用于活体非洲爪蟾（Xenopus laevis）胚胎单细胞代谢组学的微探针毛细管电泳质谱分析

本实验方案的总体目标是通过原位微采样毛细管电泳-质谱法对发育中胚胎的活细胞内代谢物进行表征。该方法有助于回答细胞与发育生物学领域的关键科学问题，因为它能够在活体发育胚胎中直接对单个细胞的代谢过程进行分析。该技术的主要优势在于其快速、可适用于不同大小的细胞，并且能够在活体胚胎中对单个细胞实现微创采样。

该方法的可视化演示至关重要，因为某些步骤较难掌握：胚胎发育相对较快，且需使用定制的毛细管电泳电喷雾电离仪器。首先，用1X Steinberg's溶液配制2%琼脂糖。在溶液仍为液态时，将其涂布于60毫米培养皿底部。

待琼脂糖凝胶冷却并凝固后，将一根六英寸长的巴斯德吸管末端在火焰上加热至熔成球状。然后，轻轻将加热过的末端接触凝胶表面，在琼脂糖中压出5到10个约一毫米深的小孔。要制备锥形尖端的微量移液管，首先使用文本方案中所述的参数，在Flaming/Brown型毛细管拉制仪中拉制硼硅酸盐毛细管。

接下来，使用一对精细的尖头镊子折断拉制好的微毛细管尖端，使其毛细管尖端外径约为 20 微米。此步骤应在体视显微镜下进行，以提高操作的精确性和可重复性。通过促性腺激素诱导成年非洲爪蟾（xenopus laevis）自然交配，或按照文中所述实验方案采用体外受精的方法获取胚胎。

当胚胎开始分裂至两细胞期时，去除其周围的胶状包膜：首先将胚胎在去胶液中静置两分钟，然后轻轻摇晃额外两分钟，以防止胚胎黏附在收集皿的表面。将培养皿中的内容物轻轻倒入一个干净的烧杯中，并迅速倒掉烧杯中的去胶液。

立即用0.1X Steinberg's溶液覆盖卵子，以冲洗掉残留的脱胶液。轻轻摇晃后倾倒溶液。重复此步骤四次，以彻底清洗胚胎。

将去胶胚胎转移至培养皿中的1X Steinberg's溶液中。为尽量减少培养皿内胚胎拥挤，每个100毫米培养皿中放置约100个胚胎。将处于二细胞期的卵裂胚胎分选至另一个培养皿中，其中典型的色素分布可明确标记背腹轴，作为建立硫酸盐图谱的参考依据。

通过确保第一次卵裂沟（标志着正中矢状面）将深色素的动物极和浅色素的动物极均等分割，使两个半部分互为镜像，从而识别正确卵裂的胚胎。接着，将制备好的微吸管安装到多轴显微操作仪上，并将微吸管连接至显微注射仪。

使用塑料移液管吸取约五个八细胞期胚胎，并将其转移至含有0.5X Steinberg溶液的样品皿中。利用毛细环将待取样的胚胎移入单独的孔中，并确保目标细胞正确定位，且朝向微探针的角度约为90度。在体视显微镜下操作时，将微移液管的尖端引导进入活胚胎中已识别的单个细胞内。

使用显微注射仪向微毛细管施加负压脉冲，吸取细胞内所需量的内容物。轻柔地将微探针从细胞中撤出，并将其尖端转移至含有4微升预冷代谢物提取溶剂的微型离心管中。随后，使用显微注射仪向毛细管施加80 psi的正压脉冲，持续一秒钟，将吸入物排入溶剂中。

紧密封闭离心管以防止蒸发，并将离心管放回冰上直至取样完成。取样完成后，涡旋混匀含有样品的微量离心管约一分钟，以加快代谢物的提取。随后，在 4 °C 条件下以 8,000 ×g 离心五分钟，使细胞碎片及其他颗粒沉淀。

将细胞提取物与细胞碎片及沉淀物一同在-20摄氏度下保存一天，或在-80摄氏度下保存长达一个月，直至进行CE-ESI-MS检测。根据文本方案中的参考，构建毛细管电泳（CE）进样平台，该平台能够快速垂直移动承载背景电解质瓶和样品加载微管的载物台。通过先将电喷雾金属发射器安装到三通T型接头中，组装CE-ESI接口。

然后，将分离毛细管穿过电喷雾发射器，使其末端超出发射器尖端约 40 至 100 微米。操作时应在体视显微镜下进行，以提高准确性。将鞘液毛细管连接至剩余端口，用于供给电喷雾溶液。

使用合适的套管和手拧紧连接件，以确保毛细管电泳-电喷雾电离（CE-ESI）接口无泄漏运行。利用载物板支架将CE-ESI接口安装到三轴平移台上，并将电喷雾发射器尖端置于距质谱仪入口约两毫米的位置。清洗接口组件时，首先以每分钟一微升的流速通过电喷雾发射器输送电喷雾液片溶液，同时通过毛细管电泳分离毛细管输送背景电解质（BGE）。

使用注射泵以恒定速率输送溶剂。每次测量前，将注射器连接至毛细管入口端，冲洗毛细管电泳分离毛细管。使用容量较大的注射器，以尽量减少溶剂供给管路的重新填充和引液操作。

用分离毛细管冲洗约五分钟之后，将其入口端转移至位于不锈钢小瓶中的背景电解质（BGE）溶液中。将电喷雾发射器尖端置于距离质谱仪入口约两毫米处。使用平移台微调此距离，同时在体视显微镜下观察喷雾情况，以实现稳定锥形喷射状态下的电喷雾。

监测总离子流（TIC）的稳定性约30至45分钟，以确保系统运行稳定。通过约15秒的时间逐步升高电压，向BGE小瓶施加21±2千伏电压，通常在分离毛细管中使用1%甲酸作为BGE时产生约7.5微安的电流。每次测量前，需先监测TIC谱图约5至10分钟以确认系统稳定，然后逐步将分离电压降至0伏。

用移液器将1 µL乙酰冷却标准溶液加入进样小瓶中，并将分离毛细管从BGE小瓶转移至进样小瓶。在1秒内将毛细管电泳进样阶段升高15 cm。60秒后，通过流体动力学方式将6 nL样品注入分离毛细管中。

随后，将载物台移回初始位置，并轻柔地将毛细管进样端插入背景电解质（BGE）中。紧接着，逐步升高毛细管电泳（CE）电压，启动电泳分离及EMA状态采集。待标准品被检测到后，停止数据采集，并逐步将分离电压降至0伏。

然后，将发射极移回至距喷嘴两厘米处。在分析细胞提取物之前，先冲洗分离毛细管五分钟。通过重复这些步骤，以90秒进行流体动力学进样，测量单个细胞提取物的10纳升。

此处展示的是细胞提取物的代表性电泳图谱，其中显示了一系列已鉴定代谢物的分离情况。通过将细胞提取物信号的迁移时间及串联质谱碎裂模式与标准品或串联质谱数据库中的数据进行比对，已高置信度地鉴定了70种不同的信号，均为小分子极性代谢物。代谢物的鉴定是通过比较样品中未知信号的精确质量、迁移时间以及碎裂行为与代谢物标准品或代谢物数据库中已有数据的一致性来完成的。

此步骤以组氨酸为例进行演示。此处展示了在八细胞、十六细胞和三十二细胞胚胎阶段，通过微探针CE-ESI-MS鉴定并取样的单个背侧细胞。对三种不同细胞类型中鉴定出的代谢物进行多变量分析，揭示了不同细胞阶段的代谢谱差异及复杂的代谢变化趋势。

对定量元数据进行主成分分析，揭示了八细胞胚胎中一种已鉴定的前体细胞分裂形成16细胞和32细胞胚胎中的细胞克隆时发生的代谢变化。图中展示了部分代谢物的代表性变化趋势。例如，乙酰胆碱的丰度随着细胞分裂而减少，而三乙醇胺以及丝氨酸/精氨酸在这些细胞类型中则呈现出相反的变化趋势。

一旦掌握，该技术操作速度很快，通常每个细胞不到10秒即可完成。我们最初提出该方法的想法，是在开始研究早期非洲爪蟾（Xenopus laevis）胚胎中代谢细胞异质性的过程中。观看本视频后，您应能充分理解如何利用微探针毛细管电泳-质谱联用技术分析单个胚胎细胞中的代谢物。

进行此操作时，必须注意动作迅速，因为代谢组具有动态性，且发育中的胚胎细胞分裂迅速。同时，需仔细检查分析细节，以确保获得高质量的细胞代谢数据。该技术的应用前景包括对活体样本的诊断，因为我们的微探针质谱方法速度快、侵入性小，并且适用于微量样品。

完成此操作后，还可进行硫酸盐示踪等其他方法，以回答代谢物对组织特化影响等进一步的问题。请注意，使用高压电源可能极为危险，在执行此操作时，必须采取预防措施，例如对带电界面进行电气隔离。