Name: 中性粒细胞衍生微粒的分离与鉴定功能研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: 学习利用超速离心、流式细胞术和免疫印迹技术分离和鉴定中性粒细胞衍生微粒的方法。该技术快速且经济高效，可用于研究微粒在癌症、炎症和伤口愈合等生理过程中的细胞间通讯作用。

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我们感谢斯瓦米纳坦博士（Dr. Suchitra Swaminathan）提供的技术协助，她负责西北大学范伯格医学院流式细胞术核心实验室。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）DK101675 项目提供资助。

所有动物实验均经西北大学动物护理和使用委员会（IACUC）批准。所有实验均按照并遵守所有相关的监管和机构指南进行。对于捐献血液的人类受试者，均提供了知情同意书并签署；此外，本研究中所有人类受试者均按照机构和联邦关于人类福利的指南进行处理。
注意：实验方案步骤列于以下小节中：(i) 小鼠骨髓细胞的分离；(ii) 从小鼠骨髓中分离中性粒细胞；(iii) 从人血液中分离中性粒细胞；(iv) 通过超速离心法从中性粒细胞上清液中分离微颗粒；(v) 通过蛋白质印迹法对微颗粒进行表征；(vi) 通过流式细胞术对微颗粒进行表征；(viii) 应用分离的微颗粒研究伤口愈合
1. 小鼠骨髓细胞的分离
<ol style="margin-left: 40px;">
	<li>小鼠后肢股骨和胫骨的解剖
	<ol>
		<li>准备一个用于吸入麻醉的安乐死箱（例如，一个空的1 mL枪头盒）。将几滴100%异氟烷滴加到固定在塑料盒盖内侧的无菌布上。根据最新的IACUC指南，动物不应直接接触异氟烷，因此应在小鼠与含有异氟烷的纱布之间放置一个枪头架。 
		注意：异氟烷是一种强效吸入性麻醉剂，必须在通风橱内极其谨慎地操作。</li>
		<li>按照IACUC建议对小鼠实施安乐死。将一只小鼠放入步骤1.1.1所述的安乐死箱中，持续1–5分钟，直至呼吸停止。通过颈椎脱位法确认动物死亡。</li>
		<li>使用不锈钢、12 cm长、弯曲、0.17 mm × 0.1 mm规格的镊子提起腹部皮肤，并在上下肢之间的中点处剪开皮肤。从该处开始剥离皮肤，直至小鼠身体最远端部分，包括下肢。使用10 cm长的直解剖剪去除后肢肌肉，并脱位髋关节，保留股骨头完整。</li>
		<li>用剪刀去除股骨和胫骨上的肌肉组织，并将股骨与胫骨分离。确保骨的两端保持完整，因其含有大量骨髓。</li>
		<li>通过在纸巾内滚动骨骼以去除所有残留的软组织。将清洁后的骨骼置于含有无血清培养基（SFM，即不含血清或抗生素的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM））的培养皿中。</li>
		<li>用70%乙醇冲洗骨骼，随后用SFM冲洗。</li>
		<li>在50 mL锥形管中准备50 mL SFM。将10 mL SFM吸入10 mL注射器中，并连接至25号5/8英寸针头。</li>
		<li>用剪刀修剪骨的末端，直至可见骨髓腔开口（呈红色）。</li>
		<li>用装有约3 mL/骨SFM的10 mL注射器连接26号5/8英寸针头，将骨髓细胞冲洗至新的50 mL管中。冲洗完成后，通过移液（使用一次性1 mL塑料吸头）重悬管中细胞，以打散细胞团块。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 小鼠骨髓中PMN的分离
<ol>
	<li>红细胞裂解
	<ol>
		<li>通过在 350 x g 条件下离心收集的骨髓以获得沉淀 g 4 °C下离心8分钟。</li>
		<li>将细胞沉淀重悬于20 mL 0.2% NaCl溶液中，孵育约20–30秒以裂解红细胞组分。孵育时间不得超过30秒，否则将导致中性粒细胞裂解。加入20 mL 1.6% NaCl溶液以恢复渗透压。 
		注意：此步骤可能导致中性粒细胞激活程度极低。</li>
		<li>用2 mL PBS洗涤细胞，然后参照上述步骤2.1.1进行离心。弃去上清液。</li>
		<li>通过密度梯度离心法分离中性粒细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过密度梯度离心法分离中性粒细胞
	<ol>
		<li>预热密度为1.119 g/mL和1.077 g/mL的多蔗糖-泛影酸钠溶液（见 材料表），使用前置于室温（RT）。</li>
		<li>在骨髓细胞处理前，立即新鲜配制多蔗糖和泛影酸钠梯度：于15 mL圆锥形离心管中，将3 mL密度为1.077 g/mL的溶液缓慢铺加在3 mL密度为1.119 g/mL的溶液上方。 
		注意：梯度溶液若过早配制，会导致各层混合，从而降低中性粒细胞的纯度和回收率。</li>
		<li>将骨髓细胞沉淀重悬于1 mL预冷的PBS中，并将所得细胞悬液缓慢铺加在聚蔗糖和泛影酸钠梯度液上方（操作需缓慢，避免各层混合）。</li>
		<li>在25 °C（室温）下，以850 × g离心30分钟， 无刹车装置将试剂置于室温下，以有效分离骨髓中其他细胞中的中性粒细胞。离心时设置低速减速，以确保离心后密度梯度能够有效形成并保持稳定。</li>
		<li>在PBS与1.077 g/mL密度溶液（上层）的界面处肉眼观察单个核细胞层。移除该层及剩余的密度溶液，注意不要扰动下方的多形核粒细胞（PMN）层。</li>
		<li>使用移液管将整个中性粒细胞层及部分下方的多糖溶液和1.119 g/mL的碘海醇钠溶液收集至15 mL离心管中。 
		注意：分离得到的中性粒细胞纯度取决于上层液体是否完全去除。</li>
		<li>用经0.1 µm孔径滤膜过滤的PBS补至管中，于4 °C、300 x g离心5分钟。</li>
		<li>用2 mL PBS重悬沉淀的PMNs，离心条件同步骤2.2.7。</li>
		<li>用1 mL过滤的PBS重悬，并用血细胞计数板对分离的中性粒细胞进行计数。 
		注意：通过流式细胞术评估，该分离方法获得的中性粒细胞纯度约为 85–90%。残留的污染组分主要为单核淋巴细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>诱导中性粒细胞释放微泡的刺激 
	注意：可通过多种激活条件刺激中性粒细胞释放微囊泡（MPs），包括N-甲酰-L-甲硫氨酰-L-亮氨酰-L-苯丙氨酸（fMLF）、佛波醇-12-十四烷酸-13-乙酸酯（PMA）或γ-干扰素（IFNγ）。重要的是，在刺激前，中性粒细胞应始终置于冰上保存。
	<ol>
		<li>离心收集中性粒细胞（300 × g，5 分钟，4 °C），并重悬于含有选定刺激剂的 0.1 µm 滤膜过滤的 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）中。为获得最佳刺激效果，在 15 mL 离心管中，每 1000 万个中性粒细胞使用 100 µL 刺激溶液，于 37 °C 孵育 20–30 分钟。 
		注意：我们在之前的研究中成功使用了以下浓度的激活剂：fMLF（人中性粒细胞为0.5–1 µM，小鼠PMNs为2–5 µM）、PMA（200 nM）和IFNγ（100 ng/mL）。若需检测预标记微囊泡（MPs）的释放，可将未刺激的PMNs（1–5 × 10⁶）与相应试剂共同孵育。6) 与N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺-FITC（见 材料表)（1 µM，100 µL HBSS，37 °C孵育15分钟）。继续进行步骤2.3.1–2.3.3。</li>
		<li>在 4 °C 条件下以 850 x g 离心 5 分钟，去除中性粒细胞，将无细胞上清液转移至新的 1.5 mL 微量离心管中。</li>
		<li>对于从无细胞上清液中分离MP，请继续进行步骤4.2。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 从人血液中分离中性粒细胞
<ol>
	<li>根据机构IRB指南招募健康志愿者进行采血。
	<ol>
		<li>使用市售的含5 mL柠檬酸钠的采血管（见材料表），从健康志愿者的前臂采集血液。</li>
		<li>将5 mL葡聚糖和泛影酸钠溶液（密度为1.113 g/mL，见材料表）用移液器加入无菌15 mL离心管中，然后缓慢地将5 mL新鲜分离的人外周血叠加在其上方。</li>
		<li>在室温（25 °C）下以400 × g离心50分钟，加速度设为低档，不使用刹车。</li>
		<li>离心结束后，使用无菌塑料吸管移除上层的血浆和单个核细胞。</li>
		<li>将下层（中性粒细胞，PMNs）转移至新的无菌50 mL锥形离心管中。</li>
		<li>向中性粒细胞中加入等体积的0.45% NaCl溶液（通过轻轻旋转离心管充分且轻柔地混匀）。</li>
		<li>在25 °C下以400 × g离心10分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>红细胞裂解
	<ol>
		<li>向沉淀的细胞中加入10 mL冰浴的无菌水，作用45秒后，再加入10 mL冰浴的无菌1.8% NaCl溶液以恢复渗透压。 
		注：后续所有中性粒细胞分离步骤均应在冰上操作，以避免中性粒细胞活化及微囊泡的过早释放。尽管裂解步骤本身会引起轻微但无显著意义的中性粒细胞活化，但该步骤对于获得纯度较高的中性粒细胞群体以进行功能检测至关重要。</li>
		<li>在4 °C下以250 × g离心10分钟，减速设为柔和模式。</li>
		<li>重复步骤3.2.1和3.2.2。</li>
		<li>将中性粒细胞重悬于5 mL冰浴的无钙镁HBSS缓冲液中。在刺激前计数总活细胞数（使用血细胞计数板，并以1:2比例进行活率染色，见材料表）。 
		注：分离得到的中性粒细胞应在分离后2小时内用于刺激或其他实验，以避免细胞功能改变、细胞状态变化或细胞死亡。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 从活化的中性粒细胞上清液中分离微颗粒
注意：从小鼠和人中性粒细胞分离微囊泡（MPs）可采用类似的方案。
<ol>
	<li>将中性粒细胞（PMNs）以300 × g离心5分钟，4 °C，收集沉淀，并重悬于含有选定刺激剂（例如1 µM fMLF，参见注释2.3.1）的0.1 µm滤膜过滤的HBSS溶液中。为达到最佳刺激效果，每1000万个PMNs使用100 µL刺激溶液，在37 °C下于15 mL离心管中孵育20–30分钟。</li>
	<li>刺激完成后，在4 °C下以600 × g离心5分钟，沉淀活化的PMNs，并将无细胞上清液转移至新的1.5 mL微量离心管中。</li>
	<li>将去除PMNs的上清液在4 °C下以13,000 × g离心10分钟，以去除细胞碎片，随后将澄清的上清液转移至新的超速离心管中。</li>
	<li>在4 °C下以100,000 × g离心1小时。在微囊泡（MP）储存前弃去上清液。根据需要，将沉淀的微囊泡（MPs）置于石蜡密封的超速离心管中，于-80 °C保存，直至实验使用。</li>
</ol>
5. 通过蛋白质印迹法检测中性粒细胞微颗粒
<ol>
	<li>向MPs沉淀物（来自步骤4.4）中加入1% SDS缓冲液（50–200 µL，含100 mM Tris，pH 7.4），转移至新的1.5 mL微量离心管中，并将裂解后的MPs煮沸5分钟。 
	注意：MPs的数量和裂解缓冲液体积需根据目标蛋白进行调整和优化。</li>
	<li>在含有10% β-巯基乙醇的上样缓冲液中，每泳道加入等量的PMN-MPs。 
	&#8203;注意：采用本方法时，我们上样的MPs均来自相同数量刺激后的PMNs。
	<ol>
		<li>使用10%聚丙烯酰胺凝胶通过SDS-PAGE分离裂解液（以50–100 V电泳1–1.5小时），并按照文献9所述方法将总蛋白转移至硝酸纤维素膜上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用含5%脱脂奶粉的0.05% Tween-20 Tris缓冲盐水封闭膜1小时，随后加入适当的一抗（4 °C孵育过夜），再加入HRP标记的二抗进行孵育。</li>
	<li>将化学发光溶液加入膜上，于避光暗盒中曝光X光片1–24小时以显影条带。</li>
</ol>
6. 通过流式细胞术检测中性粒细胞微颗粒
<ol>
	<li>进行抗体染色时，用FACS缓冲液（含0.1 mM EDTA、0.1%叠氮化钠的PBS）将抗体适当稀释。将沉淀的PMN-MPs（来源于每种条件下1–3 × 106个中性粒细胞）重悬于100 µL抗体溶液中。
	<ol>
		<li>若进行Annexin V染色，将沉淀的PMN-MPs重悬于含5 µL FITC标记Annexin V的Annexin V缓冲液中。若需同时进行抗体共染色，可将所需抗体（示例见材料表）直接加入Annexin V溶液中。在100 µL FACS缓冲液中加入终浓度为1 µM的荧光脂质染料N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺（见材料表），用于标记并识别微囊泡（MPs）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将微囊泡（MPs）在染色液中4 °C避光孵育至少20分钟。</li>
	<li>通过超速离心（4 °C，100,000 × g，离心1小时）洗涤微囊泡（MPs），弃去上清液。</li>
	<li>用FACS缓冲液重悬，然后在配备高灵敏度电子升级模块的专用流式细胞仪上检测样品（见材料表）。</li>
</ol>
7. 分离的中性粒细胞微颗粒在研究中性粒细胞功能及伤口愈合中的应用
<ol>
	<li>体内向结肠伤口施用中性粒细胞微颗粒（PMN-MPs）
	<ol>
		<li>通过腹腔注射氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（5 mg/kg）的混合物对小鼠进行麻醉。通过足底反射（用力捏脚趾）确认麻醉效果，并根据需要进行调整。</li>
		<li>将小鼠俯卧放置，使用28 cm活检钳和配备高分辨率相机的内窥镜（例如用于小型动物的兽用内窥镜，参见材料表），在结肠背侧制造3–5个浅表性伤口。完成造伤后，将小鼠放回置于温度控制（37 °C）垫上的笼子中，直至恢复。</li>
		<li>按照步骤7.1.1的方法对小鼠进行麻醉。使用内窥镜在造伤后24小时（第1天）获取伤口图像。随后按照步骤7.1.2让小鼠恢复。</li>
		<li>在同一时间点（造伤后24小时），使用基于结肠镜的微注射系统（采用29 G针头），将来源于2 × 106个中性粒细胞的100 µL HBSS+中的小鼠PMN-MPs直接注射至每个伤口部位9。三天后（造伤后第4天），按照步骤7.1.1对小鼠进行麻醉，并使用内窥镜重新获取愈合伤口的图像。随后按照步骤7.1.2让小鼠恢复。</li>
		<li>使用首选的图像分析软件（参见材料表），在获取的图像中标记可见的伤口区域，测量造伤后第1天和第4天同一伤口的面积，并计算伤口闭合百分比。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>人上皮细胞的体外伤口愈合实验
	<ol>
		<li>使用血细胞计数板对Caco-2 BBe或T84人肠上皮细胞进行计数，并以每孔5 × 105个细胞的密度接种于24孔培养板中。将细胞置于标准培养箱中，在37 °C、5% CO2条件下孵育。Caco-2 BBe或T84细胞通常在48小时内达到汇合状态9。培养上皮细胞时，使用含补充剂的DMEM与DMEM-F12（50:50）培养基，具体配制方法如前所述9。</li>
		<li>使用移液器枪头并施加低吸力，在单层细胞上制造机械划痕伤口，方法如前所述4,9。划痕后立即使用倒置相差微分干涉显微镜（使用5X或10X物镜）获取伤口区域图像，作为时间零点（t = 0）的参考图像。</li>
		<li>将来源于2–4 × 106个中性粒细胞的MPs加入已划伤的上皮细胞单层中，在37 °C、5% CO2条件下继续孵育24小时（即造伤后48小时）。此时重新获取划痕伤口的图像。</li>
		<li>使用首选的图像分析软件（参见材料表），测量t = 0和t = 48 h时的伤口面积。通过比较选定时间点的伤口面积差异，计算伤口闭合百分比。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者与本通讯内容无任何相关利益冲突

本文介绍了中性粒细胞来源微囊泡（MP）的分离与表征方法。为确保实验成功，需注意以下几个关键点：首先，中性粒细胞（PMNs）必须新鲜分离，并在分离后2小时内用于实验，以防止其自发激活和脱颗粒。在整个分离过程以及刺激前的所有操作步骤中，均需在冰上进行，以避免细胞激活和过早释放微囊泡12。其次，采用超速离心1小时或更长时间，可最大程度地沉淀微囊泡。第三，在进行流式细胞术分析时，仪器必须使用仪器指定的荧光微球混合物进行正确校准（微球类型需根据具体仪器调整），以准确界定微囊泡的大小。例如，某些流式细胞仪制造商推荐使用前向角散射（FSC）微球作为与尺寸相关的参数，而其他仪器则针对侧向散射（SSC）微球进行了优化。此外，用于微囊泡分析的流式细胞仪必须配备升级的电子系统，以便更有效地将微囊泡信号与背景噪声区分开来。
除了尺寸参数外，为正确鉴定微颗粒（MPs），强烈推荐使用上述步骤中所述的荧光染色方法。此外，在制备和分离过程中，所有溶液均应通过0.1 µm滤膜系统过滤，以最大限度减少尘埃颗粒或其他沉淀物的混入，从而降低流式细胞术检测时的背景噪声。重要的...

最近，源自细胞质或质膜的&#34;微粒/微囊泡&#34;引起了广泛关注，因为越来越多的研究表明，这些直径在50–1,000 nm之间的结构能够携带生物信息，并作为细胞间通讯的一种非经典途径。来源于免疫细胞、尤其是多形核中性粒细胞（PMN）的微粒备受关注，这是因为PMN在宿主防御1,2、炎症反应3以及伤口愈合4中发挥着重要作用。有趣的是，迄今为止已有大量研究报告显示PMN微粒具有促炎和抗炎双重功能5，提示微粒的作用可能具有微环境、疾病类型、物种及器官特异性。
本文所述的实验方案为研究微囊泡（MPs）在健康与疾病中的功能提供了一种经济高效、创新且可灵活调整的方法。该方法适用于多种模式生物、器官及刺激条件，能够鉴定多种类型的微囊泡，并可用于未来进一步探究其促炎与抗炎功能。本文以中性粒细胞来源的微囊泡（PMN-MPs）在上皮伤口愈合中的功能研究为例，介绍了其体外（in vitro）和体内（in vivo）的研究方法。所展示的小鼠骨髓来源中性粒细胞（PMNs）的分离方案，是在先前报道的方法6基础上经若干修改后建立的。
此外，本研究中描述的实验方案允许通过两种互补的方法——蛋白质印迹法和流式细胞术，对中性粒细胞微颗粒（PMN-MPs）表面存在的特定标志物进行检测和表征。我们发现，采用标准实验流程5对微颗粒进行免疫印迹分析操作简便且结果可靠；然而，随着流式细胞仪检测灵敏度的不断提升以及信噪比的显著改善，目前该方法也可用于对微颗粒进行更深入的分析。本研究所述的实验方案整合了近期原始研究论文中的技术进展和建议，包括对离心速度和时间的优化、样品过滤步骤的引入、冻存与储存条件的改进7,8，以及如何降低&#34;背景噪声&#34;、提高PMN-MPs的检测灵敏度，并区分不同大小的微颗粒。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-041-CV</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（热灭活）</td><td>Atlanta Biologics</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素（10,000 单位青霉素 / 10,000 mg/ml 链霉素）</td><td>GIBCO</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>Fisher</td><td>BP2482</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td>无菌并经 0.1 微米滤器过滤</td></tr><tr><td>无菌过滤的 Histopaque 1077</td><td>Sigma</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>无菌过滤的 Histopaque 1119</td><td>Sigma</td><td>11191</td><td>密度为 1.119 g/ml。&amp;nbsp; 多蔗糖与&amp;nbsp;泛影酸钠溶液。使用前恢复至室温</td></tr><tr><td>不含钙和镁的磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Cellgro</td><td>210-40-CV</td><td></td></tr><tr><td>乙醇（200 证明）</td><td>Decon labs</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>HBBS</td><td>Corning</td><td>21-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝溶液，0.4%</td><td>Sigma</td><td>T8154&amp;nbsp;SIGMA</td><td>按 1:2 稀释用于细胞活力计数</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Abbot</td><td>50033</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD11b-APC 偶联抗体</td><td>Biolegend</td><td>301350</td><td>克隆号 ICRD44（终浓度：1 &amp;micro;g/mL）</td></tr><tr><td>BODIPY FL</td><td>Invitrogen</td><td>B10250</td><td>N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Annexin V 结合缓冲液</td><td>Biolegend</td><td>422201</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞术校准微球</td><td>BioCytex</td><td>7803</td><td></td></tr><tr><td>FITC Annexin V</td><td>Biolegend</td><td>640906</td><td></td></tr><tr><td>Polymorphprep</td><td>Axis-Shield PoC AS</td><td></td><td>泛影酸钠/葡聚糖 500，密度 1.113 g/ml</td></tr><tr><td>C57BL/6 小鼠</td><td>Jackson Labs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml 离心管</td><td>Corning</td><td>430053</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 离心管</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>25 ml 移液管</td><td>Celltreat</td><td>229225B</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 移液管</td><td>Celltreat</td><td>229210B</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 移液管</td><td>Celltreat</td><td>229205B</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德吸管&amp;nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>357575</td><td></td></tr><tr><td>25 G × 5/8 英寸针头（精密滑动针头）</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;micro;m 细胞筛</td><td>Celltreat</td><td>229485</td><td></td></tr><tr><td>真空采血管</td><td>BD</td><td>367251</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSR Fortessa 特殊订单研究产品（SORP）</td><td>BD</td><td>(SORP)</td><td></td></tr><tr><td>水平转子离心机</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75007210</td><td></td></tr><tr><td>超速离心机</td><td>Beckman</td><td>(L8-80 M)</td><td></td></tr><tr><td>微量离心机</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>&amp;nbsp;VV-17703-15 (Fresco 17)</td><td></td></tr><tr><td>水平转子离心机</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>&amp;nbsp;75004503 (Megafuge 40R)</td><td></td></tr><tr><td>活检钳，28 cm</td><td>Storz</td><td>27071zj</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image J</td><td>美国国立卫生研究院</td><td>开源&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

中性粒细胞来源微颗粒的功能研究分离与表征

Isolation and Characterization of Neutrophil-derived Microparticles for Functional Studies

多形核中性粒细胞来源的微颗粒（PMN-MPs）是由脂质双分子层构成的球形微囊泡，直径大小在50–1,000 nm之间。微颗粒（MPs）是细胞间通讯和信号传导机制中一个新近被认识且重要的组成部分。由于其体积微小以及释放方式的特殊性，MPs的存在直到最近才被关注。然而，随着技术进步和分析方法的改进，MPs在健康和疾病中的功能正逐渐被揭示。本文所述的实验方案旨在通过流式细胞术和免疫印迹法对PMN-MPs进行分离和表征，并提供了多个具体应用示例。这些MPs分离方案具有快速、低成本的优点，无需使用昂贵的试剂盒。此外，这些方法允许在分离后对MPs进行标记，也可在MPs释放前使用膜特异性荧光染料对来源细胞进行预标记，以便通过流式细胞术进行可视化和分析。然而，这些方法也存在若干局限性，包括中性粒细胞（PMNs）和微颗粒（MPs）的纯度问题，以及对复杂分析仪器的需求。为可靠地分析MPs并最大限度减少因背景噪声或自发荧光导致的假阳性结果，需要使用高性能的流式细胞仪。所描述的方案可用于分离并定义MPs的生成过程，表征其标志物以及在不同刺激条件下组成成分的变化。可利用其大小的异质性来探究膜源性微颗粒与外泌体的内容物是否存在差异，以及它们在组织稳态中是否发挥不同的作用。最后，在完成MPs的分离与表征后，可进一步研究其在细胞应答及多种疾病模型（包括与中性粒细胞相关的炎症性疾病，如炎症性肠病或急性肺损伤）中的功能。

代表性流式细胞术分析显示，从人和小鼠中性粒细胞分离出的微颗粒（MPs） 图1通过与已知尺寸的微球进行比较，可评估PMN-MPs的大小异质性，如图所示。 图1A，B 用于人源MPs。注意，小鼠与人源MPs在大小异质性方面未观察到显著差异。同样，通过流式细胞术结合荧光标记，可检测分离自小鼠或人源MPs中目标蛋白的表达水平。例如，可通过Annexin V染色检测磷脂酰丝氨酸（PhS）的表达。图中显示的是小鼠骨髓PMN-MPs 图1C，D. 还可检测多种所选标志物的表达，例如人单核细胞（MPs）的Annexin V和CD11b染色结果所示， 图2A，B另一种通过流式细胞术检测中性粒细胞微颗粒（PMN-MPs）的方法是在刺激前对 freshly-...

本文描述了分离和表征来源于人和小鼠中性粒细胞的微颗粒的新方案。这些方案利用超速离心、流式细胞术和免疫印迹技术来分析微颗粒的内容物，可用于研究来源于不同细胞类型的微颗粒在细胞功能中的作用。

多形核中性粒细胞来源的微颗粒（PMN-MPs）是具有脂质双分子层结构的球形微囊泡，大小范围为50–1,000 nm。

本实验方案的总体目标是分离和表征中性粒细胞来源的微颗粒，用于功能研究。该方法有助于解答关于细胞外囊泡（即微颗粒）在癌症、炎症和伤口愈合等不同生理过程中介导细胞间通讯作用的关键问题。该技术的主要优势在于操作相对快速、成本较低，并且能够评估微颗粒（或微囊泡）在功能特性方面的表型组成。演示该实验操作的是我实验室的博士后研究员 Ariel Finkielsztein 和我实验室的本科生 Joseph Lee。对于小鼠骨髓多形核（PMN）细胞的密度梯度分离，首先在每管骨髓细胞样品中，将 3 毫升新配制的、室温的、密度为 1.077 克/毫升的溶液缓慢地铺在另一新配制的、室温的、3 毫升密度为 1.119 克/毫升的溶液上方，使用 15 毫升的锥形离心管。接着，将 1 毫升新分离的骨髓细胞悬浮于冰上预冷的 PBS 中，轻轻覆盖在每根离心管的密度梯度顶层上，然后通过密度梯度离心法分离细胞。分离结束后，小心吸取各离心管中 PBS 与上层密度梯度液界面处的单个核细胞层，注意不要扰动中性粒细胞（PMN）条带。使用移液管将 PMN 层收集至每个样品对应的一个新的 15 毫升离心管中，并用孔径 0.1 微米滤膜过滤的 PBS 将每管终体积补至 15 毫升。通过离心沉淀 PMN，随后每管加入 2 毫升新鲜过滤的 PBS 进行第二次离心。然后将沉淀重悬于1毫升新鲜过滤的PBS中进行计数。计数后，再次离心细胞，并将沉淀重悬于100微升0.1微米滤膜过滤的HBSS中，每1000万个细胞加入相应刺激物。在37摄氏度孵育20至30分钟。刺激结束后，通过离心收集细胞，并将每份样品的无细胞上清液转移至一个新的1.5毫升微量离心管中。对上清液进行离心以去除任何细胞碎片，将澄清后的上清液转移至新的超速离心管中，随后进行超速离心，将沉淀的微粒在石蜡密封的超速离心管中于-80摄氏度保存，直至进一步实验分析。为将微粒注入小鼠结肠，首先将完全麻醉的小鼠置于俯卧位，使用活检钳和配备高分辨率摄像头的内窥镜，在结肠背侧制造3至5个浅表性伤口。将小鼠放回笼中，并持续监测直至完全恢复。24小时后，在麻醉状态下使用内窥镜获取损伤部位的图像。然后利用基于结肠镜的微注射系统，将重新悬浮于100 µL HBSS中的实验剂量PMN微粒直接注射至每个损伤部位。通过将中性粒细胞微颗粒与已知尺寸的流式细胞术微球进行比较，可以评估其大小的异质性。如本实验所示，也可利用流式细胞术检测微颗粒对特定目标蛋白的表达。在本研究中，采用免疫印迹法检测了经激活剂刺激后中性粒细胞来源的微颗粒对关键促炎和抗炎分子的表达情况。中性粒细胞微颗粒对上皮细胞愈合的影响，可通过体外在预定时间点对划痕损伤的上皮单层进行成像观察，以及在活体中通过活检钳损伤后成像来监测。一旦掌握该技术，若操作得当，可在四小时内完成中性粒细胞来源微颗粒的分离。在进行该操作时，需注意在刺激前应将中性粒细胞置于冰上，以防止其过早活化及微颗粒的丢失。通过该实验流程，可利用流式细胞术、免疫印迹以及实时增殖反应技术，在不同刺激条件下或来源于不同细胞时，对微颗粒的内容物进行鉴定。该技术有助于研究微颗粒在免疫应答调控、屏障功能、组织损伤与修复以及癌症进展中的作用。观看本视频后，您应能够充分掌握如何分离和标记小鼠微颗粒，并如何在体内功能性伤口愈合实验中应用这些微颗粒。请勿忘记，操作活体动物可能存在危险，因此在进行本实验操作前，务必采取预防措施，穿戴个人防护装备，并完成相应的安全培训。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

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