中性粒细胞衍生微粒的分离与鉴定功能研究

该方案的总体目标是分离和表征中性粒细胞衍生的微粒以进行功能研究。这种方法可以帮助回答有关外细胞囊泡或微粒在不同生理过程（包括癌症、炎症和伤口愈合）中细胞间通讯中的作用的关键问题。该技术的主要优点是相对快速、成本效益高，并且允许对功能资产中微粒或微泡的 p'henotypeic 组成进行估值。

演示该程序的是我实验室的博士后研究员 Ariel Finkielsztein 和我实验室的本科生 Joseph Lee。对于小鼠骨髓多形單或 PMN 细胞的密度梯度分离，首先将 3 毫升新鲜制备的室温 1.077 克/毫升溶液缓慢分层，放在 3 毫升新鲜制备的室温 1.119 克/毫升密度溶液上，每个骨髓细胞样品的一根 15 毫升锥形管中。接下来，将冰冷的 PBS 中的一毫升新鲜分离的骨髓细胞叠加到每个试管的顶部密度梯度层上，并通过密度梯度离心分离细胞。

在分离结束时，小心地去除 PBS 与每个试管中上层密度梯度层之间界面处的单核细胞层，而不会干扰 PMN 波段。使用移液管，将 PMN 层收集到每个样品的一根 15 毫升新管中，并使用 0.1 微米倾倒大小的过滤 PBS 使每管中的最终体积达到 15 毫升。通过离心沉淀 PMN，然后在每管 2 毫升新鲜过滤的 PBS 中进行第二次离心。

然后将沉淀重悬于一毫升新鲜过滤的 PBS 中进行计数。计数后，再次离心细胞，并将沉淀重悬于 100 微升 0.1 微米倾倒大小的过滤 HBSS 中，每 1000 万个细胞补充有感兴趣的兴奋剂。在 20 摄氏度下孵育 30 至 37 分钟。

刺激结束时，通过离心收集细胞，并将无细胞上清液转移到每个样品的一个新的 1.5 毫米微量离心管中。离心上清液以除去任何细胞碎片，并将澄清的上清液转移到新的超速离心管中，然后超速离心上清液，并将沉淀的微粒储存在 80 摄氏度的石蜡密封超速离心管中，直到进一步的实验分析。要将微粒注入小鼠结肠，首先将完全麻醉的小鼠置于俯卧位，然后使用活检钳和配备高分辨率摄像头的内窥镜沿结肠背侧产生 3 到 5 个浅表伤口。

将鼠标放回笼子并监测直至完全恢复。24 小时后，使用内窥镜获取麻醉下受伤伤口的图像。然后使用基于结肠镜检查的显微注射系统将重悬于 100 微升 HBSS 中的实验体积的 PMN 微粒直接施入每个伤口部位。

可以通过将微粒与已知大小的流式细胞术微珠进行比较来评估 PMN 微粒的大小异质性。如所示，微粒对目标蛋白质的表达也可以通过流式细胞术进行检查。在本实验中，通过免疫印迹评估激活剂刺激的 PMN 衍生微粒对关键炎症和抗炎分子的表达。

PMN 微粒对上皮细胞愈合的影响可以通过在体外预定时间点以及活检钳损伤后体内损伤后的图像采集来监测。一旦掌握，如果技术执行得当，可以在 4 小时内分离出 PMN 衍生的微粒。在尝试此程序时，重要的是要记住，在刺激之前，应将 PMN 保持在冰上，以防止过早激活和微粒丢失。

在此程序之后，流式细胞术、免疫印迹和实时增殖反应技术可用于确定微粒含量，在各种刺激条件下，或来自不同来源细胞的微粒含量。该技术可用于检查微粒贡献在免疫反应调节、屏障功能、组织损伤和修复以及癌症进展中的作用。观看此视频后，您应该对如何分离和标记小鼠微粒以及在体内功能性伤口愈合资产中使用微粒有很好的了解。

不要忘记，与活体动物一起工作可能很危险，预防措施建议在执行此程序之前，应始终穿戴个人防护设备并完成适当的安全培训。