Name: 血管紧张素 II. 型小鼠白细胞滚动和粘附的可视化技术及缺陷 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: 了解活体荧光显微成像技术如何可视化血管紧张素II诱导高血压小鼠颈动脉中的白细胞滚动与粘附行为，为研究血管功能障碍和免疫炎症机制提供实时动态观察方法。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作由德国联邦教育与研究部资助（BMBF 01EO1003 和 BMBF 01EO1503）。

实验在8至12周龄的雄性小鼠上进行，已获得莱茵兰-普法尔茨州动物实验伦理委员会批准（批准编号：23 177-07/G12-1-002 和 23 177-07/G15-1-051）。
1. 小鼠麻醉与手术准备
<ol>
	<li>手术前，确认动物的健康状况良好。手术前，每天监测动物 1 次，持续 2–3 天，观察其总体状况（外观、姿势、自发行为）以及体重、食物和水的摄入情况。</li>
	<li>配制麻醉用母液，包含咪达唑仑（5 mg/kg 体重）、美托咪定（0.5 mg/kg 体重）和芬太尼（0.05 mg/kg 体重），用 1 mL 注射器配制 200 µL/30 g 小鼠的剂量，使用 26 G 针头进行腹腔内（i.p.）注射。</li>
	<li>渗透泵植入及活体显微成像（IVM）实验的动物准备均在配备 39 °C 加热平台的手术区域进行。所有器械需在消毒液中消毒，加热平台也需进行表面消毒。</li>
	<li>操作过程中，使用眼膏保护动物的眼睛。在植入渗透泵前，使用剃须刀去除毛发。在 IVM 实验中进行颈动脉和颈静脉导管植入时，使用脱毛膏和棉签进行局部隔离。使用两种皮肤消毒剂对动物皮肤进行消毒：一种含聚维酮碘的抗菌消毒剂，另一种为含醇类奥替尼定的皮肤抗菌剂。&#160;</li>
	<li>配制麻醉拮抗剂母液（&#34;antisedan mix&#34;），包含阿替美唑（0.05 mg/kg 体重）和氟马西尼（0.01 mg/kg 体重），用 1 mL 注射器配制 200 µL/小鼠的剂量，使用 26 G 针头进行皮下（s.c.）注射。</li>
</ol>
2. 渗透压泵的制备与植入
注意：皮下输注血管紧张素II（AngII）使用渗透泵的方法已由 Lu et al.17 详细描述。
<ol>
	<li>用无菌生理盐水重悬冻干粉以配制AngII，并根据动物体重和泵的输注速率调整浓度。将重悬后的AngII保存在塑料管中（勿使用玻璃管）。</li>
	<li>将AngII溶液注入泵中，使其以1 mg/(kg·d)的剂量持续输注7天。制备完成后，将泵置于无菌生理盐水中，于37 °C孵育至少4–6小时。</li>
	<li>注射麻醉混合物后，通过后肢足部反射检测小鼠是否完全麻醉，并将其置于温暖的手术区域。麻醉诱导需10–15分钟，若将动物置于黑暗环境中，麻醉效果更佳。</li>
	<li>剃除小鼠下背部毛发，并使用含醇皮肤消毒剂进行消毒。</li>
	<li>使用剪刀沿垂直于脊柱方向做1 cm切口。用直止血钳创建一个皮下囊袋，将泵（先插入流量调节器端）置入其中。囊袋应确保泵可自由移动，且不对伤口产生压迫。</li>
	<li>使用缝线而非夹子关闭伤口，以减少炎症反应；随后用皮肤消毒剂再次消毒。</li>
	<li>皮下注射200 µL拮抗剂混合物以逆转麻醉，并将小鼠放回笼中。</li>
	<li>术后给予一次布托啡诺镇痛（0.075 mg/kg，皮下注射），之后根据动物行为按需追加给药。</li>
</ol>
3. 颈静脉导管植入与颈动脉准备
<ol>
	<li>注射麻醉混合物后，通过后肢足底反射检测小鼠是否完全麻醉，并将麻醉后的小鼠仰卧置于39 °C的手术加热板上&#160;，同时插入直肠探头以维持体温，并在眼睛上涂抹眼膏以在手术过程中保护角膜。</li>
	<li>使用脱毛膏去除颈部毛发。用棉签涂抹并揉搓脱毛膏约2分钟，直至毛发开始脱落。再等待2分钟后，用刮刀清除脱毛膏及脱落的毛发，并用酒精类皮肤消毒剂对皮肤进行消毒。</li>
	<li>在体视显微镜下进行手术。沿颈部气管旁1 cm处纵向切开皮肤，切口长度为1–1.5 cm，随后在该切口两端各作一条垂直切口。</li>
	<li>小心剥离皮下组织，移除覆盖左侧颈静脉和气管区域的皮肤片。</li>
	<li>使用两把弯头镊子仔细分离腮腺、舌下腺和颌下腺，使其远离操作区域。避免切割或损伤这些腺体，将其适当移位以充分暴露颈静脉和颈动脉。</li>
	<li>为分离颈静脉，使用细镊子缓慢开合，轻柔地将血管从周围组织中游离出来。待静脉完全暴露后，将镊子置于血管下方，并在其下放置两根各长10 cm的7-0缝线。</li>
	<li>将靠近头部一侧的缝线打双结结扎。另一根缝线先打一个活结，暂不收紧。</li>
	<li>一手用镊子夹持充满37 °C无菌生理盐水的导管（内径0.28 mm，外径0.61 mm），另一手用细剪刀或弯曲的26 G针头在血管壁上剪开一小口，随后将导管插入颈静脉，再将活结打紧两次完成固定。最后，在导管上方将靠近头部的缝线打结，以确保导管完全固定。</li>
	<li>为分离并准备颈动脉，使用细弯镊子解剖覆盖气管区域的组织。</li>
	<li>当颈动脉完全游离于周围组织后，将迷走神经（外观呈紧邻颈动脉的一条白色细线）从血管表面轻轻分离（但不得切断）。可使用细镊子闭合后缓慢张开的方式轻柔移动神经。</li>
	<li>待两侧颈动脉均彻底清洁后，将镊子置于第一条颈动脉下方，并在其下放置一根黑色塑料支撑片（宽3 mm，长2.5 cm）。操作中切勿过度牵拉血管，并在放置血管夹持器后立即确认血流是否通畅。将第二条颈动脉也置于夹持器上。若小鼠未直接置于显微镜下操作，应将腺体复位覆盖气管，并滴加37 °C无菌生理盐水以防止组织干燥。</li>
</ol>
4. 使用体内显微成像技术评估白细胞/LysM+细胞的滚动与黏附
<ol>
	<li>从保存在 -20 °C 的 2 mg/mL 储存液中配制吖啶橙，用无菌生理盐水按 1:4 稀释（最终浓度为 0.5 mg/mL），装入 1 mL 注射器中。避光保存，并每只小鼠使用 200 µL。
	<ol>
		<li>测试不同条件：（1）通过颈静脉导管注射吖啶橙；（2）直接向尾侧静脉注射吖啶橙（此条件下未植入颈静脉导管）；（3）使用荧光 LysMCre+IRG+ 小鼠不注射吖啶橙进行检测（同样未植入颈静脉导管）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>导管放置到位且两侧颈动脉分离后，将小鼠置于显微镜下。使用配备长距离聚光镜、10X（NA 0.3）水浸物镜、单色器、分光镜和电荷耦合器件相机的高速宽场荧光显微镜进行检测。通过实时成像系统完成图像采集与分析。</li>
	<li>将显微镜物镜聚焦于颈动脉中段的内皮表面。缓慢注射 50 µL 吖啶橙（0.5 mg/mL）（首次注射时需考虑导管的死体积）。设置软件以每幅图像曝光 120 毫秒的参数连续采集 100 幅图像。</li>
	<li>每侧颈动脉（左侧和右侧）在不同位置各录制四段视频。若荧光信号减弱，可再次注射 50 µL 吖啶橙。</li>
	<li>完成所有视频录制后，通过颈椎脱位法处死动物。</li>
	<li>将视频播放速度设为每秒 10 帧，在每段视频中选取位于血管中央的 200 µm × 250 µm 矩形区域，定量分析滚动和黏附的细胞数量；其中黏附细胞定义为在 10 秒视频中未移动或未从内皮脱离的细胞。为简化定量过程，去除红色荧光通道，仅使用绿色荧光通道计数滚动和黏附的细胞。</li>
	<li>对于使用吖啶橙的实验，需手动设定荧光阈值，以消除内皮细胞产生的背景信号。</li>
</ol>

<ol><li>Lewington, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-specific+relevance+of+usual+blood+pressure+to+vascular+mortality%3A+a+meta-analysis+of+individual+data+for+one+million+adults+in+61+prospective+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Age-specific relevance of usual blood pressure to vascular mortality: a meta-analysis of individual data for one million adults in 61 prospective studies.</a> Lancet. 360, 1903-1913 (2002).</li>
<li>Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mosaic+theory+revisited%3A+common+molecular+mechanisms+coordinating+diverse+organ+and+cellular+events+in+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Hypertens%22%5BJournal%5D)">The mosaic theory revisited: common molecular mechanisms coordinating diverse organ and cellular events in hypertension.</a> J Am Soc Hypertens. 7, 68-74 (2013).</li>
<li>Guzik, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+T+cell+in+the+genesis+of+angiotensin+II+induced+hypertension+and+vascular+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Role of the T cell in the genesis of angiotensin II induced hypertension and vascular dysfunction.</a> J Exp Med. 204, 2449-2460 (2007).</li>
<li>De Ciuceis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+vascular+remodeling%2C+endothelial+dysfunction%2C+and+oxidative+stress+in+resistance+arteries+of+angiotensin+II-infused+macrophage+colony-stimulating+factor-deficient+mice%3A+evidence+for+a+role+in+inflammation+in+angiotensin-induced+vascular+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Reduced vascular remodeling, endothelial dysfunction, and oxidative stress in resistance arteries of angiotensin II-infused macrophage colony-stimulating factor-deficient mice: evidence for a role in inflammation in angiotensin-induced vascular injury.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25, 2106-2113 (2005).</li>
<li>Wenzel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysozyme+M-positive+monocytes+mediate+angiotensin+II-induced+arterial+hypertension+and+vascular+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Lysozyme M-positive monocytes mediate angiotensin II-induced arterial hypertension and vascular dysfunction.</a> Circulation. 124, 1370-1381 (2011).</li>
<li>Kossmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-localized+FXI+promotes+a+vascular+coagulation-inflammatory+circuit+in+arterial+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Platelet-localized FXI promotes a vascular coagulation-inflammatory circuit in arterial hypertension.</a> Sci Transl Med. 9, (2017).</li>
<li>Rodriguez-Iturbe, B., Pons, H., Johnson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+Immune+System+in+Hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Role of the Immune System in Hypertension.</a> Physiol Rev. 97, 1127-1164 (2017).</li>
<li>Masedunskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy%3A+a+practical+guide+on+imaging+intracellular+structures+in+live+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Bioarchitecture%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy: a practical guide on imaging intracellular structures in live animals.</a> Bioarchitecture. 2, 143-157 (2012).</li>
<li>Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy%3A+a+novel+tool+to+study+cell+biology+in+living+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy: a novel tool to study cell biology in living animals.</a> Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).</li>
<li>Wenzel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heme+oxygenase-1+suppresses+a+pro-inflammatory+phenotype+in+monocytes+and+determines+endothelial+function+and+arterial+hypertension+in+mice+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Heme oxygenase-1 suppresses a pro-inflammatory phenotype in monocytes and determines endothelial function and arterial hypertension in mice and humans.</a> Eur Heart J. 36, 3437-3446 (2015).</li>
<li>Pawelski, H., Lang, D., Reuter, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+monocytes+and+platelets%3A+implication+for+life%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci+%28Schol+Ed%29%22%5BJournal%5D)">Interactions of monocytes and platelets: implication for life.</a> Front Biosci (Schol Ed). 6, 75-91 (2014).</li>
<li>Hinsbergh, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelium--role+in+regulation+of+coagulation+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Endothelium--role in regulation of coagulation and inflammation.</a> Semin Immunopathol. 34, 93-106 (2012).</li>
<li>Njock, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+suppress+monocyte+activation+through+secretion+of+extracellular+vesicles+containing+antiinflammatory+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells suppress monocyte activation through secretion of extracellular vesicles containing antiinflammatory microRNAs.</a> Blood. 125, 3202-3212 (2015).</li>
<li>Colognato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+and+regulation+of+protease-activated+receptors+in+human+peripheral+monocytes+and+monocyte-derived+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Differential expression and regulation of protease-activated receptors in human peripheral monocytes and monocyte-derived antigen-presenting cells.</a> Blood. 102, 2645-2652 (2003).</li>
<li>Schaffner, A., Rhyn, P., Schoedon, G., Schaer, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+expression+of+platelet+factor+4+in+human+monocytes--role+of+PARs+as+a+quantitatively+important+monocyte+activation+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulated expression of platelet factor 4 in human monocytes--role of PARs as a quantitatively important monocyte activation pathway.</a> J Leukoc Biol. 78, 202-209 (2005).</li>
<li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li>
<li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcutaneous+Angiotensin+II+Infusion+using+Osmotic+Pumps+Induces+Aortic+Aneurysms+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Subcutaneous Angiotensin II Infusion using Osmotic Pumps Induces Aortic Aneurysms in Mice.</a> J Vis Exp. , (2015).</li>
<li>Koh, T. J., DiPietro, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+wound+healing%3A+the+role+of+the+macrophage%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Inflammation and wound healing: the role of the macrophage.</a> Expert Rev Mol Med. 13, e23(2011).</li>
<li>Dargaud, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proposal+for+standardized+preanalytical+and+analytical+conditions+for+measuring+thrombin+generation+in+hemophilia%3A+communication+from+the+SSC+of+the+ISTH%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Proposal for standardized preanalytical and analytical conditions for measuring thrombin generation in hemophilia: communication from the SSC of the ISTH.</a> J Thromb Haemost. , (2017).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露

LysM+ 单核细胞先前已被证明与高血压的发生有关5. 这里我们证明 LysM+ 免疫细胞在血管紧张素II输注后发生滚动并黏附于内皮层。该发现通过LysMCre获得+IRG+ 我们先前研究免疫细胞在高血压中作用时使用的小鼠 体内 通过注入吖啶橙对白细胞进行可视化观察6,10因此，无法区分黏附于内皮细胞的细胞类型。
IVM 是进行血管研究的一种非常有用的工具 体内 直接观察血管内的细胞，但通过手术植入导管注射染料在高血压炎症环境下的影响仍不清楚。为了评估导管及吖啶橙注射的潜在影响，我们利用了 LysMCre+IRG+ 小鼠。AngII输注增加了滚动的LysM+ 细胞与内皮的黏附。将导管插入颈静脉后，该效应得到增强，在接受血管紧张素II输注并植入导管的小鼠中，检测到的滚动和黏附白细胞数量多于未植入导管的小鼠。这表明，在高血压相关的免疫反应背景下，颈动脉导管植入会引发与伤口愈合相关联的全身性炎症反应。18此外，由于颈静脉与颈动脉位置相近，穿刺过程中可能影响到颈静脉，从而引发额外的免疫激活。由于直接注入尾静脉时未观察到该效应，因此可推断此效应并非由染料引起，而是导管插入操作所致。本文证明了在使用表达荧光蛋白的转基因报告小鼠时，所采用的方法不应干扰 体内 实验过程中，尾静脉注射荧光示踪剂可能是颈静脉导管注射的一种可行替代方法。
该实验流程中的一个关键步骤是血管紧张素II（AngII）的输注。可通过尾套法测量血压，以监测泵输注AngII的效果。输注2−3天后，血压应有所升高。为了减少可能影响LysM+细胞活化的炎症反应，在植入泵的切口闭合时应使用缝线而非夹子。关于尾静脉注射需指出一个局限性：为了获得最佳的数据采集效果，通常需要对每侧颈动脉采集4段视频。如果荧光信号减弱，可注射50 µL吖啶橙，但通过尾静脉注射时，多次给药操作更为困难，且难以在显微镜物镜下保持颈动脉的稳定。导管在颈静脉中留置的时间长度也可能调节免疫细胞的活化状态，因为导管植入4小时后制备的富血小板血浆中凝血活化会受到影响19。这一导管植入相关问题仍需进一步研究。
最后，即使我们认识到颈静脉导管植入对LysM的影响+ 在血管紧张素II输注后细胞活化的情况下，我们无法充分评估制备过程、皮肤去除以及颈动脉分离对潜在LysM的影响+ 细胞激活。我们得出结论：使用LysMCre等荧光报告小鼠+IRG+ 建议使用小鼠，以避免在动物制备过程中对血管完整性造成破坏 体内 成像

动脉性高血压会增加心血管疾病和死亡的风险，并促进动脉粥样硬化、冠心病以及动脉或静脉血栓栓塞的发生1。高血压的发生取决于环境、遗传、内分泌和血流动力学因素之间的相互作用。目前认为，免疫系统及其相关的炎症反应在高血压的病因学中发挥着重要作用2。
在免疫细胞中，T淋巴细胞以及单核细胞和巨噬细胞被发现与血管紧张素II（AngII）诱导的血管炎症和高血压具有因果关系，部分原因在于它们能够触发活性氧的产生3。巨噬细胞集落刺激因子缺乏的小鼠在AngII诱导的血压升高和血管炎症反应中表现出减弱的反应4。在之前的研究中，我们已证明LysM+单核细胞在AngII诱导的高血压中驱动血管功能障碍和炎症5。最近，我们描述了一条新途径，其中凝血因子XI与血小板和血管壁协同作用，诱导凝血酶依赖性的血管炎症6。Rodriguez-Iturbe et al.最近对免疫系统在高血压中作用的现有知识进行了系统总结和综述7
自从免疫细胞在高血压发展中的作用变得明确以来，研究血管与免疫细胞相互作用的模型和技术变得必要。血管的落射荧光体内显微成像（epifluorescence IVM）是一种用于观察 体内 循环血细胞与血管内皮之间的相互作用8,9,10通过该技术，可注射嵌入DNA的染料（如吖啶橙），以观察有核细胞（包括循环中的细胞及内皮来源的细胞）。经染色的分离血小板 离体 可注射罗丹明-6G或二氯荧光素（DCF）以在动脉或静脉损伤模型中可视化富含血小板的血栓。
通常使用颈静脉导管注射示踪剂或标记的血小板。已知内皮的改变以及随之而来的凝血级联反应的激活均会影响单核细胞的活化。内皮损伤会立即通过内皮下基质分子激活血小板以封闭组织，进而吸引并激活单核细胞11。相反，完整的内皮具有抗凝特性（例如，通过组织因子通路抑制物或血栓调节蛋白）12，并对单核细胞产生直接抑制作用，例如，通过分泌含有微小RNA的细胞外囊泡13。已知单核细胞可产生组织因子（凝血级联反应的外源性激活物），并表达蛋白酶激活受体（PARs），后者可被凝血酶激活并参与单核细胞的活化14,15。因此，由于血管损伤导致的血小板或凝血级联反应的任何激活，都可能对单核细胞活化产生意想不到的影响，从而干扰所观察到的现象。借助IRG转基因LysM Cre转基因小鼠，即双荧光Cre报告小鼠（LysMCre+IRG+），我们拟在动脉高血压小鼠模型中，深入研究导管注射及其他替代方法对LysM+骨髓单核细胞的影响16。

<table><tbody><tr><td>咪达唑仑</td><td>Ratiopharm GmbH</td><td></td><td>麻醉混合液</td></tr><tr><td>美托咪定</td><td>Pfizer Deutschland GmbH</td><td></td><td>麻醉混合液</td></tr><tr><td>芬太尼</td><td>Janssen-Cilag GmbH</td><td></td><td>麻醉混合液</td></tr><tr><td>Alzane</td><td>Zoetis</td><td></td><td>安替西丹混合液</td></tr><tr><td>氟马西尼</td><td>Hikma pharma</td><td></td><td>安替西丹混合液</td></tr><tr><td>Braunol</td><td>B Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Octeniderm</td><td>施&amp;uuml;lke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>渗透压泵</td><td>Alzet</td><td>1007D</td><td>渗透泵植入</td></tr><tr><td>血管紧张素 II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>渗透泵植入</td></tr><tr><td>7-0 Prolene缝合线</td><td>Ethicon</td><td></td><td>渗透泵植入</td></tr><tr><td>吖啶橙</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>导管</td><td>Smiths Medical Deutschland GmbH</td><td></td><td>内径，0.28 mm；外径，0.61 mm</td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Olympus</td><td>BX51WI 荧光显微镜</td><td></td></tr><tr><td>分光镜</td><td>Photometrics</td><td>CMR-DV2-SYS - DualView2 显微成像系统</td><td></td></tr><tr><td>目的</td><td>奥林巴斯</td><td>UMPLFLN10X</td><td>水浸物镜配合单色器</td></tr><tr><td>相机</td><td>滨松光子</td><td>ORCA-R2</td><td></td></tr><tr><td>图像采集与分析软件</td><td>Olympus</td><td>实时成像系统 eXcellence RT</td><td></td></tr><tr><td>小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>Jax 008705</td><td>B6.Cg-Tg(CAG-DsRed,-EGFP)5Gae/J</td></tr><tr><td>小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>Jax 004781</td><td>LysM Cre（B6.129P2-&lt;em&gt;Lyz2&lt;sup&gt;tm1(cre)Ifo&lt;/sup&gt;&lt;/em&gt;/J )</td></tr></tbody></table>

可视化血管紧张素ii输注小鼠中白细胞滚动与黏附：技术与注意事项

Visualizing Leukocyte Rolling and Adhesion in Angiotensin II-Infused Mice: Techniques and Pitfalls

利用落射荧光活体视频显微镜（IVM）观察血管是评估免疫细胞活化状态及其在内皮层上滚动和黏附能力的成熟方法。通常通过注射荧光染料或荧光素偶联抗体来标记循环细胞以实现可视化。此外，也可使用荧光报告小鼠。白细胞（特别是溶菌酶 M+（LysM+）单核细胞）与血管壁之间的相互作用在促进血管功能障碍和动脉性高血压过程中发挥关键作用。本文介绍了利用IVM技术在血管紧张素II（AngII）诱导的小鼠高血压模型中，对颈动脉内白细胞滚动与黏附进行可视化和定量分析的方法。
导管植入会损伤血管壁，导致血细胞反应发生改变。我们比较了不同的注射技术和给药途径，以在广泛表达红色荧光蛋白且LysM+细胞条件性表达绿色荧光蛋白的LysMCre+IRG+小鼠中可视化白细胞。为了研究LysM+细胞的活化情况，我们采用了血管紧张素II（AngII）输注小鼠模型，该模型中白细胞在内皮上的滚动和黏附增加。我们通过颈静脉导管或直接经尾静脉注射吖啶橙，并比较了滚动和黏附细胞的数量。结果发现，与对照组相比，假输注的LysMCre+IRG+小鼠在仅植入颈静脉导管后，滚动和黏附的LysM+细胞数量即显著增加。这种活化在AngII输注小鼠中进一步增强。有趣的是，在假输注小鼠中，直接通过尾静脉注射吖啶橙并未增加LysM+细胞的黏附或滚动。因此，我们证明了在实验过程中，使用表达荧光蛋白的转基因报告小鼠时，必须避免干扰体内生理过程的重要性。此外，尾静脉注射荧光示踪剂可能是颈静脉导管注射的一种可行替代方法。

通过体内显微镜（IVM）观察了输注 AngII 的 LysMCre+IRG+ 小鼠的颈动脉。通过颈静脉导管注射吖啶橙。我们旨在评估与血管壁接触的 LysM+ 细胞占所有有核循环细胞的比例（这些有核细胞均可能与血管发生相互作用，因为此前研究中尚未明确何种类型细胞与血管发生相互作用）。在基线状态下，颈静脉导管的存在可导致 LysM+ 细胞发生黏附（图 2A，D）。注射吖啶橙后，相同的细胞呈现荧光，同时内皮细胞也呈现荧光（图 2B，E）。在降低背景荧光以排除内皮细胞相关荧光干扰后，数据表明所有黏附的有核细胞均为 LysM+ 细胞（图 2C，F）；该结果在输注 AngII 后仍然成立，验证了我们此前的研究结果，并证明 LysMCre+IRG+ 小鼠是观察 AngII 对 LysM+ 细胞活化作用的良好模型。
我们评估了吖啶橙在LysMCre+IRG+小鼠中经血管紧张素II（AngII）输注后，通过不同给药途径对LysM+细胞活化的影响。在AngII输注一周后，通过颈静脉导管或尾静脉注射吖啶橙，利用活体显微成像技术（IVM）对LysMCre+IRG+小鼠颈动脉中的白细胞-内皮细胞相互作用进行成像和观察。与未处理小鼠相比，未进行任何导管插入或注射的情况下，AngII输注后LysM+细胞的滚动显著增加，黏附亦有所上升（图3）。通过颈静脉导管注射吖啶橙后，AngII处理小鼠的黏附和滚动程度较未置入导管的小鼠进一步增强（图3）。而通过尾静脉注射吖啶橙的小鼠，其细胞黏附和滚动水平与未注射吖啶橙的小鼠相似（图3）。
<img alt="血管紧张素II输注小鼠模型示意图，显示颈动脉分离用于细胞观察和定量。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56948/56948fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1. 小鼠血管紧张素II输注及LysM+细胞在颈动脉滚动与黏附的检测示意图。 LysMCre+IRG+小鼠经血管紧张素II（AngII）输注7天后，通过颈静脉导管或尾静脉注射吖啶橙，对颈动脉上黏附及滚动的LysM+细胞进行定量分析。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56948/56948fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="荧光显微镜图像；细胞活动、光学分析、光谱比较，100 μm 比例尺。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56948/56948fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2. LysM+ 细胞在 LysMCre+IRG+ 小鼠颈动脉中黏附与滚动的评估。 通过颈静脉导管注射吖啶橙前（A, D）和注射后（B, E）LysMCre+IRG+ 小鼠体内 LysM+ 细胞的黏附情况。记录红色和绿色荧光，可见 LysM+ 细胞（绿色）和平滑肌细胞（红色）。注射吖啶橙后，内皮细胞也呈绿色可见，但通过去除背景荧光可实现仅对循环有核细胞的观察（C, F）。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56948/56948fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="静态平衡柱状图、显微镜图像；吖啶橙注射对细胞黏附的影响、血管紧张素II输注" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56948/56948fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3. 荧光染料在血管紧张素II输注的LysMCre小鼠中给药途径的评估+IRG+ 小鼠 滚动细胞的定量分析（A）以及黏附（BLysM+ 假手术或血管紧张素II输注动物的细胞，无论是否通过颈静脉导管或尾静脉注射吖啶橙。不同条件下的代表性图片（C）结果以均值 ± 均值的标准误表示。采用双因素方差分析（2-way ANOVA），并进行 Bonferroni 校正。 事后检验 检验，n = 3-12/组；*p &lt; 0.05. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56948/56948fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

本论文描述了在血管紧张素II诱导的高血压模型中，利用转基因报告小鼠和不同途径给予荧光染料，通过活体视频显微镜观察血管，评估免疫细胞的活化状态及其在血管内皮上滚动与黏附的能力。

可视化血管紧张素II输注小鼠中白细胞滚动与黏附：技术与注意事项

血管的落射荧光活体视频显微镜（IVM）是一种评估免疫细胞活化状态及其功能能力的成熟方法……

本项落射荧光活体视频显微镜（即 IVM）血管研究方案的总体目标，是在血管紧张素 II 诱导的小鼠高血压模型中，对受损动脉内白细胞的滚动与黏附过程进行可视化观察与定量分析。该方法有助于解答血管功能障碍及动脉性高血压病理学领域中的关键问题，例如白细胞特别是溶酶体阳性细胞与血管壁之间相互作用的机制，以及血管本身的功能变化。该技术的主要优势在于，能够实时观察循环血细胞与血管系统在活体状态下的相互作用。根据文本方案，在使用渗透压泵进行七天血管紧张素二治疗后，准备一只雄性小鼠进行手术。在眼睛上涂抹眼用软膏，以在手术过程中保护眼睛。将麻醉后的动物置于39°C手术板上，呈仰卧位，并插入直肠探针以维持体温。使用棉签将脱毛膏涂抹并揉搓于颈部，直至毛发开始脱落。随后，再等待2分钟，用刮刀清除毛发和脱毛膏。接着，使用酒精类皮肤消毒剂对皮肤进行消毒。接下来，在体视显微镜下，于气管旁1 cm处的颈部皮肤上做一个1至1.5 cm长的纵向切口。然后，在第一个切口的两端各做两个垂直切口。仔细去除皮肤下方的组织，并移除覆盖左侧颈静脉和气管的那部分皮肤。接下来，使用两把弯镊小心地从目标区域分离舌下腺和下颌下腺。在操作过程中注意避免切割或损伤腺体，将其适当移位以充分暴露颈静脉和周围结构，便于操作。随后，为分离颈静脉，将细镊子插入血管与其周围组织之间，缓慢开合器械，轻柔地将静脉从周围组织中游离出来。当颈静脉完全清理干净后，将镊子置于血管下方，并在其下方放置两根10 cm长的7-0缝线。打两个结，将靠近头部一侧的缝线结扎封闭；用第二根缝线打一个结，但暂不收紧。现在，用一只手握住充满37°C无菌生理盐水的导管，另一只手用剪刀或弯曲的26号针头在血管上做一个小切口。将导管插入颈静脉，并打结两次。然后，在靠近头部的一侧于导管上方缝合，以确保完全固定。为分离和准备腐蚀的动脉，使用细弯镊子解剖覆盖气管的区域。然后，当去除周围组织后，用精细镊子缓慢开合，必要时轻轻游离迷走神经，使其从血管上完整分离而不切断。当两条动脉均彻底清理干净后，将镊子置于第一条已去除组织的动脉下方，注意避免过度牵拉血管，将一个小型黑色塑料血管夹（3 mm × 2.5 cm）置于血管下方。血管夹放置到位后，确认血流存在。为避免牵拉血管，操作者的手应尽量保持稳定，仅用第一把镊子进行单次动作以分离腐蚀的动脉，同时借助第二把镊子在血管下方打孔。当血管夹正确放置后，将第二条动脉置于装置之上。如果小鼠未直接放置在显微镜下，应将腺体复位覆盖气管，并滴加37°C无菌生理盐水，以防该区域干燥。在1 mL注射器中，用无菌生理盐水将2 mg/mL的吖啶橙解冻储备液稀释1-4倍。避光保存注射器。进行测量时，将小鼠置于高速宽场荧光显微镜下，使用长工作距离聚光镜、10倍水浸物镜、单色器、分光镜和CCD相机。通过将物镜对准腐蚀动脉内皮表面的中部，实时采集图像。缓慢注入 50 mL 荧光素橙，然后设置软件以每张图片 120 毫秒的曝光时间连续采集 100 张图像。在每条腐蚀的动脉上选择不同位置，每条动脉记录四个视频。如果荧光信号减弱，再注射 50 mL 的吖啶橙。为测试不同条件，若未插入颈静脉导管，则直接将吖啶橙注入侧尾静脉，并进行相同的图像采集。作为对照，记录未注射的lysm-cre阳性、IRG阳性小鼠的荧光测量结果。对每个视频中以每秒10帧速度播放的图像，在血管中部放置一个200微米×250微米的矩形视野，定量分析其中滚动和黏附的细胞。计数滚动和黏附的细胞。黏附细胞定义为在10秒视频内未移动或未从内皮脱离的细胞。为简化定量分析，去除红色荧光通道，仅使用绿色荧光来计数滚动和黏附的细胞。在本研究中，通过体内显微镜观察了输注血管紧张素2的溶菌酶M-Cre阳性、IRG阳性小鼠的相应指标。如基线图像所示，颈静脉导管的存在导致了表达lys-M的荧光细胞黏附。经吖啶橙注射后，内皮细胞也呈现荧光。随后通过降低背景荧光以排除内皮细胞相关荧光信号的干扰，结果显示所有黏附的有核细胞均为lys-M阳性。在本实验中，给予血管紧张素2灌注一周后，通过颈静脉导管或尾静脉注射吖啶橙，或不注射吖啶橙，利用体内显微成像技术（IVM）对溶菌酶M（lys-M）Cre阳性、IRG阳性小鼠腐蚀性动脉中的白细胞-内皮相互作用进行成像和可视化观察。与未处理小鼠相比，无论是否置入导管或注射，灌注血管紧张素2后，lys-M阳性细胞的滚动显著增加，且黏附也有所增强。通过颈静脉导管注射吖啶橙可显著增加血管紧张素2处理小鼠的白细胞黏附和滚动，其程度高于未置入导管的小鼠。最后，如这些图示所示，在尾静脉注射吖啶橙后，白细胞的黏附和滚动程度与未注射吖啶橙的小鼠相似。一旦掌握该技术，若操作得当，可在三十分钟内完成。在进行该操作时，重要的是要注意不要损伤血管周围的组织。该技术建立后，将为心血管和止血领域的研究人员探索白细胞和血小板在体内对血管壁的黏附提供新的途径。观看本视频后，您应能够充分理解如何在活体显微成像（IVM）中限制染料注射和手术带来的影响。请注意，使用嵌入性荧光染料可能具有极高危险性，必须使用适当材料（如手套）避免染料与皮肤接触。

visualizing-leukocyte-rolling-adhesion-angiotensin-ii-infused-mice

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

血管紧张素 II. 型小鼠白细胞滚动和粘附的可视化技术及缺陷

本文介绍了一种无创的双光子（2P）显微成像方法，用于研究小鼠足垫中的白细胞归巢过程。我们讨论了组织成像制备过程中的技术细节，并指导读者完成从初始设置到实验实施及数据采集的典型实验流程。...

白细胞归巢与迁移的非侵入性成像 体内

这是一种用于观察白细胞在离体加压血管中与内皮细胞黏附的方法。该技术能够在不同管腔压力（最高达200...

在高管腔压力下成像白细胞与血管内皮的黏附

在本视频中，我们展示了经腹腔注射脂多糖的小鼠模型肠系膜静脉中血细胞与内皮细胞相互作用的实时可视化过程。...

利用活体显微镜分析炎症小鼠模型中血细胞与内皮细胞的相互作用

白细胞向肝脏的募集发生在由独特的肝窦内皮细胞衬覆的肝窦特殊通道中。在生理剪切应力条件下，通过相差显微镜观察白细胞跨越人肝窦内皮的过程，有助于阐明该过程背后的分子机制。...

一种在剪切应力条件下研究白细胞向人肝窦内皮黏附的流动黏附实验

白细胞通过细胞旁路或跨细胞途径穿过内皮单层。我们建立了一种简单的方法，用于在生理流动条件下追踪内源性连接蛋白VE-cadherin和PECAM-1在白细胞跨内皮迁移过程中的分布，以区分这两种迁移途径。...

生理流动条件下中性粒细胞跨内皮迁移过程中内皮细胞间连接的实时成像

此处，我们介绍一种可用于评估白细胞募集动态的实验方案 离体...

在流动条件下评估白细胞-内皮细胞相互作用 离体 自动灌流微流控腔室检测法

这种简化的小鼠肠系膜静脉活体显微成像方法可用于多种炎症模型，以观察白细胞-内皮细胞以及血小板-白细胞之间的相互作用。...

小鼠肠系膜静脉中白细胞-内皮及血小板-白细胞相互作用的活体显微成像

血管壁损伤或炎症期间，白细胞会积极地与血管细胞和血小板相互作用。本文介绍一种基于层流的简便检测方法，用于表征白细胞与其细胞伙伴之间相互作用的分子机制。...

基于层流的检测方法用于研究白细胞在培养的血管细胞和黏附血小板上的募集作用

本文展示了如何对小鼠提睾肌的毛细血管后微静脉进行活体显微观察。该技术常用于研究不同类型的炎症和脓毒症模型，尤其是由趋化因子和细胞因子诱导的模型，本文强调了其在研究伴有显著肌肉白细胞浸润的肌病中的重要性。...

通过活体显微镜评估小鼠 cremaster 肌肉中的白细胞浸润

本方案介绍了进行黏附足迹实验以成像快速细胞滚动黏附过程中黏附事件的实验步骤。...

成像细胞滚动过程中分子黏附的黏附足迹检测法

体内关节成像是一种有价值的技術，可用於揭示白細胞在發炎關節中的遷移行為以及分子動態。本文中，我們介紹了一種利用II型膠原誘導關節炎（CIA）小鼠模型進行體內關節成像的詳細實驗方案。...

体内成像揭示白细胞在关节内的迁移行为

了解活体荧光显微成像技术如何可视化血管紧张素II诱导高血压小鼠颈动脉中的白细胞滚动与粘附行为，为研究血管功能障碍和免疫炎症机制提供实时动态观察方法。

可视化血管紧张素II输注小鼠中白细胞滚动与黏附：技术与注意事项

探索更多视频