在体内果蝇前运动神经末端的单分子跟踪
January 14th, 2018
在这里, 我们说明如何单分子照片激活定位显微镜可以进行的运动神经终端的一个活的果蝇第三龄幼虫。
果蝇突触前运动神经末梢的体内单分子追踪。该技术描述了如何在三龄果蝇幼虫的运动神经末梢对单个蛋白质进行体内跟踪和成像。该技术的主要优点是它允许以类似于体外系统中观察到的高分辨率对单个蛋白质进行成像、跟踪和定位。
转基因果蝇的设计。感兴趣的突触蛋白用光转化荧光团标记，这在黑腹果蝇中表达。解剖三龄果蝇幼虫。
将游荡的第三龄幼虫放在圆柱形或半圆柱形的 Sylgard 底座上。在幼虫上加入 40 μL Schneider's Insect Medium。在解剖显微镜下，将一个细小的别针穿过幼虫的头部，另一个穿过幼虫的尾部以固定它。
为了提供通路，使用细针在幼虫腹部区域背侧的中线做一个狭窄的切口。从这个切口点开始，使用弹簧剪刀沿体壁向前后方向切割。借助细镊子和弹簧剪刀从幼虫中取出内脏。
用 Schneider's Insect Medium 清洗解剖的幼虫。将两个细小的别针穿过两个体壁瓣中的每一个，以产生六边形解剖幼虫制剂。使用弹簧剪刀将幼虫大脑与腹侧神经索分离。
使用弯曲的镊子，将 minutien 销钉推入 Sylgard 底座。单粒子跟踪光激活定位显微镜。将幼虫的 Sylgard 基底倒置到装有 2 毫升室温 Schneider 昆虫培养基的玻璃底培养皿上。
将水倒在 ELYRA PS.1 显微镜的 63 倍水浸物镜上，然后将培养皿放在载物台上。打开 透射光 并使用目镜在 10 倍空气物镜的帮助下定位 Sylgard 底座上的幼虫。切换到 63 倍水浸物镜，并使用明场照明识别肌肉 6。
使用 ZEN Black Acquisition 软件，选择全内反射荧光 （TIRF） 配置。切换 488 纳米激光器，以绿色显示 eMos2。定位看起来像绳子上的珠子的神经肌肉接头，并获取低分辨率的 TIRF 图像，同时打开 405 纳米激光器和 561 纳米激光器，以便进行光转换并对 eMos2 红色物质进行成像。
对 405 纳米激光器使用非常低的激光功率，以实现适度恒定的随机光转换。在这里，405 纳米激光器以 0.09% 的速度运行，而 561 纳米激光器以 50% 的速度运行在软件的 TIRF 角度选项中，稍微滑出 TIRF 临界角。将曝光时间设置为 30 毫秒。
获取神经肌肉接头的时间序列图像。在这里，获得了一部 15， 000 帧的电影。将影片另存为 czi 格式文件。
数据分析。使用合适的单分子跟踪分析软件分析采集的电影。通过强度点扩散函数的高斯拟合定位每个荧光蛋白定位的 x 和 y 坐标。
要跟踪每个定位的轨迹，请为每个定位设置最少 8 个连续不同帧外观的阈值，以及每个帧之间最多三个像素移动量的阈值。获取轨迹图像、均方位移以及所有跟踪定位的扩散系数。代表性结果。
绘制了 Syntaxin-1A-eMos2 从三种不同幼虫中多个神经肌肉接头的单个轨迹的均方位移，为平均值加平均值减去标准误差。还绘制了均方位移曲线下的面积。Syntaxin-1A-mEos2 的弥散系数同样从多个神经肌肉接头获得，并绘制为相对频率分布的直方图。
扩散系数阈值揭示了 Syntaxin-1A 的两个群体，一个移动群体和一个不移动群体。计算 Syntaxin-1A-mEos2 的移动群体与固定群体的比率。结论。该视频应有助于了解如何在果蝇幼虫的神经肌肉接头处进行单蛋白追踪。
该技术为神经元通讯领域的研究人员提供了一种在体内以高分辨率可视化和观察单个蛋白质的移动性和组织的方法。
概览
本研究在果蝇幼虫第三龄的运动神经末梢使用光激活定位显微镜（PALM）进行体内单分子追踪。该技术允许对单个突触蛋白进行高分辨率成像和追踪，对于理解神经元通信至关重要。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 活体成像
- 突触生理学
背景
- 突触蛋白运动的复杂性对于神经元功能至关重要。
- 理解神经肌肉接头的蛋白动力学可以揭示突触传递的关键方面。
- 之前的方法缺乏追踪单个分子所需的分辨率。
- 单分子技术可以提供关于突触组织和动力学的见解。
研究目的
- 说明如何在体内追踪和成像单个蛋白。
- 使用PALM研究突触蛋白的流动性和定位。
- 为未来神经元研究提供详细的方法。
使用的方法
- 采用了光激活定位显微镜（PALM）。
- 果蝇幼虫作为生物模型，重点关注突触前运动末梢。
- 研究利用转基因果蝇，表达带有光可转换荧光团的突触蛋白Syntaxin-1A。
- 在Sylgard基底上解剖和固定幼虫，以便进行有效成像。
- 使用多种激光配置进行成像和光可转换，获取15,000帧的电影进行分析。
主要结果
- 研究成功追踪了神经肌肉接头的单个Syntaxin-1A-eMos2蛋白。
- 分析表明基于扩散系数存在可移动和不可移动的Syntaxin-1A群体。
- 通过均方位移和频率分布来评估蛋白质流动性。
- 发现增强了对活体系统中突触蛋白动力学和组织的理解。
结论
- 这项研究展示了一种在活体神经元中可靠地可视化单个蛋白质运动的方法。
- 研究结果有助于我们理解突触机制和神经元可塑性。
- 该技术可以促进突触生物学和神经生物学疾病的高级研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
In vivo single-molecule tracking enables direct observation of synaptic protein dynamics in intact neuronal systems, providing mechanistic insights into neurotransmitter release and synaptic function. This approach supports target validation by linking protein mobility to physiological states, reducing ambiguity in early-stage neuroscience target de-risking. The method enhances predictive confidence in lead identification by revealing functional states of presynaptic proteins in a disease-relevant, living model.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by correlating Syntaxin-1A mobility states with synaptic vesicle fusion events.
- Operational Value: Enables functional target validation through direct visualization of protein dynamics in intact neural circuits.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by distinguishing functional versus non-functional protein populations based on diffusion behavior.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated synaptic protein tracking readouts for compound screening in neuronal communication pathways.
- Quantitative Output: Generates diffusion coefficients and mobile/immobile ratios as measurable endpoints for assay standardization.
- Reproducibility: Enables consistent single-molecule localization across multiple neuromuscular junctions and larvae for reliable data capture.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Uses Drosophila motor nerve terminal as a disease-relevant system to study conserved presynaptic mechanisms.
- Translational Continuity: Bridges discovery to preclinical validation by tracking protein dynamics in intact, functional synapses.
- Mechanistic De-risking: Clarifies how Syntaxin-1A mobility correlates with docking, priming, and fusion steps in vesicle cycling.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to lead identification stages, where understanding synaptic protein behavior informs target selection and compound screening priorities.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking protein mobility to synaptic vesicle cycle stages in vivo.
- Screening: Delivers quantitative, localization-based readouts enabling compound effect assessment on protein dynamics.
- Analytics: Provides mean square displacement and diffusion coefficient distributions for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects molecular dynamics to synaptic function in a living model, supporting preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for tracking multiple synaptic proteins across neurobiology projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by resolving mechanistic ambiguity in presynaptic protein function.
- Operational Value: Delivers standardized, high-resolution tracking data reproducible across preparations.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by validating target engagement through direct protein behavior observation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement by identifying compounds that modulate specific protein mobility states.
Implementation Considerations
- Requires expertise in super-resolution microscopy, photoconvertible protein labeling, and single-particle tracking analysis.
- Needs TIRF-capable microscopy with 405nm, 488nm, and 561nm laser lines and sensitive EMCCD or sCMOS detection.
- Demands standardization of dissection, immobilization, and imaging protocols across laboratories for cross-team reproducibility.
- Adaptation to other model systems may require optimization of tissue accessibility and illumination depth.
- Practical limitations include photobleaching constraints and the need for low laser power to maintain stochastic photoconversion.
