步]。</li>
		<li>选择仪器、样本制备试剂盒（可选）、文库试剂盒类型、模板试剂盒、测序试剂盒、碱基调校模式、芯片类型、对照序列（可选）和条形码集合，然后点击[下一步]。</li>
		<li>选择插件并点击[下一步]。</li>
		<li>选择项目并点击[下一步]。</li>
		<li>选择目标区域的默认参考序列和BED文件。</li>
		<li>输入样本名称，选择条形码，然后点击[计划运行]。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据制造商的说明，在自动化仪器中进行模板制备和芯片上载。使用前将试剂盒在室温下解冻45分钟。</li>
	<li>根据步骤6.8计算的文库浓度，用无核酸酶水稀释未稀释的文库，制备20 pM的文库。
	<ol>
		<li>准备用于测序的混合文库，并置于冰上保存。</li>
		<li>使用100 µL移液器将25 µL混合文库加入样本管底部。混合文库需在48小时内使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>开启自动化仪器电源并打开盖子。
	<ol>
		<li>将测序芯片、芯片适配器、富集试剂盒、吸头盒、PCR板、PCR板封膜、回收管、溶液盒和试剂盒按正确位置放入自动化仪器中。</li>
		<li>在屏幕上点击[设置运行]和[逐步操作]。</li>
		<li>关闭盖子并在屏幕上点击[开始检查]。</li>
		<li>在台面扫描过程完成后，在屏幕上点击[下一步]。</li>
		<li>检查显示内容（试剂盒类型、芯片类型、芯片ID、样本ID、计划），设置时间，并在屏幕上点击[确定]。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>完成芯片上载后：
	<ol>
		<li>在屏幕上点击[下一步]并打开盖子。</li>
		<li>戴手套将测序芯片从芯片适配器中取出。</li>
		<li>将芯片放入芯片容器中，用Parafilm密封膜包裹，并在4 °C下保存至进行测序反应。</li>
		<li>戴手套将富集试剂盒、PCR板、PCR板封膜、回收管、溶液盒和试剂盒从自动化仪器的相应位置取出。</li>
		<li>戴手套将空吸头盒转移至自动化仪器的废吸头位置。</li>
		<li>点击[下一步]并关闭盖子。</li>
		<li>点击[开始]，通过紫外线对自动化仪器进行4分钟的清洁。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将一片次氯酸钠片剂溶解于1,000 mL超纯水中，并使用0.22 µm滤膜过滤装置过滤溶液。
	<ol>
		<li>开启测序仪器电源。</li>
		<li>在测序仪器屏幕上点击[清洁]和[下一步]。</li>
		<li>使用250 mL过滤除菌的次氯酸钠溶液清洁测序仪器，随后使用250 mL超纯水冲洗。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>点击[初始化]，并在屏幕上选择合适的测序试剂盒。
	<ol>
		<li>戴手套将灰色运输件安装到指定位置。</li>
		<li>使用清洗液（试剂盒提供）、pH调节液（含350 µL 100 mM氢氧化钠）和pH标准液（试剂盒提供）对测序仪器进行初始化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用100 µL移液器将dATP、dGTP、dCTP和dTTP核苷酸（试剂盒提供）各20 µL加入50 mL管中（试剂盒提供）。
	<ol>
		<li>戴手套将灰色运输件安装到指定位置。</li>
		<li>将50 mL管装入并旋紧至测序仪器上。</li>
		<li>在屏幕上点击[下一步]，启动初始化步骤，该过程约需25分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>完成初始化步骤后：
	<ol>
		<li>在屏幕上点击[运行]，并选择合适的文库制备仪器。</li>
		<li>扫描芯片的二维条形码。</li>
		<li>将测序芯片插入指定位置。</li>
		<li>关闭芯片夹具和仪器门。</li>
		<li>在屏幕上点击[芯片检查]、[下一步]和[确定]，以启动测序运行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测序反应完成后，将数据传输至测序服务器并执行数据分析流程13,17。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本研究中，我们提出了一种利用TIC从临床病理标本中获取肿瘤DNA的替代方法。与FFPE方法相比，TIC制备过程极为简便，所需时间更短，且无需特殊仪器10。从TIC制备到DNA提取的全部操作可在两天内完成（图1）。该方法因此显著缩短了进行基因检测的周转时间。值得注意的是，这在缩短分子分析所需天数方面具有显著优势。较短的周转时间使我们能够立即为需要分子靶向药物的进展期癌症患者提供合适的治疗方案。因此，该方法在肿瘤遗传学改变分析及癌症治疗中分子靶向药物的应用方面均具有重要优势。
使用TIC DNA进行遗传分析时，有几个关键点需要注意。肿瘤组织可能因化疗或其他治疗而发生坏死，因此在制备TIC样本时需格外谨慎，应尽可能避免从肿瘤的坏死区域取样。此外，初始的显微镜评估对于后续操作至关重要。同时，为成功制备TIC样本，必须防止肿瘤组织干燥。若肿瘤组织发生干燥，会导致玻片上附着的细胞数量减少，并且由于干燥会引起肿瘤组织退变，从而难以观察肿瘤细胞的细胞含量和形态特征。
<p class...

下一代测序技术为研究人员在遗传变异、孟德尔疾病、遗传易感性以及癌症等领域的基因组信息分析带来了显著进展1,2,3。癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas, TCGA）和国际癌症基因组联盟（International Cancer Genome Consortium, ICGC）已致力于识别多种常见癌症中的遗传改变4。数百个关键的癌症驱动基因已被成功鉴定，其中部分分子正作为药物研发的靶点1,5,6。
在临床环境中，福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）标本常用于多种疾病（包括癌症）的病理诊断和分子检测。然而，在福尔马林固定过程中，会发生DNA-蛋白质或DNA-DNA交联，并导致DNA片段化。因此，由于DNA的质量和数量较低，FFPE DNA样本并不总是适用于遗传学分析7,8,9。此外，制备FFPE标本需要数天时间，且准确切片需要较高的技术熟练度。因此，开发一种简便、快速获取高质量完整DNA的方法具有重要意义。
细胞学是病理诊断的一种替代方法。与FFPE制备相比，细胞学样本制备更为简便、成本更低且速度更快10。TIC技术已用于乳腺癌患者前哨淋巴结及边缘组织的术中快速诊断多年11,12。然而，关于是否能够从TIC样本中提取高质量基因组DNA并用于后续遗传学分析的报道仍较少。细胞学样本通常采用巴氏（Papanicolaou，Pap）染色或吉姆萨（Giemsa）染色，我们先前报道过，从TIC样本（尤其是吉姆萨染色样本）中提取的DNA在数量和质量上均优于从FFPE组织中获得的样本13。与巴氏染色相比，吉姆萨染色的优势在于染色步骤更少。在巴氏染色过程中，样本固定和染色后，必须使用封片介质（例如，Malinol）进行封片，以便在显微镜下区分肿瘤细胞、正常细胞和炎性细胞等样本成分。如果巴氏染色样本未进行封片处理，则因样本干燥而几乎无法在显微镜下观察细胞。相比之下，吉姆萨染色可在干燥状态下直接观察，因此无需封片步骤，有利于快速进行细胞评估。对于显微切割而言，吉姆萨染色更为适用，因其需要干燥的样本。
本报告中，我们介绍一种使用吉姆萨染色制备TIC标本的简单快速方法，并证明与FFPE标本相比，TIC是更优的DNA来源。

<table><tbody><tr><td>FINE FROST 白色20 微型载玻片</td><td>Matsunami Glass ind, Ltd</td><td>SFF-011</td><td></td></tr><tr><td>Arcturus PEN 膜载玻片</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LCM0522</td><td></td></tr><tr><td>Cyto Quick A 溶液</td><td>Muto Pure Chemicals</td><td>20571</td><td></td></tr><tr><td>Cyto Quick B 溶液</td><td>Muto Pure Chemicals</td><td>20581</td><td></td></tr><tr><td>May-Grunwald 溶液</td><td>Muto Pure Chemicals</td><td>15053</td><td></td></tr><tr><td>吉姆萨溶液</td><td>Muto Pure Chemicals</td><td>15002</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA FFPE 组织试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>56404</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4444557</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan RNase P 检测试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4316831</td><td></td></tr><tr><td>FFPE DNA 质控检测 v2 TaqMan 探针</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4324034</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Fast 光学 96 孔反应板&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4346907</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp 光学粘性封膜</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4311971</td><td></td></tr><tr><td>MicroMixer E36</td><td>TITEC</td><td>0027765-000</td><td></td></tr><tr><td>ViiA 7 实时荧光定量 PCR 系统</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>VIIA7-03</td><td></td></tr><tr><td>Himac CF16RXII</td><td>Hitachi-koki</td><td>CF16RII</td><td></td></tr><tr><td>Ion 文库 TaqMan 定量试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4468802</td><td></td></tr><tr><td>Ion AmpliSeq 癌症热点区域 Panel v2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4475346</td><td></td></tr><tr><td>Ion AmpliSeq 文库试剂盒 2.0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4480442</td><td></td></tr><tr><td>Ion Xpress 条形码接头 1-16 试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4471250</td><td></td></tr><tr><td>Ion PGM Hi-Q View 测序试剂盒（200 碱基）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A30044</td><td></td></tr><tr><td>Ion Chef 系统</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4484177</td><td></td></tr><tr><td>Veriti 96 孔梯度 PCR 仪</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Veriti200</td><td></td></tr><tr><td>Ion 318 芯片试剂盒 v2 BC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4488150</td><td></td></tr><tr><td>Ion PGM 系统</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PGM11-001</td><td></td></tr><tr><td>Ion PGM 清洗液 2 号瓶装试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A25591</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt&amp;trade; AMPure&amp;trade; XP 试剂盒</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>16 孔磁力架</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4457858</td><td></td></tr><tr><td>无粘性、无 RNase 微型离心管，1.5 mL（低吸附管）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM12450</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9938</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp&amp;trade; 光学 96 孔反应板</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4306737</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp&amp;trade; 透明粘性封膜</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4306311</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt&amp;trade; AMPure&amp;trade; XP 试剂盒</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>乙醇（99.5）</td><td>Nacalai Tesque</td><td>08948-25</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠（10 M）</td><td>Sigma</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td>DTU-Neo</td><td>TAITEC</td><td>0063286-000</td><td></td></tr><tr><td>E-36</td><td>TAITEC</td><td>0027765-000</td><td></td></tr><tr><td>ECLIPSE Ci-L</td><td>Nikon</td><td>704354</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS 移液器 L-2XLS+</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17014393</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS 移液器 L-10XLS+</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17014388</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS 移液器 L-20XLS+</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17014392</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS 移液器 L-100XLS+</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17014384</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS 移液器 L-200XLS+</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17014391</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS 移液器 L-1000XLS+</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17014382</td><td></td></tr><tr><td>petit-change</td><td>WAKEN</td><td>MODEL8864</td><td>迷你离心机</td></tr><tr><td>petit-incubator</td><td>WAKEN</td><td>WKN-2290</td><td>空气培养箱</td></tr><tr><td>SensiCare 无粉丁腈检查手套</td><td>MEDLINE</td><td>SEM486802</td><td></td></tr><tr><td>无菌纱布</td><td>Osaki</td><td>11138</td><td></td></tr><tr><td>MediCool 冷藏箱</td><td>SANYO</td><td>MPR-312DCN-PJ</td><td></td></tr><tr><td>FEATHER 修整刀片</td><td>FEATHER</td><td>No.130</td><td></td></tr><tr><td>FEATHER 修整刀片</td><td>FEATHER</td><td>No.260</td><td></td></tr><tr><td>FEATHER S</td><td>FEATHER</td><td>FA-10</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genius 3</td><td>IKA</td><td>41-0458</td><td>涡旋混合器</td></tr><tr><td>镊子</td><td>NATSUME</td><td>A-5</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>BIOBIK</td><td>RC-0150</td><td></td></tr></tbody></table>

利用触印细胞学技术从临床病理标本中简单快速获取高质量肿瘤dna的方法

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

在为癌症患者使用特定的分子靶向药物进行治疗前，确定肿瘤的突变状态至关重要。在临床实践中，福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织被广泛用于基因检测。然而，福尔马林固定过程通常会导致DNA受损和片段化。因此，由于DNA质量和数量较低，FFPE样本有时并不适合进行基因检测。本文介绍一种触印细胞学（TIC）方法，用于从可在显微镜下观察到的癌细胞中获取基因组DNA。利用TIC样本可评估细胞形态及癌细胞数量。此外，从TIC样本中提取基因组DNA可在两天内完成。采用该方法获得的TIC DNA总量和质量均高于FFPE DNA。这种快速且简便的方法使研究人员能够获得高质量的DNA用于基因检测（例如，下一代测序分析、数字PCR和实时定量PCR），并缩短结果报告的周转时间。

图1展示了从制备TIC样本到DNA提取的完整流程。值得注意的是，该方法仅需两天即可从TIC样本中获得基因组DNA。我们评估了在制片处理前肿瘤组织储存对结果的影响。结果发现，当组织样本直接接触载玻片，或在生理盐水浸润的无菌纱布中保存1小时后，肿瘤细胞均能良好地附着于载玻片上（图2）。然而，若组织在室温下放置，则肿瘤细胞无法很好地附着于载玻片。制备好的载玻片可在4 °C下保存三个月。因此，保持样本湿润、避免干燥至关重要。
我们评估了本方法的实用性，并将其与采用FFPE方法获得的样本进行了比较。从14个肿瘤样本中分别制备了TIC和FFPE样本，我们证实可通过TIC样本评估肿瘤含量和纯度。经吉姆萨染色后，可通过显微镜观察肿瘤细胞数量和肿瘤形态。因此，我们能够常规评估肿瘤细胞，并随后进行DNA质量检测。
<p class="jove_c...

从肿瘤组织中获取高质量基因组DNA是利用下一代测序技术分析遗传变异的关键第一步。本文介绍一种简单快速的方法，可从印片细胞学标本中富集肿瘤细胞并提取完整的DNA。

利用触印细胞学技术从临床病理标本中简单快速获取高质量肿瘤DNA的方法

在为癌症患者使用特定的分子靶向药物进行治疗前，明确肿瘤的突变状态至关重要。

本实验方案的总体目标是从临床样本中获取高质量的肿瘤DNA。该方法有助于回答基础与临床科学中的关键问题，例如癌症研究、诊断及治疗决策。该技术的主要优势在于，与以往方法相比，我们能够更简便、快速地获得肿瘤DNA。开始实验方案时，用戴着手套的手将先前制备并切除的组织的肿瘤表面在普通玻片上轻轻按压数次。目视确认按压区域覆盖超过玻片面积的80%。将普通玻片轻轻压在聚萘二甲酸乙二醇酯（Polyethylene Naphthalate，PEN）膜玻片上，并用戴着手套的手轻柔地摩擦两到三次。通过肉眼确认细胞已从普通玻片转移至 PEN 膜玻片上。将玻片和 PEN 膜玻片在室温下晾干五分钟。干燥后，对普通玻片进行染色，以供直接进行细胞学检查。将玻片浸入固定液中5秒，然后用吉姆萨染色液染色15秒。在光学显微镜下全面评估和筛查普通玻片上的肿瘤成分及细胞密度，以进行快速判断。根据多个标准对肿瘤细胞进行评价。如果通过上一节的快速显微镜评估发现样本中肿瘤细胞含量超过60%，则使用刀片和戴手套的手将PEN膜载玻片中接触肿瘤的薄膜切下用于DNA提取。用镊子套装和戴手套的手将切下的薄膜转移至无菌微量离心管中。将含有薄膜的微量离心管储存于4摄氏度，直至进行DNA提取。打开软件，规划运行条件并在软件中设置运行参数。单击“计划”选项卡并选择模板，然后选择合适的运行方法。选择应用和检测技术类型，然后单击下一步。选择仪器、样本制备试剂盒、文库试剂盒类型、模板试剂盒、测序试剂盒、碱基调零模式、芯片类型、对照序列和条形码集合，然后点击下一步。选择插件，然后点击下一步。选择项目，然后点击下一步。然后选择目标区域的默认参考序列和BED文件。输入样本名称，选择条形码，然后点击计划运行。接下来，根据制造商的说明，在自动化仪器中进行模板制备和芯片上样。使用前将试剂盒在室温下解冻45分钟。根据步骤6.8计算的文库浓度，用无核酸酶水稀释未稀释的文库，制备20皮摩尔的文库。为测序制备混合文库，并将其置于冰上保存。使用100微升移液器将25微升混合文库加入样品管底部。打开电源并开启自动化仪器的盖子。将测序芯片、芯片适配器、富集柱、吸头盒、PCR板、PCR板封膜、回收管、溶液盒和试剂盒放置到自动化仪器的相应位置。在屏幕上逐步设置并运行。关闭盖子，然后在屏幕上点击“开始检测”。在完成台面扫描过程后，点击“下一步”。检查显示内容、试剂盒类型、芯片ID、样本ID、芯片类型和运行计划。设置时间后点击“确定”。芯片加载完成后，点击“下一步”并打开盖子。戴手套将测序芯片从芯片适配器中卸下。将芯片放入芯片容器中，用封口膜包裹，并在测序反应前于4°C保存。然后，戴手套将富集柱、PCR板、PCR板封膜、回收管、溶液柱和试剂柱从自动化仪器的相应位置取出。戴手套将一个空的移液枪头盒转移至自动化仪器的废弃枪头位置。触摸下一步，然后关闭盖子。接着触摸启动，用紫外线清洁自动化仪器4分钟。将一片亚氯酸钠片溶解于1,000毫升超纯水中，并用0.22微米滤膜过滤该溶液。测序仪预热完成后，触摸测序仪屏幕上的“clean”和“next”按钮。使用250毫升滤膜除菌的亚氯酸钠溶液清洗测序仪，然后使用250毫升超纯水冲洗。接着触摸“initialize”按钮，并在屏幕上选择相应的测序试剂盒。戴手套安装灰船运载器。使用清洗液、pH 调节液和 pH 标准液初始化测序仪。接着，用 100 微升移液器将 20 微升的 DATP、DGTP、DCTP 和 DTTP 核苷酸分别加入 50 毫升离心管中。戴手套后将测序灰盒安装至指定位置。装入50毫升离心管，并将其旋紧到测序仪上。在屏幕上选择“下一步”以启动初始化步骤。完成初始化步骤后，触摸屏幕上的“run”按钮，并选择相应的文库制备仪器。扫描芯片的二维条形码。将测序芯片插入适当位置。关闭芯片夹和仪器门，然后在屏幕上依次点击芯片检测、下一步和确定，以启动测序运行。测序反应完成后，将数据传输至测序服务器并执行数据分析流程。绝对DNA含量及RQ值（基因组DNA降解程度的指标）结果显示，与FFPE样本相比，使用TIC样本可获得更高的DNA得率。此外，在不同肿瘤类型中，TIC DNA 的 RQ 值显著高于 FFPE DNA。APC Q1367* 在从位点一提取的 FFPE 和 TIC DNA 中均被检出，而 APC S1356*、KRAS G12D 和 TP53 M237i 则在从位点二、三和四提取的 FFPE 与 TIC DNA 中均被检测到，表明从相同肿瘤位点制备的配对 FFPE 和 TIC DNA 样本中鉴定出了相同的体细胞突变。值得注意的是，在原发性结直肠癌与两个转移性肝癌样本之间也检测到了相同的体细胞突变，提示来自位点二的肿瘤克隆已转移至肝脏。该技术问世后，为分子和医学研究领域的研究人员识别遗传性癌症铺平了道路。

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Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

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