Name: 结合 x 射线晶体学与小角度 x 射线散射到模型的非结构化区域的 Nsa1 从s 酿酒酵母 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: 学习结合X射线晶体学与小角度X射线散射技术，对酿酒酵母Nsa1蛋白的无序区域进行结构建模。该方法适用于解析同时含有有序结构域和动态无序区域的复杂蛋白质结构。

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衍射数据是在阿贡国家实验室先进光子源（APS）的东南区域协作接入团队（SER-CAT）22-ID 和 22-BM 光束线上收集的。SAXS 数据是在劳伦斯伯克利国家实验室先进光源（ALS）的 SIBYLS 光束线上收集的。我们感谢 SIBYLS 光束线的工作人员在远程数据采集和处理方面提供的帮助。我们感谢美国国家环境健康科学研究所（NIEHS）质谱研究与支持小组在确定蛋白质结构域边界方面提供的协助。本工作由美国国立卫生研究院院内研究计划、美国国家环境健康科学研究所（NIEHS）（R. E. S. 项目编号 ZIA ES103247）以及加拿大卫生研究院（CIHR，项目编号 146626 至 M.C.P）资助。先进光子源（APS）的使用得到了美国能源部科学办公室基础能源科学办公室合同编号 W-31-109-Eng-38 的支持。先进光源（ALS）的使用得到了美国能源部科学办公室基础能源科学办公室合同编号 DE-AC02-05CH11231 的支持。SIBYLS SAXS 光束线的额外支持来自美国国立卫生研究院项目 MINOS（R01GM105404）和高规格仪器资助项目 S10OD018483。我们还要感谢 Andrea Moon 和 Sara Andres 博士对本文稿的审阅意见。

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作者无任何利益冲突需要披露。

通过本方案，成功制备了来自S. cerevisiae的重组Nsa1蛋白，并用于X射线晶体学和SAXS结构研究。Nsa1在溶液中性质稳定，并形成了多种晶体形式。在优化晶体过程中发现，Nsa1的C末端对蛋白酶降解敏感。高分辨率的正交晶系晶体仅能在Nsa1的C末端截短突变体中重复获得，这很可能是因为Nsa1的C末端具有柔性，阻碍了晶体堆积。尽管通过X射线晶体学以高分辨率解析了Nsa1的结构，但在两种晶体形式中均无法构建出C末端，因其无有序结构。对于Nsa1大小的生物大分子而言，晶体学是确定原子分辨率结构的首选技术；然而，与其他方法一样，晶体学也存在一定的局限性。其中主要局限之一是无法解析蛋白质中无序区域的结构40,41。
Nsa1 的 C 末端对其蛋白在核仁中的正确定位至关重要，这凸显了研究其结构的必要性10。Nsa1 的 C 末端结构通过小角 X 射线散射（SAXS）得以解析，该技术是 X 射线晶体学的一...

核糖体是大型的核糖核蛋白机器，在所有活细胞中负责将mRNA翻译成蛋白质这一基本过程。核糖体由两个亚基组成，这些亚基通过一个称为核糖体生物合成的复杂过程产生1,2,3,4。真核生物核糖体的组装依赖于数百种必需的核糖体组装因子的协助2,3,5。Nsa1（Nop7相关蛋白1）是一种真核生物核糖体组装因子，特异性参与大核糖体亚基的生成6，在高等生物中被称为含WD重复序列蛋白74（WDR74）7。研究表明，WDR74对小鼠囊胚的形成至关重要8，且WDR74启动子在癌细胞中常发生突变9。然而，Nsa1/WDR74在核糖体组装中的功能及其精确作用机制仍 largely 未知。为了初步揭示Nsa1/WDR74在真核生物核糖体成熟过程中的作用，研究人员开展了多项结构分析，包括X射线晶体学和小角X射线散射（SAXS）10。
X射线晶体学、核磁共振（NMR）波谱法、电子显微镜和小角X射线散射（SAXS）均为研究大分子结构的重要技术。大分子的大小、形状、可获得性和稳定性会影响其最适合的结构生物学方法，然而，通过所谓的&#34;混合&#34;方法结合多种技术正日益成为一种有益的工具11。特别是X射线晶体学和SAXS，是大分子结构解析中强大且互补的两种方法12。
晶体学可提供从小分子到核糖体等大型细胞机器的高分辨率原子结构，已在理解蛋白质及其他大分子的生物学功能方面促成 numerous 突破13。此外，基于结构的药物设计利用晶体结构通过计算方法进行分子对接，为药物发现与开发增添了关键维度14。尽管晶体学具有广泛适用性，但柔性与无序体系难以通过晶体学进行评估，因为晶体堆积可能受阻，或电子密度图可能不完整或质量较差。相比之下，SAXS 是一种基于溶液的低分辨率结构研究方法，能够描述从无序环区和末端到内在无序蛋白等柔性体系12,15,16。鉴于其适用于广泛的颗粒尺寸12，SAXS 可与晶体学协同作用，拓展结构研究能够回答的生物学问题范围。
Nsa1 适用于混合结构研究方法，因为它包含一个结构明确的 WD40 结构域，其后是一个功能性的但具有柔性的C末端，该C末端不适合采用X射线晶体学方法进行研究。以下是针对S. cerevisiae Nsa1 的克隆、表达和纯化实验方案，用于通过X射线晶体学和小角X射线散射（SAXS）进行混合结构测定。该方案可经调整后用于研究其他由有序区域和无序区域组合构成的蛋白质结构。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Nsa1的分子克隆&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMBP2 平行载体</td><td>Sheffield 等，Protein Expression and Purification 15, 34-39 (1999)</td><td></td><td>我们使用了经过改造的pMBP2质粒，其中包含一个N端His标签（pHMBP）</td></tr><tr><td>S. cerevisiae 基因组 DNA</td><td>ATCC</td><td>204508D-5</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;克隆Nsa1所用引物&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SC_Nsa1_FLFw</td><td>IDT</td><td></td><td>CGC CAA AGG CCT&lt;br/&gt; ATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGT&lt;br/&gt; GGATAG</td></tr><tr><td>SC_Nsa1_FLRv</td><td>IDT</td><td></td><td>AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTT&lt;br/&gt; GCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGC&lt;br/&gt; AGC</td></tr><tr><td>SC_Nsa1_DeltaCFw</td><td>IDT</td><td></td><td>GGGCGCCATGGGATCCATGAGG&lt;br/&gt; TTACTAGTCAGCTGTGTGG</td></tr><tr><td>SC_Nsa1_DeltaCRv</td><td>IDT</td><td></td><td>GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAAC&lt;br/&gt; CTTCCTTTTTTGCTTCCC</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;重组蛋白Nsa1的表达与纯化&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>大肠杆菌 BL21 (DE3) Star 感受态细胞</td><td>Invitrogen</td><td>C601003</td><td></td></tr><tr><td>pMBP-NSA1 及各种截短突变体</td><td>Lo 等，2017</td><td></td><td></td></tr><tr><td>硒代甲硫氨酸</td><td>分子构型</td><td>MD12-503B</td><td></td></tr><tr><td>IPTG，无二噁烷</td><td>普洛麦格</td><td>V3953</td><td></td></tr><tr><td>无EDTA蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Caledon 实验室化学品</td><td>7560-1-80</td><td></td></tr><tr><td>六水合氯化镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris缓冲液，pH 7.5</td><td>KD Medical</td><td>RGF-3340</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Invitrogen</td><td>15514-029</td><td></td></tr><tr><td>β-巯基乙醇</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>1 M 咪唑，pH 8.0</td><td>Teknova</td><td>I6980-06</td><td></td></tr><tr><td>Talon 亲和树脂</td><td>Clonetech</td><td>635503</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 15 mL 离心滤器（截留分子量 10K）</td><td>默克密理博</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad 16/600 Superdex 200 Prep Grade 凝胶过滤柱</td><td>GE-Healthcare</td><td>28989335</td><td></td></tr><tr><td>TEV 蛋白酶</td><td>由NIEHS蛋白质表达核心实验室制备</td><td>由美国国家癌症研究所（NCI）提供的表达质粒（Tropea 等，Methods Mol Biology，2009）</td><td></td></tr><tr><td>4-15% Mini-PROTEAN TGX 预制蛋白凝胶</td><td>BioRad</td><td>456-8056</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;结晶，蛋白酶解筛选&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>晶体筛选</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-110</td><td></td></tr><tr><td>晶体筛选试剂盒2</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-112</td><td></td></tr><tr><td>盐反应</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-136</td><td></td></tr><tr><td>初筛实验</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-144</td><td></td></tr><tr><td>PEG/离子筛选</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-139</td><td></td></tr><tr><td>JCSG+</td><td>分子尺度</td><td>MD1-37</td><td></td></tr><tr><td>Wizard 沉淀剂协同剂</td><td>分子构型</td><td>MD15-PS-T</td><td></td></tr><tr><td>Swissci 96孔3滴UVP坐滴板</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-05823</td><td></td></tr><tr><td>3英寸宽透明封箱胶带</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-506</td><td></td></tr><tr><td>Proti-Ace Kit</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-429</td><td></td></tr><tr><td>PEG 1500</td><td>分子维度</td><td>MD2-100-6</td><td></td></tr><tr><td>PEG 400</td><td>分子构型</td><td>MD2-100-3</td><td></td></tr><tr><td>HEPES/氢氧化钠 pH 7.5</td><td>分子构型</td><td>MD2-011-</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸钠三碱</td><td>分子构型</td><td>MD2-100-127</td><td></td></tr><tr><td>22 mm × 0.22 mm 硅化盖玻片</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-231</td><td></td></tr><tr><td>24孔板带密封垫（VDX板带密封垫）</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-172</td><td></td></tr><tr><td>18 mM 尼龙挂环（0.05 mm 至 0.5 mM）</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-945, HR4-947, HR4-970, HR4-971</td><td></td></tr><tr><td>Seed Bead Kit</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-320</td><td></td></tr><tr><td>磁性晶体帽</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-779</td><td></td></tr><tr><td>磁力冷冻取样棒</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-729</td><td></td></tr><tr><td>低温泡沫杜瓦瓶</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-673</td><td></td></tr><tr><td>晶体样品托系统</td><td>MiTeGen</td><td>M-CP-111-021</td><td></td></tr><tr><td>全裙边 96 孔透明板</td><td>VWR</td><td>10011-228</td><td></td></tr><tr><td>AxyMat 密封垫</td><td>VWR</td><td>10011-130</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UVEX-m</td><td>JAN Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop Lite 分光光度计</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蚊子机器人</td><td>TTP Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软件/网站&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HKL2000</td><td>Otwinoski 和 Minor，1997</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phenix</td><td>Adams 等，2010</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coot</td><td>Emsley 等，2010</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATSAS</td><td>Petoukhov 等，2012</td><td></td><td>https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/atsas-online/</td></tr><tr><td>散射</td><td>Rambo 和 Tainer，2013</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PyMOL</td><td>PyMOL 分子图形系统，版本 1.8 Schr&amp;ouml;dinger, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BUNCH</td><td>佩托霍夫和施韦尔根，2005</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CRYSOL</td><td>Svergun 等，1995</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PRIMUS</td><td>Konarev 等，2003</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EOM</td><td>Tria 等，2015</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

结合x射线晶体学与小角x射线散射技术对酿酒酵母（s. cerevisiae）nsa1蛋白非结构化区域进行建模

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

由于核糖体组装因子 Nsa1 的 C 末端无序且易受蛋白酶降解，因此解析来自 Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) 的全长 Nsa1 结构具有挑战性。本文描述了从 S. cerevisiae 中纯化重组 Nsa1 蛋白以进行 X 射线晶体学和小角 X 射线散射（SAXS）结构分析的方法。利用 X 射线晶体学解析了 Nsa1 蛋白中结构有序的 N 末端 WD40 结构域的结构，随后通过 SAXS 在溶液中解析了 Nsa1 C 末端的结构。从小溶液状态下的全长 Nsa1 蛋白收集了溶液散射数据。根据高分辨率的 WD40 结构域晶体结构计算理论散射强度，再结合刚体建模和从头计算（ab initio）建模方法，揭示了 Nsa1 的 C 末端结构。通过这种混合方法，重建了该蛋白的四级结构。本文所述方法可广泛适用于其他由有序与无序结构域共同组成的蛋白质的混合式结构解析。

从 S. cerevisiae 基因组 DNA 中通过 PCR 扩增得到 Nsa1，并将其亚克隆至含有 N 端 6x-His 亲和标签、随后连接 MBP 及 TEV 蛋白酶切割位点的载体中。将 Nsa1 转化至 E. coli BL21(DE3) 感受态细胞，在 IPTG 诱导下于 25 °C 过夜培养后，获得了高水平的蛋白表达（图 1A）。Nsa1 通过固定化钴亲和树脂进行亲和纯化，随后用 TEV 蛋白酶切除 MBP 标签，最后经凝胶过滤层析进一步分离纯化（图 1B）。收集凝胶过滤层析中含 Nsa1 的组分，合并后浓缩至 8 mg/mL，随后利用结晶机器人进行结晶筛选。初步的稀疏矩阵结晶筛选获得了两种不同的 Nsa1 晶体形态，分别为立方晶系和正交晶系（图 2A）。
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本方法描述了重组Nsa1的克隆、表达和纯化，用于通过X射线晶体学和小角X射线散射（SAXS）进行结构测定，适用于其他含有有序和无序结构域的蛋白质的混合结构分析。

结合X射线晶体学与小角X射线散射技术对酿酒酵母（S. Cerevisiae）Nsa1蛋白非结构化区域进行建模

酿酒酵母（S. cerevisiae）核糖体组装因子Nsa1全长结构的确定具有挑战性，原因是……

本实验的总体目标是制备一种由有序和无序结构域混合组成的重组蛋白，用于通过X射线晶体学和小角X射线散射进行混合结构分析。该方法有助于解答结构生物学中的关键问题，即如何将生物学功能与蛋白质所有可能构象的结构测定相关联。该技术的主要优势在于，可用于对X射线晶体学无法解析的蛋白质或大分子的动态区域进行建模。通常，初次接触该方法的研究人员在学习如何正确评估SAXS数据质量时会遇到困难。开始实验前，将Nsa1表达质粒转化至合适的大肠杆菌表达菌株中。培养细胞，诱导Nsa1表达，并收集细胞。将细胞重悬于25毫升预冷至4°C的裂解缓冲液中，缓冲液中含一片不含EDTA的蛋白酶抑制剂。在4°C条件下超声处理细胞7分钟，超声程序为每2秒开启、2秒关闭。然后，在4°C条件下以26,900 × g离心裂解液45分钟。确保混合物在离心过程中不发生冻结。接下来，用裂解缓冲液平衡装有10 ml固定化钴亲和树脂的重力流层析柱。将澄清的裂解液上样至层析柱中，并在4 °C条件下使其流经树脂。然后，用100 ml裂解缓冲液分两次洗涤树脂。用20 ml洗脱缓冲液从柱子中洗脱Nsa1。取15 µl洗脱液，在4%至15%的SDS-PAGE凝胶上电泳，以确认蛋白质的洗脱。然后，向洗脱液中加入1 ml浓度为1 mg/ml的TEV蛋白酶储存液。将洗脱液在4摄氏度下孵育过夜，以去除MBP标签。随后，使用10千道尔顿的离心过滤装置将去除MBP后的Nsa1浓缩至约5 ml，注意避免过度浓缩。将浓缩后的蛋白质在预先用缓冲液A平衡的凝胶过滤柱上进行纯化。该实验步骤中的一个关键环节是确保在纯化过程中完全去除所有聚集体。聚集体将干扰后续的结晶以及SAXS数据的采集与分析。取每管柱洗脱组分15 µL，通过SDS-PAGE分析，以确认MBP与Nsa1的分离情况。合并含有 Nsa1 的组分。使用 10 千道尔顿的离心过滤装置将合并的组分浓缩至约 8 mg/ml。在 289 纳米处测定吸光度，并计算蛋白浓度。立即进行蛋白酶解筛选和结晶试验。开始蛋白酶解筛选前，配制浓度为1 mg/ml的α-糜蛋白酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶和Glu-C蛋白酶储备液。用稀释缓冲液将每种储备液分别稀释至1:10、1:100和1:1,000。用缓冲液A将8 mg/ml的Nsa1溶液稀释至1 mg/ml。然后，对于每种蛋白酶稀释液，取1 µl蛋白酶稀释液与9 µl稀释后的蛋白储备液混合。将各溶液在37°C下孵育1小时。随后，向每种溶液中加入10 µl 2× SDS-PAGE上样缓冲液，并在95°C加热5分钟。使用4%至15%的SDS-PAGE凝胶电泳分析溶液，以鉴定蛋白酶抗性结构域。构建排除蛋白酶敏感区域的截短型表达载体。表达并纯化这些蛋白，用于结晶条件优化。在获取 Nsa1 蛋白在一系列浓度下的 SAXS 数据后，将终端 shell 文件路径设置为包含这些数据的目录。然后，启动分析软件。将散射曲线载入分析软件中。使用自动RG工具确定每条曲线的回转半径和前向散射强度。然后，为每条散射曲线生成Kratky图，以判断其致密程度。使用autonome工具计算每条曲线的对距离分布函数，初始最大尺寸设为回转半径的3倍。优化最大尺寸以获得平滑的对距离分布函数曲线，使其与实验散射曲线一致。通过比较不同浓度下的结构参数，验证是否存在辐射损伤或浓度依赖性效应。关键是要比较一系列浓度下的主要结构参数，包括回转半径、分子质量、前向散射强度以及对距离分布函数。这是为了确保不存在辐射损伤或浓度效应。接下来，使用初始蛋白质晶体结构文件、目标蛋白质序列文件以及实验SAXS数据文件，运行系综优化方法工具。通过比较初始晶体结构文件与系综文件的卡方值，判断该系综模型是否能很好地拟合实验数据。使用分子可视化软件将晶体结构与生成的构象体进行叠加。记录构象体的总数以及每个构象体对散射曲线贡献的占有率比例。蛋白酶敏感的Nsa1 C末端发生蛋白水解切割后，形成了正交晶系晶体。新纯化的 Nsa1 形成了立方晶体，但晶体结构中仍缺乏不稳定C末端的电子密度。在两种结构中，Nsa1 的N末端七个叶片状β螺旋桨WD-40结构域均得到了清晰解析。单独的 Nsa1 WD-40 结构域与实验SAXS数据的拟合效果不佳。结合刚体建模与C末端的从头重构，显著改善了拟合优度。集合建模进一步提高了拟合优度，揭示了C末端尾部在溶液中的构象采样。尽管SAXS是一种低分辨率结构技术，但它与高分辨率结构研究（如X射线晶体学）具有很好的互补性。因此，您可以对柔性区域和无序区域进行建模。通过收集和分析大分子的SAXS数据，您能够开始理解在发生特定作用后所引起的构象变化。在观看本视频后，您应能充分掌握如何结合X射线晶体学和SAXS技术，解析由有序区域和无序区域组成的蛋白质结构。

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Biochemistry

生物化学

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