可视化血管紧张素II输注小鼠中白细胞滚动与黏附：技术与注意事项

本项落射荧光活体视频显微镜（即 IVM）血管研究方案的总体目标，是在血管紧张素 II 诱导的小鼠高血压模型中，对受损动脉内白细胞的滚动与黏附过程进行可视化观察与定量分析。该方法有助于解答血管功能障碍及动脉性高血压病理学领域中的关键问题，例如白细胞特别是溶酶体阳性细胞与血管壁之间相互作用的机制，以及血管本身的功能变化。该技术的主要优势在于，能够实时观察循环血细胞与血管系统在活体状态下的相互作用。

根据文本方案，在使用渗透压泵进行七天血管紧张素二治疗后，准备一只雄性小鼠进行手术。在眼睛上涂抹眼用软膏，以在手术过程中保护眼睛。将麻醉后的动物置于39°C手术板上，呈仰卧位，并插入直肠探针以维持体温。

使用棉签将脱毛膏涂抹并揉搓于颈部，直至毛发开始脱落。随后，再等待2分钟，用刮刀清除毛发和脱毛膏。接着，使用酒精类皮肤消毒剂对皮肤进行消毒。

接下来，在体视显微镜下，于气管旁1 cm处的颈部皮肤上做一个1至1.5 cm长的纵向切口。然后，在第一个切口的两端各做两个垂直切口。仔细去除皮肤下方的组织，并移除覆盖左侧颈静脉和气管的那部分皮肤。

接下来，使用两把弯镊小心地从目标区域分离舌下腺和下颌下腺。在操作过程中注意避免切割或损伤腺体，将其适当移位以充分暴露颈静脉和周围结构，便于操作。随后，为分离颈静脉，将细镊子插入血管与其周围组织之间，缓慢开合器械，轻柔地将静脉从周围组织中游离出来。

当颈静脉完全清理干净后，将镊子置于血管下方，并在其下方放置两根10 cm长的7-0缝线。打两个结，将靠近头部一侧的缝线结扎封闭；用第二根缝线打一个结，但暂不收紧。现在，用一只手握住充满37°C无菌生理盐水的导管，另一只手用剪刀或弯曲的26号针头在血管上做一个小切口。

将导管插入颈静脉，并打结两次。然后，在靠近头部的一侧于导管上方缝合，以确保完全固定。为分离和准备腐蚀的动脉，使用细弯镊子解剖覆盖气管的区域。

然后，当去除周围组织后，用精细镊子缓慢开合，必要时轻轻游离迷走神经，使其从血管上完整分离而不切断。当两条动脉均彻底清理干净后，将镊子置于第一条已去除组织的动脉下方，注意避免过度牵拉血管，将一个小型黑色塑料血管夹（3 mm × 2.5 cm）置于血管下方。血管夹放置到位后，确认血流存在。

为避免牵拉血管，操作者的手应尽量保持稳定，仅用第一把镊子进行单次动作以分离腐蚀的动脉，同时借助第二把镊子在血管下方打孔。当血管夹正确放置后，将第二条动脉置于装置之上。如果小鼠未直接放置在显微镜下，应将腺体复位覆盖气管，并滴加37°C无菌生理盐水，以防该区域干燥。

在1 mL注射器中，用无菌生理盐水将2 mg/mL的吖啶橙解冻储备液稀释1-4倍。避光保存注射器。进行测量时，将小鼠置于高速宽场荧光显微镜下，使用长工作距离聚光镜、10倍水浸物镜、单色器、分光镜和CCD相机。

通过将物镜对准腐蚀动脉内皮表面的中部，实时采集图像。缓慢注入 50 mL 荧光素橙，然后设置软件以每张图片 120 毫秒的曝光时间连续采集 100 张图像。

在每条腐蚀的动脉上选择不同位置，每条动脉记录四个视频。如果荧光信号减弱，再注射 50 mL 的吖啶橙。为测试不同条件，若未插入颈静脉导管，则直接将吖啶橙注入侧尾静脉，并进行相同的图像采集。

作为对照，记录未注射的lysm-cre阳性、IRG阳性小鼠的荧光测量结果。对每个视频中以每秒10帧速度播放的图像，在血管中部放置一个200微米×250微米的矩形视野，定量分析其中滚动和黏附的细胞。计数滚动和黏附的细胞。

黏附细胞定义为在10秒视频内未移动或未从内皮脱离的细胞。为简化定量分析，去除红色荧光通道，仅使用绿色荧光来计数滚动和黏附的细胞。在本研究中，通过体内显微镜观察了输注血管紧张素2的溶菌酶M-Cre阳性、IRG阳性小鼠的相应指标。

如基线图像所示，颈静脉导管的存在导致了表达lys-M的荧光细胞黏附。经吖啶橙注射后，内皮细胞也呈现荧光。随后通过降低背景荧光以排除内皮细胞相关荧光信号的干扰，结果显示所有黏附的有核细胞均为lys-M阳性。

在本实验中，给予血管紧张素2灌注一周后，通过颈静脉导管或尾静脉注射吖啶橙，或不注射吖啶橙，利用体内显微成像技术（IVM）对溶菌酶M（lys-M）Cre阳性、IRG阳性小鼠腐蚀性动脉中的白细胞-内皮相互作用进行成像和可视化观察。与未处理小鼠相比，无论是否置入导管或注射，灌注血管紧张素2后，lys-M阳性细胞的滚动显著增加，且黏附也有所增强。

通过颈静脉导管注射吖啶橙可显著增加血管紧张素2处理小鼠的白细胞黏附和滚动，其程度高于未置入导管的小鼠。最后，如这些图示所示，在尾静脉注射吖啶橙后，白细胞的黏附和滚动程度与未注射吖啶橙的小鼠相似。一旦掌握该技术，若操作得当，可在三十分钟内完成。

在进行该操作时，重要的是要注意不要损伤血管周围的组织。该技术建立后，将为心血管和止血领域的研究人员探索白细胞和血小板在体内对血管壁的黏附提供新的途径。观看本视频后，您应能够充分理解如何在活体显微成像（IVM）中限制染料注射和手术带来的影响。

请注意，使用嵌入性荧光染料可能具有极高危险性，必须使用适当材料（如手套）避免染料与皮肤接触。