在体内果蝇前运动神经末端的单分子跟踪

果蝇突触前运动神经末梢的体内单分子追踪。该技术描述了如何在三龄果蝇幼虫的运动神经末梢对单个蛋白质进行体内跟踪和成像。该技术的主要优点是它允许以类似于体外系统中观察到的高分辨率对单个蛋白质进行成像、跟踪和定位。

转基因果蝇的设计。感兴趣的突触蛋白用光转化荧光团标记，这在黑腹果蝇中表达。解剖三龄果蝇幼虫。

将游荡的第三龄幼虫放在圆柱形或半圆柱形的 Sylgard 底座上。在幼虫上加入 40 μL Schneider's Insect Medium。在解剖显微镜下，将一个细小的别针穿过幼虫的头部，另一个穿过幼虫的尾部以固定它。

为了提供通路，使用细针在幼虫腹部区域背侧的中线做一个狭窄的切口。从这个切口点开始，使用弹簧剪刀沿体壁向前后方向切割。借助细镊子和弹簧剪刀从幼虫中取出内脏。

用 Schneider's Insect Medium 清洗解剖的幼虫。将两个细小的别针穿过两个体壁瓣中的每一个，以产生六边形解剖幼虫制剂。使用弹簧剪刀将幼虫大脑与腹侧神经索分离。

使用弯曲的镊子，将 minutien 销钉推入 Sylgard 底座。单粒子跟踪光激活定位显微镜。将幼虫的 Sylgard 基底倒置到装有 2 毫升室温 Schneider 昆虫培养基的玻璃底培养皿上。

水倒在 ELYRA PS.1 显微镜的 63 倍水浸物镜上，然后将培养皿放在载物台上。打开 透射光 并使用目镜在 10 倍空气物镜的帮助下定位 Sylgard 底座上的幼虫。切换到 63 倍水浸物镜，并使用明场照明识别肌肉 6。

使用 ZEN Black Acquisition 软件，选择全内反射荧光 （TIRF） 配置。切换 488 纳米激光器，以绿色显示 eMos2。定位看起来像绳子上的珠子的神经肌肉接头，并获取低分辨率的 TIRF 图像，同时打开 405 纳米激光器和 561 纳米激光器，以便进行光转换并对 eMos2 红色物质进行成像。

对 405 纳米激光器使用非常低的激光功率，以实现适度恒定的随机光转换。在这里，405 纳米激光器以 0.09% 的速度运行，而 561 纳米激光器以 50% 的速度运行在软件的 TIRF 角度选项中，稍微滑出 TIRF 临界角。将曝光时间设置为 30 毫秒。

获取神经肌肉接头的时间序列图像。在这里，获得了一部 15， 000 帧的电影。将影片另存为 czi 格式文件。

数据分析。使用合适的单分子跟踪分析软件分析采集的电影。通过强度点扩散函数的高斯拟合定位每个荧光蛋白定位的 x 和 y 坐标。

要跟踪每个定位的轨迹，请为每个定位设置最少 8 个连续不同帧外观的阈值，以及每个帧之间最多三个像素移动量的阈值。获取轨迹图像、均方位移以及所有跟踪定位的扩散系数。代表性结果。

绘制了 Syntaxin-1A-eMos2 从三种不同幼虫中多个神经肌肉接头的单个轨迹的均方位移，为平均值加平均值减去标准误差。还绘制了均方位移曲线下的面积。Syntaxin-1A-mEos2 的弥散系数同样从多个神经肌肉接头获得，并绘制为相对频率分布的直方图。

扩散系数阈值揭示了 Syntaxin-1A 的两个群体，一个移动群体和一个不移动群体。计算 Syntaxin-1A-mEos2 的移动群体与固定群体的比率。结论。该视频应有助于了解如何在果蝇幼虫的神经肌肉接头处进行单蛋白追踪。

该技术为神经元通讯领域的研究人员提供了一种在体内以高分辨率可视化和观察单个蛋白质的移动性和组织的方法。