结合X射线晶体学与小角X射线散射技术对酿酒酵母（S. Cerevisiae）Nsa1蛋白非结构化区域进行建模

本实验的总体目标是制备一种由有序和无序结构域混合组成的重组蛋白，用于通过X射线晶体学和小角X射线散射进行混合结构分析。该方法有助于解答结构生物学中的关键问题，即如何将生物学功能与蛋白质所有可能构象的结构测定相关联。该技术的主要优势在于，可用于对X射线晶体学无法解析的蛋白质或大分子的动态区域进行建模。

通常，初次接触该方法的研究人员在学习如何正确评估SAXS数据质量时会遇到困难。开始实验前，将Nsa1表达质粒转化至合适的大肠杆菌表达菌株中。培养细胞，诱导Nsa1表达，并收集细胞。

将细胞重悬于25毫升预冷至4°C的裂解缓冲液中，缓冲液中含一片不含EDTA的蛋白酶抑制剂。在4°C条件下超声处理细胞7分钟，超声程序为每2秒开启、2秒关闭。然后，在4°C条件下以26,900 × g离心裂解液45分钟。

确保混合物在离心过程中不发生冻结。接下来，用裂解缓冲液平衡装有10 ml固定化钴亲和树脂的重力流层析柱。将澄清的裂解液上样至层析柱中，并在4 °C条件下使其流经树脂。

然后，用100 ml裂解缓冲液分两次洗涤树脂。用20 ml洗脱缓冲液从柱子中洗脱Nsa1。取15 µl洗脱液，在4%至15%的SDS-PAGE凝胶上电泳，以确认蛋白质的洗脱。

然后，向洗脱液中加入1 ml浓度为1 mg/ml的TEV蛋白酶储存液。将洗脱液在4摄氏度下孵育过夜，以去除MBP标签。随后，使用10千道尔顿的离心过滤装置将去除MBP后的Nsa1浓缩至约5 ml，注意避免过度浓缩。

将浓缩后的蛋白质在预先用缓冲液A平衡的凝胶过滤柱上进行纯化。该实验步骤中的一个关键环节是确保在纯化过程中完全去除所有聚集体。聚集体将干扰后续的结晶以及SAXS数据的采集与分析。取每管柱洗脱组分15 µL，通过SDS-PAGE分析，以确认MBP与Nsa1的分离情况。

合并含有 Nsa1 的组分。使用 10 千道尔顿的离心过滤装置将合并的组分浓缩至约 8 mg/ml。在 289 纳米处测定吸光度，并计算蛋白浓度。

立即进行蛋白酶解筛选和结晶试验。开始蛋白酶解筛选前，配制浓度为1 mg/ml的α-糜蛋白酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶和Glu-C蛋白酶储备液。用稀释缓冲液将每种储备液分别稀释至1:10、1:100和1:1,000。

用缓冲液A将8 mg/ml的Nsa1溶液稀释至1 mg/ml。然后，对于每种蛋白酶稀释液，取1 µl蛋白酶稀释液与9 µl稀释后的蛋白储备液混合。将各溶液在37°C下孵育1小时。随后，向每种溶液中加入10 µl 2× SDS-PAGE上样缓冲液，并在95°C加热5分钟。

使用4%至15%的SDS-PAGE凝胶电泳分析溶液，以鉴定蛋白酶抗性结构域。构建排除蛋白酶敏感区域的截短型表达载体。表达并纯化这些蛋白，用于结晶条件优化。

在获取 Nsa1 蛋白在一系列浓度下的 SAXS 数据后，将终端 shell 文件路径设置为包含这些数据的目录。然后，启动分析软件。将散射曲线载入分析软件中。

使用自动RG工具确定每条曲线的回转半径和前向散射强度。然后，为每条散射曲线生成Kratky图，以判断其致密程度。使用autonome工具计算每条曲线的对距离分布函数，初始最大尺寸设为回转半径的3倍。

优化最大尺寸以获得平滑的对距离分布函数曲线，使其与实验散射曲线一致。通过比较不同浓度下的结构参数，验证是否存在辐射损伤或浓度依赖性效应。关键是要比较一系列浓度下的主要结构参数，包括回转半径、分子质量、前向散射强度以及对距离分布函数。

这是为了确保不存在辐射损伤或浓度效应。接下来，使用初始蛋白质晶体结构文件、目标蛋白质序列文件以及实验SAXS数据文件，运行系综优化方法工具。通过比较初始晶体结构文件与系综文件的卡方值，判断该系综模型是否能很好地拟合实验数据。

使用分子可视化软件将晶体结构与生成的构象体进行叠加。记录构象体的总数以及每个构象体对散射曲线贡献的占有率比例。蛋白酶敏感的Nsa1 C末端发生蛋白水解切割后，形成了正交晶系晶体。

新纯化的 Nsa1 形成了立方晶体，但晶体结构中仍缺乏不稳定C末端的电子密度。在两种结构中，Nsa1 的N末端七个叶片状β螺旋桨WD-40结构域均得到了清晰解析。单独的 Nsa1 WD-40 结构域与实验SAXS数据的拟合效果不佳。

结合刚体建模与C末端的从头重构，显著改善了拟合优度。集合建模进一步提高了拟合优度，揭示了C末端尾部在溶液中的构象采样。尽管SAXS是一种低分辨率结构技术，但它与高分辨率结构研究（如X射线晶体学）具有很好的互补性。

因此，您可以对柔性区域和无序区域进行建模。通过收集和分析大分子的SAXS数据，您能够开始理解在发生特定作用后所引起的构象变化。在观看本视频后，您应能充分掌握如何结合X射线晶体学和SAXS技术，解析由有序区域和无序区域组成的蛋白质结构。