Visualizing Lignification Dynamics in Plants with Click Chemistry: Dual Labeling is BLISS!

这种双重标记方法的总体目标是观察植物组织的活跃木质化区。在此工作流程中，化学报告基因策略在生物正交点击化学反应的顺序组合中使用两个不同的化学报告基因。这种方法可以帮助破译植物生物学领域的关键问题，例如确定哪些因素调节植物和墙壁内木质素的空间或时间形成。

该技术的主要优点是它仅针对代谢掺入过程中产生的木质素。它将其与样品中任何预先存在的木质素区分开来。虽然我们最初开发这种方法是为了研究木质素化标志，但它可以与其他物种一起使用，例如拟南芥、杨树或任何其他产生木质素的植物。

为了介绍这项技术，我们有 Clemence Simon，他是一名博士生，研究化学和生物学之间的界面，他正在使用这种技术来研究木质化动力学。首先，制备 300 μL 化学报告基因溶液，其中包含 10 μmüller 的 algene 标记的 G 报告基因。以及 10 个微量的叠氮化物标记的 H 报告基因和液体无菌 1/2 MS 培养基。

涡旋溶液并用移液管将其转移到 48 孔板的一个孔中。制备 300 μL 阴性对照溶液，其中含有 10 μmüler 的 G 和 10 μmülä 的 H 和液体无菌 1/2 MS 培养基。涡旋溶液并将其转移到同一 48 孔板的第二个孔中。

使用干净的剃须刀片，在离土壤水平 10 厘米的地方剪下一株两个月大的亚麻植物的茎。使用剃须刀片努力准备 50 个手茎的自由手横向横截面，并立即将它们放入 1/2 MS 培养基中。然后，选择完整的完整横截面，并将其中十个随机分布在装满化学报告溶液的孔中，注意不要损坏组织。

横截面必须切割牢固干净，并且横截面必须是直的。您需要一只稳定的手和锋利的剃须刀片，以保持组织完好无损。建议事先练习。

在阴性对照溶液中分配 10 个完整的横截面后，将板在 20 摄氏度的生长室中连续光下孵育 20 小时。第二天，用微量移液管去除每个孔中的单木醛溶液。向每个孔中加入 500 μL 1/2 MS 培养基，轻轻搅拌 10 分钟。

然后，用微量移液器去除冲洗液。制备 1 毫升菌株促进的叠氮化物-烷氨酸环加成溶液。包含 5 个 micromüller 的环辛烯标记荧光染料和液体无菌 1/2 MS 培养基。

然后，涡旋溶液。在代谢掺入方案的最后洗涤步骤之后，去除 1/2 MS 培养基，并用微量移液管向每个孔中加入 300 微升 SPAAC 溶液。将 48 孔板放在盒子中，使其免受光线照射。

然后，在环境温度下，在黑暗中在机械摇床上轻轻搅拌板 1 小时。在此之后，如前所述，用 1/2 MS 培养基洗涤每个孔四次，同时将板置于黑暗中。制备 1 毫升铜催化的叠氮化物烷烃环加成溶液，其中含有抗坏血酸钠、硫酸铜和叠氮化物标记的荧光染料，以及液体无菌 1/2 MS 培养基。

然后涡旋溶液。去除 1/2 MS 培养基后，将板放入盒子中，用微量移液管向每个孔中加入 300 微升 CuAAC 溶液。在机械摇床上，在环境温度下避光轻轻搅拌板 1 小时。

从机械摇床中取出板，用微量移液器从每个孔中取出 CuAAC 溶液。然后，加入 500 μL 1/2 MS 培养基，并在机械摇床上避光搅拌板 10 分钟。用 1/2 MS 培养基再洗涤两次后，向每个孔中加入 500 μL 的 7：3 甲醇和水溶液。

机械摇床上避光搅拌板 1 小时。然后，从孔中取出溶液。接下来，向每个孔中加入 500 μL 1/2 MS 培养基，并在黑暗中搅拌 10 分钟。

重复洗涤 4 次后，将横截面储存在 1/2 MS 培养基中，避光保存。将五滴封固剂滴在显微镜载玻片上。然后，小心地将每个化学报告基因标记的横截面放在载玻片上。

在载玻片的两侧涂抹指甲油。用盖玻片盖住载玻片，注意避免气泡。然后，使用纸巾去除多余的封固剂。

然后，用指甲油密封样品的四个侧面。指甲油干燥后，将载玻片在 4 摄氏度下避光储存，直到在共聚焦显微镜下观察。植物部分在干燥时容易变脆。

确保始终将它们保存在溶液中，并用指甲油密封盖玻片的四面。它延长了已安装玻片的保质期。将样品载玻片放在物镜下方的显微镜载物台上。

观察并旋转样品以确定植物组织的所需区域。接下来，在 Z 轴上选择荧光最强的平面。调整增益、偏移和激光功率，以实现每个通道在整个灰度范围内的最佳信号分布。

最后，获取高质量的共聚焦图像。BLISS 提供植物细胞壁内木质素的三种颜色定位图，专门针对代谢掺入过程中从头产生的木质素，并将其与样品中预先存在的木质素区分开来。它突出显示了器官不同组织内、组织不同细胞类型内或细胞不同壁层或亚结构内的活性木质化位点。

在亚麻次生木质部内，从形成层到髓的醛蛋白标记的 G 和叠氮化物标记的 H 报告基因掺入曲线表明，在发育过程中，纤维管胞会迅速达到最大的木质素化，而种族细胞在其生命的后期继续掺入木质素。改变化学报告基因比率表明，次生木质部组织中的木质素组成直接取决于细胞壁内的单木质素可用性。而不是木质素聚合过程中的过氧化物酶或漆酶特异性。

化学报告基因掺入仅限于一些韧皮纤维的细胞角和中间薄片初级细胞壁，但不是全部。在亚麻根中，化学报告基因掺入不存在 Casparian 带的内胚层细胞壁中。为了更好地可视化组织结构，还可以生成 3D Z 堆栈重建。

按照这种可视化，还可以执行全面的数据处理。采取了所有预防措施，可以通过相对比较、读取不同样品之间的样品来获得恒定的结果。除了不同领域的主动引导定位之外，还可以完成。

对于像我这样研究细胞壁的植物生物学家来说，这种方法是一个很好的工具。一旦掌握了，就可以在几个小时内完成。它非常敏感，可以应用于各种不同的体外体内实验模型系统。

将化学报告基因策略应用于木质素为化学生物学家探索木质素化动力学并找出控制这种聚合过程的因素铺平了道路，这在许多方面仍然构成了未知的领域。