Name: 活蛙 (爪蟾) 胚胎单细胞代谢的微探针毛细管电泳质谱 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: 了解利用微探针毛细管电泳质谱技术对非洲爪蟾活胚胎单细胞进行原位微量采样的方法。该技术可快速表征代谢物，为发育生物学研究提供精准的细胞代谢分析工具。

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本工作得到了美国国立卫生研究院基金项目 GM114854（资助 P.N.）和 CA211635（资助 P.N.）、阿诺德和梅布尔·贝克曼基金会贝克曼青年研究员奖（资助 P.N.）、杜邦青年教授奖（资助 P.N.）、美国质谱学会研究奖（资助 P.N.）以及 COSMOS Club 基金会研究员项目（资助 R.M.O. 和 E.P.P.）的支持。本出版物中表达的观点和结论仅为作者个人观点，不一定代表资助方的官方立场。

所有关于非洲爪蟾（Xenopus laevis）饲养与操作的实验方案均经乔治·华盛顿大学机构动物护理与使用委员会批准（IACUC 编号：A311）。
1. 采样仪器、培养基、溶剂和采样皿的准备
<ol>
	<li>通过将以下盐类溶解于超纯水（约18.2 MΩ·cm）中，配制1× Steinberg's溶液（SS）&#937;厘米 25 &#176;C按照标准方案，以下列顺序和指定浓度依次加入33氯化钠（58.2 mM）、氯化钾（0.67 mM）、硝酸钙（0.34 mM）、硫酸镁（0.83 mM）、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-hydrochloride，4.19 mM）和三羟甲基氨基甲烷碱（Tris base，0.66 mM）。使用超纯水将1x SS溶液稀释两倍制备0.5x SS溶液，稀释十倍制备0.1x SS溶液。</li>
	<li>通过将琼脂糖配制成2%的1x SS溶液来制备采样皿。在高压灭菌器中灭菌 120 &#176;C 孵育20分钟以溶解。在溶液仍为液态时，将其均匀涂布于60 mm培养皿底部。待琼脂糖凝胶冷却并完全凝固后，将一支六英寸巴斯德吸管的末端在火焰上加热至形成小球状，轻轻触碰加热端，在琼脂糖表面压出5–10个约1 mm深的小孔。 
	注意：这些孔用于在取样过程中固定胚胎。</li>
	<li>配制代谢物提取溶剂。根据溶剂的理化性质进行优化（例如、极性和pH）与研究中关注的分子类别相匹配。 
	注意：例如，我们采用40%甲醇和40%乙腈溶于液相色谱-质谱级水中，作为一种发现策略，主要用于靶向极性代谢物，以及少量非极性代谢物和肽类28.</li>
	<li>使用干净的头发和巴斯德吸管制作毛发环，具体方法见其他文献描述33 用于在培养皿中轻柔移动胚胎，同时尽量减少干扰。</li>
	<li>制备如图所示的锥形尖端微移液管 图1a.
	<ol>
		<li>首先，拉制硼硅酸盐毛细管（1,000/500 &#181;m 外径/内径）置于Flaming-Brown型毛细管拉制仪中，设置参数如下：加热温度 = 355；拉伸力度 = 65，拉伸速度 = 80；作用时间 = 150。</li>
		<li>接下来，使用一对精细的尖头镊子折断拉制好的微移液管尖端，以获得约 ~ 的毛细管尖端外径20 &#181;m在体视显微镜下进行此步骤，以提高精确性和可重复性。 
		注意：尖端较细的毛细管在吸取黏稠的细胞质时容易发生堵塞。虽然尖端较大的毛细管确实有助于避免堵塞并能吸取更多的细胞内容物，但大口径毛细管在采集较小细胞时可能带来操作困难，并可能损伤细胞，影响后续取样。仔细调节吸取时的压力和时间可在一定程度上缓解这些问题。我们发现，使用尖端直径约为~20 &#181;m 外径非常适合本文所述的工作。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 单细胞微采样与代谢物提取
<ol>
	<li>通过促性腺激素诱导的成年动物自然交配获取胚胎（受精卵） Xenopus laevis 或通过 体外 受精过程参见其他文献中的实验方案描述33,34. 
	注意：自然交配可确保胚胎发育阶段呈交错分布，而通过体外受精获得的胚胎 体外 受精过程的供应更为可靠。然而， 体外 受精过程需要牺牲成年雄性青蛙。</li>
	<li>新鲜配制2%半胱氨酸脱胶溶液：将4 g半胱氨酸溶解于200 mL超纯水中，逐滴加入10 N氢氧化钠溶液调节pH至8。</li>
	<li>当胚胎开始分裂进入2细胞期时，去除其周围的胶状包膜，操作步骤如下：将胚胎置于去胶液中静置2分钟，然后轻轻晃动2分钟，以防止胚胎黏附在收集皿的表面。</li>
	<li>将培养皿中的内容物轻轻倒入一个干净的烧杯中，迅速倒去烧杯中的去胶液。立即用0.1x SS覆盖胚胎，以冲洗残留的去胶液，轻轻摇晃后倾去溶液。重复此步骤四次，以彻底清洗胚胎。 
	注意：为确保胚胎活性，脱胶溶液处理胚胎的时间应限制在4分钟以内。有关去除胶质包被的详细实验方案可参见其他文献。33.</li>
	<li>将去胶胚胎转移至培养皿中的1x SS溶液中。为尽量减少培养皿内胚胎拥挤，每个100 mm培养皿中放置约100个胚胎。33. 
	注意：含有胚胎的培养皿可在14-18 &#176;C 以减缓发育速度，从而获得来自同一亲本但处于不同发育阶段的胚胎。有关生长与发育对温度依赖性的进一步指南已发布于Xenbase及其他资源中。33,35,36,37.</li>
	<li>将2细胞期的卵裂胚胎挑选并移至另一培养皿中，根据已建立的细胞命运图谱，以典型的色素分布明确标记背腹轴38,39,40.
	<ol>
		<li>通过确保第一次卵裂沟（界定正中矢状面）将动物极深色（腹侧）和浅色（背侧）色素区域均等分割，使两个半球互为镜像，从而识别正确卵裂的胚胎41.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将制备好的微移液管安装在多轴显微操作器（手动或远程控制）上，并将微移液管连接至显微注射仪。</li>
	<li>使用塑料移液管吸取约5个8细胞期胚胎，并转移至含有0.5x SS的取样皿中。利用毛细环将待取样的胚胎移入单独的孔中，并确保目标细胞正确定位，朝向微探针，角度约为~90&#176; 角度。 
	注意：根据胚胎中的色素沉着和细胞位置，参照细胞命运图来鉴定细胞38,39,40.</li>
	<li>在体视显微镜下（20-30倍放大）操作时，将微量移液器的尖端引导至活体胚胎中已识别的单个细胞内，如图所示。 图1 （参见图B中的细胞取样点及图C中的装置）。</li>
	<li>使用显微注射仪对微毛细管施加负压脉冲（“填充模式”），吸取细胞内容物的所需部分。 
	注意：例如，我们通常通过向毛细管施加约3次-30 psi的负压脉冲，从细胞中吸取约10–15 nL体积的样本。整个吸取过程持续约5秒。30.</li>
	<li>轻轻将微电极从细胞中抽出，并将其尖端转移至 4 &#181;L 代谢物提取溶剂的冷却4 &#176;C) 加入微型小瓶中。接着，使用显微注射器（“透明模式”）对毛细管施加 +80 psi 的压力脉冲，持续 1 秒，以将吸入物排入溶剂中。
	<ol>
		<li>紧密盖上瓶盖以防止蒸发，并将小瓶放回 4 &#176;C 冰桶中直至取样完成。将使用过的微量移液器丢弃至锐器容器中，以防止针刺伤害。 
		注意：为了确定所吸取的细胞内容物的体积，可将吸出物注入石蜡油中，使其形成球形。使用显微镜测量该球体的直径，并据此计算所吸取的体积： V = 4/3 &#960; r3，其中 V 是体积，而 r 是球体的半径。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>如需对同一细胞再次取样或对胚胎的其他细胞取样，请重复步骤 2.7–2.11图1c). 为避免连续取样间的潜在交叉污染，每次分析不同细胞时均应使用新的微量移液器。</li>
	<li>采样完成后，将含有样品的微量离心管涡旋混匀约 1 分钟，以加速代谢物的提取，随后在 8,000 &#215; g 5 分钟 4 &#176;C 以沉淀细胞碎片及其他颗粒物质。</li>
	<li>将细胞裂解物与细胞碎片及沉淀物质一同于 -20 &#176;C 一天或在 -80 &#176;C 最长可保存1个月，之后进行CE-ESI-MS检测。</li>
</ol>
3. 毛细管电泳-电喷雾电离质谱检测
<ol>
	<li>CE-ESI-MS 标准品与溶液的制备
	<ol>
		<li>配制背景电解质溶液（BGE），其中含有1%甲酸的LC-MS级水。</li>
		<li>配制鞘液，其中含有50%甲醇（LC-MS级水配制）和0.1%甲酸。</li>
		<li>在鞘液中配制50 nM乙酰胆碱溶液，用于每日评估CE-ESI-MS系统的性能。</li>
		<li>配制 150 mM 氯化钠溶液作为低质量校准标准 m/z 正离子模式下的质量范围。质量（m/z准确性 &#60;建议使用 10 ppm。请按照质谱仪供应商的说明进行此步骤。 
		注意：或者，也可使用其他已知的標準 m/z 可用于对质谱仪进行质量校准。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>CE-ESI 平台的构建
	<ol>
		<li>构建一个毛细管电泳进样平台，该平台能够快速垂直移动承载背景电解质（BGE）瓶和样品加载微管的载物台。有关该平台的构建与操作细节，请参见参考文献中的说明31.</li>
		<li>组装 CE-ESI 接口（图1c）如下所述。安装电喷雾金属喷针（130/260 &#181;m 内径/外径和约35 mm长度）插入三通T型接头中。将分离用毛细管电泳柱（40/105 &#181;m 内径/外径和约100厘米长度）穿过电喷雾发射器，使其突出约40-100 &#181;m 超出喷头尖端。在体视显微镜下操作以提高准确性。
		<ol>
			<li>连接鞘液毛细管（75/360 &#181;m 内径/外径和约100 cm长度）连接至剩余端口，用于输送电喷雾溶液。使用合适的套管并用手拧紧连接处，以确保毛细管电泳-电喷雾电离（CE-ESI）接口无泄漏运行。参见先前的实验方案31,32 有关该接口的组装和故障排除的详细信息。 
			注意：毛细管的尺寸会影响信噪比（S/N）和分离时间。例如，窄内径且较短的毛细管可使用较高的分离电压实现快速分离。42,43此外，根据研究中感兴趣分子的类型，可对分离毛细管进行涂层处理，以最大程度减少或避免分子与毛细管壁之间的非特异性相互作用44.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用平板支架将CE-ESI接口安装到三轴平移台上，并将电喷雾发射器尖端置于距质谱仪进样口约2 mm处（图1c).</li>
		<li>为了清洁接口部件，通过电喷雾发射器注入电喷雾鞘液进行冲洗 1 &#181;L/min 并通过毛细管电泳分离毛细管输送背景电解质溶液。使用注射泵以恒定速率输送溶剂。</li>
		<li>每次测量前，通过将注射器连接至毛细管进样端冲洗毛细管电泳分离毛细管。应使用足够大容量的注射器，以尽量减少溶剂供给管路的重新填充和引液操作。 
		注意：实验通常使用1 mL气密式注射器来供给电喷雾鞘液溶剂以及 500 &#181;L 注射器冲洗分离毛细管。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>CE-ESI-MS 平台验证及代谢物检测 
	注意：此步骤的目的是在分析单细胞提取物之前，每天确认 CE-ESI-MS 仪器的分析灵敏度。使用此处所述的 CE-ESI 平台，结合四极杆正交加速飞行时间质谱仪，可实现 60 amol 的检测下限。16.
	<ol>
		<li>用分离毛细管冲洗约5分钟后，将其进口端转移至位于不锈钢小瓶中的背景电解质（BGE）溶液中。</li>
		<li>将电喷雾发射器尖端置于距质谱仪入口约 2 mm 处，并使用平移台微调此距离，在体视显微镜下监测喷雾状态，以在稳定的锥-射流模式下产生电喷雾（参见参考文献）31,45监测总离子流（TIC）的稳定性约30–45分钟，以确保系统稳定运行。</li>
		<li>对BGE样品瓶施加约20 kV电压，通过约15秒时间逐步升高电位，通常可产生约7.5 &#181;A 使用1%甲酸作为背景电解质，在分离毛细管中施加电流。每次测量前，监测总离子流（TIC）谱图约5-10分钟以确保系统稳定，然后逐步将分离（CE）电压降低至0 V（接地）。 
		注意：为了实现该过程的半自动化，我们使用自行编写的软件远程控制毛细管电泳高压电源31如果CE-ESI-MS平台不稳定，应首先按照其他文献建议的方法，分别在仅ESI模式和CE-ESI运行模式下测试该平台，以仔细评估不稳定性的来源。31简而言之，为在仅ESI模式下测试该平台，需关闭CE高压，并在锥-射流喷雾状态下监测总离子流（TIC）约30分钟。如有必要，按以下步骤排除故障：（i）检查连接处是否漏液；（ii）依次用水、异丙醇、水和甲醇清洗电喷雾发射器；（iii）对溶剂进行脱气处理；（iv）在重新测试前冲洗发射器约25分钟。若CE-ESI平台在仅ESI模式下表现稳定，但在CE分离过程中变得不稳定，则应检查系统是否存在焦耳热和/或电解现象：（i）用BGE冲洗分离毛细管约25分钟，并重复实验；（ii）采用较低的分离电压以维持线性欧姆响应即，线性毛细管电泳电流与分离电压关系曲线）；（iii）检查毛细管电泳毛细管是否存在潜在损伤（如裂纹），必要时更换毛细管。</li>
		<li>分析约6 nL的样品，步骤如下：
		<ol>
			<li>移液器 1 &#181;L 将乙酰胆碱标准溶液注入进样瓶中。</li>
			<li>将分离毛细管从BGE瓶转移至进样瓶。</li>
			<li>在1秒内将毛细管电泳进样阶段提升15 cm。</li>
			<li>将进样阶段抬高并保持60秒，通过流体动力学方式将约6 nL样品注入分离毛细管中。</li>
			<li>随后，将载物台移回起始位置（与毛细管出口对齐）。</li>
			<li>轻轻将毛细管进样端插入BGE中。</li>
			<li>紧接着，逐步升高碰撞能（CE）电压以启动电泳分离。</li>
			<li>开始质谱数据采集。 
			注意：可使用任意化学标准品表征系统性能。单细胞毛细管电泳-电喷雾电离质谱联用技术对乙酰胆碱、甲硫氨酸和组氨酸的检测限可低至约10 nM（约60 amol）16注射体积（V注射），进入毛细管的纳升级体积（nL）取决于注射过程中的高度差（H，cm）、密度（&#961;克/立方厘米-3）和黏度（&#951;千克·米-1s-1) BGE 的长度 (L, m) 和半径 (r, &#181;m) 毛细管电泳（CE）毛细管的长度，以及进样时间（t注射，s）。该关系由以下公式表示，其中 g （m s-2) 为重力加速度： 
			<img alt="方程" src="/files/ftp_upload/56956/56956eq1v2.jpg" /></li>
		</ol>
		</li>
		<li>标准品检测完毕后，停止数据采集，逐步将分离电压降至 0 V（接地），然后将喷嘴移回至距入口 2 cm 处。在分析细胞提取物之前，用缓冲液冲洗分离毛细管 5 分钟。</li>
		<li>使用90秒的流体动力学进样法，重复步骤3.3.1–3.3.5，测量10 nL的单细胞提取物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数据处理 
	注意：数据处理的目标是识别和量化单个细胞之间的化合物。单细胞CE-ESI-MS方案产生窄的电泳峰，其典型基线宽度仅为数秒。通过半手动方式进行数据分析，可以发现分子特征（独特 m/z 使用以下步骤对具有独特迁移时间的值进行分离。图中展示了部分已鉴定代谢物的代表性分离结果。 图2a.
	<ol>
		<li>数据采集后对原始数据文件进行质量校准。 
		注意：我们使用在分离样品中天然存在于细胞内或从胚胎培养基中提取的大量钠离子时生成的甲酸钠簇信号。此步骤的目的是通过确保高质量精度来增强后续步骤中的代谢物鉴定m/z准确性，最好 &#60;5 mDa，或 &#60;10 ppm，介于 m/z 50-1,000。此处，数据采集后的校准使得常规获得高质量精度成为可能 &#60;1 mDa，或 &#60;2 ppm 对于 m/z 50-500.</li>
		<li>使用处理脚本，在检测到的质量范围内搜索分子特征。对每个峰的质谱进行平均，以确定精确质量，并记录其相应的迁移时间。用于鉴定低分子量代谢物 m/z 50–500 范围内，使用 500 mDa 步进窗口监测具有信噪比（S/N）的分子特征 &#62; 3.</li>
		<li>手动或自动积分每个分子特征的峰面积。所得面积值用于衡量代谢物的丰度。</li>
		<li>以高置信度鉴定感兴趣的分子特征，步骤如下（见图2b).
		<ol>
			<li>首先，将分子特征的精确质量与代谢物数据库进行比对（例如，Metlin46 和 HMDB47) 以 10 ppm 的精度获得一组可能的质量匹配结果。</li>
			<li>接下来，通过将细胞提取物获得的串联质谱图与代谢物数据库中的数据或相应化学标准品测得的串联质谱图进行比对，评估这些质量匹配结果。</li>
			<li>最后，通过将细胞提取物中记录的分子特征的迁移时间与使用相同CE-ESI-MS仪器分析的相关化学标准品进行比较，验证这些指认结果。 
			注意：为了提高实验通量，我们通常仅鉴定在实验条件或细胞类型之间具有统计学显著差异的分子特征。代表性鉴定结果如图所示 图2为准确鉴定代谢物的高分辨质谱数据，建议每日对外部质谱仪进行校准，在每次测量过程中使用内标物进行实时校正，和/或在数据采集完成后对每个测量文件进行外部质量校准（例如，建议使用甲酸钠团簇。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>为比较单细胞间小分子产物的产量，使用选离子电泳图中峰面积（来自步骤 3.4.3）作为化合物丰度的相对度量。 
		注意：在我们的实验中，使用在线软件平台47 用于执行后续数据分析的所有步骤，包括以下步骤：i）筛选在每组样本中出现频率至少为50%的分子特征例如，细胞类型）；ii）数据的标准化；iii）统计学（例如, t-检验）和多变量数据分析，例如主成分分析（PCA）和层次聚类分析（HCA）。我们使用 p &#60; 0.05（Student's t-test）表示统计学显著性，以倍数变化 ≥ 1.5 表示生物学显著性。</li>
		<li>为确定单个细胞中小分子的绝对浓度，需采用经典的校准方法（例如，使用目标化合物的峰面积进行外部校准或标准加入法校准16.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

微探针CE-ESI-MS技术能够直接表征活体、自由发育胚胎中单个细胞内的代谢物。该方法的核心包含两个技术子组件，即 原位 毛细管微采样与高灵敏度毛细管电泳-电喷雾质谱联用技术。与全细胞显微解剖相比，毛细管微采样具有操作快速（数秒 vs. 解剖法每细胞约5分钟）、适用于胚胎复杂的三维形态结构，以及可扩展至发育后期形成的更小细胞等优势。与解剖方法不同，微探针采样可保持胚胎中其他细胞的完整性，以便后续分析。引人注目的是，经微采样后的细胞仍可继续分裂，为细胞分化的长期研究提供了可能. 控制微探针尖端尺寸的能力还使得微探针CE-ESI-MS能够作为一种多功能工具，用于研究代谢在细胞及发育过程中所起的作用，适用于其他模式生物，包括斑马鱼和小鼠。为确保结果的可信性，必须对目标细胞进行精确、准确且一致的识别与取样。吸样实验参数例如毛细管尺寸、压力和时间）可进行调整，以采集细胞的特定区域。此外，固定胚胎对于精确定位目标细胞至关重要，这能够最大限度地减少对胚胎的损伤。在本方案中，我们在琼脂糖包被的培养皿中制作了孔穴，用于在采样过程中固定胚胎。根据我们的经验，与平头毛细管相比，斜面尖端的毛细管可显著减少对...

要全面理解胚胎发育过程，需要对发育中生物体每个细胞内发生的全部分子变化进行表征。尽管结合分子扩增技术的下一代测序能够深入检测发育系统中单个细胞的转录组1，并已在多个研究中得到应用2,3，但关于单个胚胎细胞所产生的较小分子（包括蛋白质，尤其是代谢物，分子量&#60;~1,500 Da）的种类和动态仍知之甚少。由于代谢组能够对细胞内外事件作出快速且动态的响应，因此可作为描述细胞分子状态的有力指标。因此，单细胞代谢组学有望用于追踪早期胚胎中细胞异质性在时空上的演变过程，并发现可用于功能研究的新分子。然而，由于这些分子无法进行分子扩增，对代谢组的检测依赖于极高灵敏度的质谱技术（MS），而质谱正是当前代谢物分析的首选技术。
单细胞质谱（MS）是一类具有足够灵敏度以检测单个细胞内代谢物的技术集合（参见综述4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15）。可重复的细胞取样和高效的代谢物提取对于成功检测单细胞中的代谢物至关重要。通过对非洲爪蟾（Xenopus）胚胎中已识别细胞进行全细胞解剖，已实现对小分子和肽类的表征16。其他方法则采用微移液管对单个活细胞进行取样，随后通过电喷雾电离（ESI）质谱进行检测。例如，已有研究利用单细胞视频质谱17、压力探针18、单探针技术19以及流体显微镜技术20等多种技术，在植物或哺乳动物细胞中检测了代谢物21,22,23,24。此外，在电离前引入化学分离步骤可有效简化单细胞质谱流程中的代谢组，从而减轻检测前离子生成过程中的潜在干扰。重要的是，分离还能提供化合物特异性信息，有助于分子鉴定。毛细管电泳（CE）已被用于检测从单个解剖神经元25,26或微量取样神经元27中获得的代谢物，揭示了不同神经元表型之间的小分子差异。我们近期将毛细管电泳与电喷雾电离串联质谱（ESI-MS/MS）联用，实现了对从非洲爪蟾（Xenopus laevis）早期胚胎中分离出的单个细胞内数百种代谢物在痕量水平上的检测16,28。这些研究揭示了发育早期阶段胚胎细胞之间出人意料的代谢差异，并发现了具有此前未知发育作用的代谢物16。
本文提供了一种利用微探针单细胞毛细管电泳-电喷雾电离质谱法（CE-ESI-MS）直接在活体脊椎动物胚胎中检测单个细胞代谢物的实验方案29,30选用的模式生物为8至32细胞期 X. laevis 胚胎，尽管该方法也可适用于发育的后期阶段及其他类型的模式生物。本方案利用在高分辨率成像系统引导下、通过多轴平移控制的锋利毛细管，吸取约10 nL的特定细胞内容物 原位 在形态复杂的发育胚胎中，该微型探针可扩展用于更小的细胞，且操作在数秒内完成，速度足以追踪胚胎中的细胞谱系。从收集的样本中提取极性或非极性小分子（如代谢物和肽类）至约4–5 µL提取溶液后，取约10 nL提取液，在自主搭建的毛细管电泳（CE）平台联用电喷雾质谱（ESI-MS）系统中进行分析。CE-ESI-MS平台的构建与操作基于已有文献所述的实验方案。31,32 同轴毛细管电泳-电喷雾电离接口的构建方法如其他文献所述。31 该平台在锥-射流喷雾模式下运行，可实现痕量级别的灵敏度，并具备在4至5个数量级动态范围内进行定量分析的能力（相对28,29,30 或绝对16). CE-ESI-MS 平台对小分子在 10 nM 至 1 µM 的检测范围内具有 60 amol 的检出限，定量分析的相对标准偏差（RSD）为 8%16，足以表征内源性代谢物 X. laevis 细胞。随着胚胎发育的进行，经微探针处理的细胞继续分裂30，从而实现对细胞代谢在时间和空间上的精确分析。事实上，单细胞毛细管电泳-电喷雾电离质谱（CE-ESI-MS）可用于发现位于背侧-腹侧不同位置的细胞之间的代谢差异16,29，动物极-植物极16，以及左右28 发育轴以及由一个共同的前体细胞形成的神经组织命运的背侧谱系细胞 X. laevis30除了探究不同发育阶段单个胚胎细胞之间的代谢差异外 X. laevis 胚胎30我们预计，本文所述方案可广泛适用于从胚胎发育不同阶段以及其他类型细胞和模式生物中微量采集的多种生物分子和单细胞。此外，可利用该微探针进行微量取样，同时结合其他适用于极微量样品的平台，用于生物分子的分离和/或表征。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;胚胎培养基试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 366-1</td><td></td></tr><tr><td>硫酸镁</td><td>Fisher Scientific</td><td>M 65-3</td><td></td></tr><tr><td>硝酸钙</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1396</td><td></td></tr><tr><td>半胱氨酸</td><td>MP Biomedicals</td><td>101444</td><td></td></tr><tr><td>三羟甲基氨基甲烷盐酸盐</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>三羟甲基氨基甲烷碱</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>5641-212</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;代谢物提取溶剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙腈（LC-MS级）</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955</td><td></td></tr><tr><td>甲醇（LC-MS级）</td><td>Fisher Scientific</td><td>A456</td><td></td></tr><tr><td>水（LC-MS级）</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;毛细管电泳-电喷雾电离质谱（CE-ESI-MS）用溶剂与标准品&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>甲酸（LC-MS级）</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11710X1-AMP</td><td></td></tr><tr><td>甲醇（LC-MS级）</td><td>Fisher Scientific</td><td>A456-4</td><td></td></tr><tr><td>水（LC-MS级）</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>5641-212</td><td></td></tr><tr><td>氯化乙酰胆碱</td><td>Acros Organics</td><td>159170050</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;微探针制备装置&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>微量移液器拉制仪</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>硼硅酸盐毛细管</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>B100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>精细尖头镊子：Dumont #5，Biologie/Dumoxel</td><td>Fine Science Tools (USA) Inc</td><td>11252-30</td><td>耐腐蚀且可高压灭菌。</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;微探针取样装置&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微操作器</td><td>Eppendorf, Hauppauge, NY</td><td>TransferMan 4r</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Nikon</td><td>SMZ18</td><td>应进行振动隔离。</td></tr><tr><td>照明装置（例如鹅颈灯）</td><td>Nikon</td><td>C-FLED2</td><td></td></tr><tr><td>微量注射器</td><td>Warner Instrument, Handem, CT</td><td>PLI-100A</td><td></td></tr><tr><td>移液管（塑料，一次性）</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>培养皿（60 mm 和 80 mm）</td><td>Fisher Scientific</td><td>S08184</td><td></td></tr><tr><td>玻璃巴斯德移液管（硼硅酸盐，一次性）</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Thermo Scientific</td><td>Sorvall Legend X1R</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;毛细管电泳-电喷雾电离质谱（CE-ESI-MS）装置&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>高压电源</td><td>Spellman</td><td>CZE1000R</td><td>可通过个人计算机生成的低压程序远程控制高压电源。注意：高压存在电击危险；所有连接部件必须接地或妥善屏蔽，以防止用户意外接触。</td></tr><tr><td>注射泵（2台）</td><td>Harvard Apparatus</td><td>704506</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Amscope</td><td>SM-3BZZ</td><td>具备4.5&amp;times;放大倍数的体视显微镜，配备照明装置以监测CE-ESI接口的喷雾模式。</td></tr><tr><td>XYZ三维平移台</td><td>Thorlabs</td><td>PT3</td><td></td></tr><tr><td>XYZ三维平移台</td><td>定制</td><td></td><td>该平台可通过流体动力学进样将纳升级样品加载至分离毛细管中，并为毛细管电泳提供背景电解质溶液（BGE）。本文所述的两种接口均能在1分钟内将6&amp;ndash;10 nL样品注入1米长的分离毛细管中。</td></tr><tr><td>不锈钢样品瓶</td><td>定制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>不锈钢BGE瓶</td><td>定制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>熔融石英毛细管（40 &amp;micro;m/105 &amp;micro;m 内径/外径；100 cm）</td><td>Polymicro technologies</td><td>TSP040105</td><td></td></tr><tr><td>熔融石英毛细管（75 &amp;micro;m/360 &amp;micro;m 内径/外径；100 cm）</td><td>Polymicro technologies</td><td>TSP075375</td><td></td></tr><tr><td>钝头不锈钢喷针（130/260 &amp;micro;m 内径/外径）</td><td>Hamilton Co.</td><td>21031A</td><td>为获得更佳性能，建议使用激光切割并对喷针尖端进行精细抛光。</td></tr><tr><td>气密性注射器：500 - 1000 &amp;micro;L</td><td>Hamilton Co.</td><td>1750TTL</td><td></td></tr><tr><td>数字万用表</td><td>Fluke</td><td>Fluke 117</td><td></td></tr><tr><td>高分辨质谱仪</td><td>Bruker Daltonics</td><td>Maxis Impact HD</td><td>配备大气压电喷雾电离（ESI）接口的高分辨串联质谱仪</td></tr><tr><td>质谱仪校准用调谐混合物</td><td>Agilent technologies</td><td>ESI-L G1969-85000</td><td></td></tr><tr><td>数据分析软件 ver. 4.3</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;辅助设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>可在4&amp;ndash;10&amp;deg;C下运行的真空浓缩仪</td><td>Labconco</td><td>7310022</td><td></td></tr><tr><td>分析型微量天平（XSE105DU）</td><td>Fisher Scientific</td><td>01911005</td><td></td></tr><tr><td>冷冻柜（-20 &amp;deg;C）</td><td>Fisher Scientific</td><td>97-926-1</td><td></td></tr><tr><td>冷冻柜（-80 &amp;deg;C）</td><td>Fisher Scientific</td><td>88300ASP</td><td></td></tr><tr><td>冷藏培养箱</td><td>Fisher Scientific</td><td>11475126</td><td></td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td>Benchmark</td><td>BS-VM-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

用于活体非洲爪蟾（xenopus laevis）胚胎单细胞代谢组学的微探针毛细管电泳质谱分析

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

单细胞中小分子的定量分析为深入理解胚胎发育基本过程带来了新的可能。为了能够在活体胚胎中直接开展单细胞研究，亟需开发新的分析方法，特别是那些具有高灵敏度、高选择性、定量能力、稳健性，并可适用于不同细胞尺寸的分析技术。本文介绍了一种能够实现 原位 非洲爪蟾自由发育胚胎中单细胞代谢分析非洲爪蟾），细胞与发育生物学中的强大模型。该方法利用毛细管微探针从胚胎中已鉴定的单个细胞内吸出特定部分，同时保持邻近细胞完整，以便后续分析。所收集的细胞内容物通过微尺度毛细管电泳-电喷雾电离（CE-ESI）接口连接高分辨串联质谱仪进行分析。该方法可适用于不同大小的细胞，并兼容发育中胚胎复杂的三维结构。例如，我们展示了微探针单细胞CE-ESI-MS技术能够揭示前体细胞在胚胎发育过程中产生子代细胞时所呈现的代谢异质性。除细胞与发育生物学外，本文所述的单细胞分析方案也可适用于其他细胞大小、细胞类型或动物模型。

我们最近采用微探针单细胞毛细管电泳-电喷雾电离质谱法，对自由发育过程中单个已鉴定细胞内的代谢物进行了表征 Xenopus laevis 胚胎29,30微探针能够实现快速（约5秒/细胞） 原位 从单个细胞中吸取约10 nL液体，对同一细胞进行多次吸取，或在活体胚胎相同或不同发育阶段对多个不同细胞进行吸取（图1b）。使用合适的溶剂提取抽吸所得的细胞内容物，然后利用自行构建的毛细管电泳-电喷雾电离（CE-ESI）接口对代谢物进行分离和离子化，并通过质谱（MS）检测。该方法通常可从单个细胞中获得约300个非冗余的代谢物信号（去除同位素峰和簇峰后）。图中展示了部分分子的分离结果 图2a我们基于细胞提取物信号的迁移时间及其与标准品或串联质谱数据库中信号的MS/MS碎片模式比对，高置信度地鉴定了70种不同的小极性代谢...

我们描述了实现快速的步骤 原位 使用基于毛细管的微采样技术，对单个细胞进行高精度、低侵入性的小部分取样，结合自主搭建的单细胞毛细管电泳与质谱分析平台，实现对活体胚胎中代谢活性瞬时状态的化学表征。

用于活体非洲爪蟾（Xenopus laevis）胚胎单细胞代谢组学的微探针毛细管电泳质谱分析

单细胞中小分子的定量分析为深入理解胚胎发育基本过程带来了新的可能性……

本实验方案的总体目标是通过原位微采样毛细管电泳-质谱法对发育中胚胎的活细胞内代谢物进行表征。该方法有助于回答细胞与发育生物学领域的关键科学问题，因为它能够在活体发育胚胎中直接对单个细胞的代谢过程进行分析。该技术的主要优势在于其快速、可适用于不同大小的细胞，并且能够在活体胚胎中对单个细胞实现微创采样。该方法的可视化演示至关重要，因为某些步骤较难掌握：胚胎发育相对较快，且需使用定制的毛细管电泳电喷雾电离仪器。首先，用1X Steinberg's溶液配制2%琼脂糖。在溶液仍为液态时，将其涂布于60毫米培养皿底部。待琼脂糖凝胶冷却并凝固后，将一根六英寸长的巴斯德吸管末端在火焰上加热至熔成球状。然后，轻轻将加热过的末端接触凝胶表面，在琼脂糖中压出5到10个约一毫米深的小孔。要制备锥形尖端的微量移液管，首先使用文本方案中所述的参数，在Flaming/Brown型毛细管拉制仪中拉制硼硅酸盐毛细管。接下来，使用一对精细的尖头镊子折断拉制好的微毛细管尖端，使其毛细管尖端外径约为 20 微米。此步骤应在体视显微镜下进行，以提高操作的精确性和可重复性。通过促性腺激素诱导成年非洲爪蟾（xenopus laevis）自然交配，或按照文中所述实验方案采用体外受精的方法获取胚胎。当胚胎开始分裂至两细胞期时，去除其周围的胶状包膜：首先将胚胎在去胶液中静置两分钟，然后轻轻摇晃额外两分钟，以防止胚胎黏附在收集皿的表面。将培养皿中的内容物轻轻倒入一个干净的烧杯中，并迅速倒掉烧杯中的去胶液。立即用0.1X Steinberg's溶液覆盖卵子，以冲洗掉残留的脱胶液。轻轻摇晃后倾倒溶液。重复此步骤四次，以彻底清洗胚胎。将去胶胚胎转移至培养皿中的1X Steinberg's溶液中。为尽量减少培养皿内胚胎拥挤，每个100毫米培养皿中放置约100个胚胎。将处于二细胞期的卵裂胚胎分选至另一个培养皿中，其中典型的色素分布可明确标记背腹轴，作为建立硫酸盐图谱的参考依据。通过确保第一次卵裂沟（标志着正中矢状面）将深色素的动物极和浅色素的动物极均等分割，使两个半部分互为镜像，从而识别正确卵裂的胚胎。接着，将制备好的微吸管安装到多轴显微操作仪上，并将微吸管连接至显微注射仪。使用塑料移液管吸取约五个八细胞期胚胎，并将其转移至含有0.5X Steinberg溶液的样品皿中。利用毛细环将待取样的胚胎移入单独的孔中，并确保目标细胞正确定位，且朝向微探针的角度约为90度。在体视显微镜下操作时，将微移液管的尖端引导进入活胚胎中已识别的单个细胞内。使用显微注射仪向微毛细管施加负压脉冲，吸取细胞内所需量的内容物。轻柔地将微探针从细胞中撤出，并将其尖端转移至含有4微升预冷代谢物提取溶剂的微型离心管中。随后，使用显微注射仪向毛细管施加80 psi的正压脉冲，持续一秒钟，将吸入物排入溶剂中。紧密封闭离心管以防止蒸发，并将离心管放回冰上直至取样完成。取样完成后，涡旋混匀含有样品的微量离心管约一分钟，以加快代谢物的提取。随后，在 4 °C 条件下以 8,000 ×g 离心五分钟，使细胞碎片及其他颗粒沉淀。将细胞提取物与细胞碎片及沉淀物一同在-20摄氏度下保存一天，或在-80摄氏度下保存长达一个月，直至进行CE-ESI-MS检测。根据文本方案中的参考，构建毛细管电泳（CE）进样平台，该平台能够快速垂直移动承载背景电解质瓶和样品加载微管的载物台。通过先将电喷雾金属发射器安装到三通T型接头中，组装CE-ESI接口。然后，将分离毛细管穿过电喷雾发射器，使其末端超出发射器尖端约 40 至 100 微米。操作时应在体视显微镜下进行，以提高准确性。将鞘液毛细管连接至剩余端口，用于供给电喷雾溶液。使用合适的套管和手拧紧连接件，以确保毛细管电泳-电喷雾电离（CE-ESI）接口无泄漏运行。利用载物板支架将CE-ESI接口安装到三轴平移台上，并将电喷雾发射器尖端置于距质谱仪入口约两毫米的位置。清洗接口组件时，首先以每分钟一微升的流速通过电喷雾发射器输送电喷雾液片溶液，同时通过毛细管电泳分离毛细管输送背景电解质（BGE）。使用注射泵以恒定速率输送溶剂。每次测量前，将注射器连接至毛细管入口端，冲洗毛细管电泳分离毛细管。使用容量较大的注射器，以尽量减少溶剂供给管路的重新填充和引液操作。用分离毛细管冲洗约五分钟之后，将其入口端转移至位于不锈钢小瓶中的背景电解质（BGE）溶液中。将电喷雾发射器尖端置于距离质谱仪入口约两毫米处。使用平移台微调此距离，同时在体视显微镜下观察喷雾情况，以实现稳定锥形喷射状态下的电喷雾。监测总离子流（TIC）的稳定性约30至45分钟，以确保系统运行稳定。通过约15秒的时间逐步升高电压，向BGE小瓶施加21±2千伏电压，通常在分离毛细管中使用1%甲酸作为BGE时产生约7.5微安的电流。每次测量前，需先监测TIC谱图约5至10分钟以确认系统稳定，然后逐步将分离电压降至0伏。用移液器将1 µL乙酰冷却标准溶液加入进样小瓶中，并将分离毛细管从BGE小瓶转移至进样小瓶。在1秒内将毛细管电泳进样阶段升高15 cm。60秒后，通过流体动力学方式将6 nL样品注入分离毛细管中。随后，将载物台移回初始位置，并轻柔地将毛细管进样端插入背景电解质（BGE）中。紧接着，逐步升高毛细管电泳（CE）电压，启动电泳分离及EMA状态采集。待标准品被检测到后，停止数据采集，并逐步将分离电压降至0伏。然后，将发射极移回至距喷嘴两厘米处。在分析细胞提取物之前，先冲洗分离毛细管五分钟。通过重复这些步骤，以90秒进行流体动力学进样，测量单个细胞提取物的10纳升。此处展示的是细胞提取物的代表性电泳图谱，其中显示了一系列已鉴定代谢物的分离情况。通过将细胞提取物信号的迁移时间及串联质谱碎裂模式与标准品或串联质谱数据库中的数据进行比对，已高置信度地鉴定了70种不同的信号，均为小分子极性代谢物。代谢物的鉴定是通过比较样品中未知信号的精确质量、迁移时间以及碎裂行为与代谢物标准品或代谢物数据库中已有数据的一致性来完成的。此步骤以组氨酸为例进行演示。此处展示了在八细胞、十六细胞和三十二细胞胚胎阶段，通过微探针CE-ESI-MS鉴定并取样的单个背侧细胞。对三种不同细胞类型中鉴定出的代谢物进行多变量分析，揭示了不同细胞阶段的代谢谱差异及复杂的代谢变化趋势。对定量元数据进行主成分分析，揭示了八细胞胚胎中一种已鉴定的前体细胞分裂形成16细胞和32细胞胚胎中的细胞克隆时发生的代谢变化。图中展示了部分代谢物的代表性变化趋势。例如，乙酰胆碱的丰度随着细胞分裂而减少，而三乙醇胺以及丝氨酸/精氨酸在这些细胞类型中则呈现出相反的变化趋势。一旦掌握，该技术操作速度很快，通常每个细胞不到10秒即可完成。我们最初提出该方法的想法，是在开始研究早期非洲爪蟾（Xenopus laevis）胚胎中代谢细胞异质性的过程中。观看本视频后，您应能充分理解如何利用微探针毛细管电泳-质谱联用技术分析单个胚胎细胞中的代谢物。进行此操作时，必须注意动作迅速，因为代谢组具有动态性，且发育中的胚胎细胞分裂迅速。同时，需仔细检查分析细节，以确保获得高质量的细胞代谢数据。该技术的应用前景包括对活体样本的诊断，因为我们的微探针质谱方法速度快、侵入性小，并且适用于微量样品。完成此操作后，还可进行硫酸盐示踪等其他方法，以回答代谢物对组织特化影响等进一步的问题。请注意，使用高压电源可能极为危险，在执行此操作时，必须采取预防措施，例如对带电界面进行电气隔离。

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科研

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Chemistry

化学

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