Name: 自动测量隐球菌种多糖胶囊和细胞体 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: 了解如何使用自动化图像处理算法测量Cryptococcus neoformans的多糖胶囊和细胞体半径。该方法通过印度墨汁染色和明场显微镜实现高通量分析，显著提高研究效率并减少人工测量疲劳。

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我们谨此致谢Anthony Bowen，其提供的切片用于第二次人类样本的并列比较；同时感谢Sabrina Nolan，其提供的切片用于第三次人类样本的并列比较以及第二次显微镜的对比分析。

1. 墨汁涂片的制备
<ol>
	<li>用移液器吸取10 µL隐球菌样品滴加到载玻片上。任何圆形酵母菌株均可使用，但本实验仅使用了H99菌株。 
	注意：如果样品直接来自培养基，用PBS或水按1:2比例稀释有助于防止印度墨水发生凝集。</li>
	<li>将2 µL印度墨水染液滴加到样品上，通过用移液器枪头轻压样品并以圆形方式移动，直至印度墨水均匀分布。</li>
	<li>将盖玻片覆盖在样品上：用手按住盖玻片左侧边缘紧贴载玻片表面，然后缓慢而均匀地放下另一侧，使盖玻片覆盖样品。</li>
	<li>让载玻片在空气中干燥5分钟。</li>
	<li>轻轻在盖玻片边缘涂一层薄薄的指甲油，以形成密封，保存印度墨水染色效果。</li>
</ol>
2. 成像载玻片
<ol>
	<li>将载玻片置于配备摄像头和已知像素-微米转换率的明场显微镜下。调整滤光片、物镜和对比度，使细胞荚膜清晰可见，细胞体呈现为聚焦良好的暗带。 
	注意：多种滤光片、物镜和对比度设置均可使用，但推荐采用20倍物镜、Ph1滤光片和2×2像素合并（binning）。</li>
	<li>确保视野中隐球菌细胞密度适中，不过于密集，细胞荚膜与背景之间对比清晰，细胞体聚焦良好并呈现为明显的暗带。 
	注意：最佳图像所需的细胞数量因样本和所用物镜而异。关键要点是确保细胞不聚集或重叠，细胞的焦平面无明显差异，且背景中印度墨汁染色清晰可见（至少占视野的25%）。</li>
	<li>将图像保存至一个单独的文件夹，并使用清晰的文件名命名，因为测量算法将在该文件夹内的所有图像上运行，输出数据将根据图像文件名进行组织。</li>
</ol>
3. 算法设置
<ol>
	<li>从</li>
	<li>通过运行命令 &#34;pip install pillow&#34; 和 &#34;pip install openpyxl&#34; 安装额外的 Python 库。</li>
	<li>按照</li>
	<li>根据 https://www.mathworks.com/help/matlab/matlab_external/install-the-matlab-engine-for-python.html 提供的说明构建 MATLAB Python 库。</li>
	<li>下载本文稿件补充材料中包含的三个必需文件（&#34;QCA.py&#34;、&#34;Analysis2.m&#34; 和 &#34;TestRun.m&#34;）。 
	注意：这些文件可以解压到任意位置，但三个文件必须位于同一目录中。</li>
</ol>
4. 算法的使用
<ol>
	<li>双击 QCA.py 运行应用程序。 
	&#8203;注意：应用程序启动可能需要几分钟时间。 &#34;QCA.py&#34; 文件包含调用程序结构的 &#34;.&#34; 用于运行实际算法的文件。</li>
	<li>按照程序中概述的步骤进行操作。
	<ol>
		<li>输入图像文件的扩展名，每个扩展名前加一个句点，并用分号隔开（例如。 &#34;.TIF；.jpeg&#34;然后点击 输入 按钮</li>
		<li>单击以选择图像文件所在的目录 选择目录 按钮并选择包含图像的文件夹。</li>
		<li>单击目录以生成图像文件列表 生成图像列表 按钮。图像将列在右侧的文本框中。请检查并确保列表准确且完整。</li>
		<li>从列表中随机选择一张图像，通过点击将其用作预览 选择随机图像 按钮。 
		注意：如果图像因某种原因无法打开， &#34;图像模式错误&#34; 尽管不显示图像，算法仍会正常运行。在步骤 4.2.7 之后，测试图像仍会显示。</li>
		<li>输入显微镜物镜和 binning 设置。如果默认设置与所用显微镜不符，请选择 &#34;自定义像素转换&#34; 并输入图像文件的像素到微米（pixel-to-μm）转换系数。选择后，点击 计算转化率 按钮，并根据右侧文本框中的内容确保转换正确。 
		&#8203;注意：图中所示为代表性图像 图1 使用40倍放大倍数和2×2像素合并模式进行计算。</li>
		<li>输入用于圆检测的算法参数。
		<ol>
			<li>输入外囊检测可识别的最小和最大半径，分别作为“最小囊半径”和“最大囊半径”。较小的范围可获得更准确的结果。</li>
			<li>在“最小细胞体半径”和“最大细胞体半径”输入框中，分别输入细胞体检测可识别的最小和最大半径值。 
			注意：这四个条目均应为数字，表示其在源图像中的对应像素值。</li>
			<li>移动“胶囊”和“细胞体敏感度”滑块以调整算法的敏感度阈值。较低的敏感度设置较为严格，可减少假阳性圆圈的检测，但也可能导致真实圆圈的检出数量减少。相反，较高的敏感度会提高检测率，但可能增加假阳性圆圈的出现。 
			&#8203;注：代表性结果采用的参数为胶囊最小半径7、最大半径45，物体最小半径4、最大半径30，胶囊敏感度87，物体敏感度87。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>通过点击随机选择的图像来测试参数 运行测试 按钮。结果将显示在程序的上方中央位置，取代原始图像。如果结果显示准确，建议再选择另一张随机图像进行尝试，以确保所选参数适用于所有选定的图像。
		<ol>
			<li>最大化检测到的细胞核和囊状结构数量，并目视检查圆形标记是否拟合正确。检测到的囊内细胞核数量将显示在右侧的文本框中。若不符合，调整算法参数直至结果准确。 
			注意：彩色粗线圆圈仅用于辅助可视化。实际用于测量的圆圈是由HCT算法计算得出的数学曲线。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>单击以在整个图像文件目录上运行检测算法 开始分析 按钮。每张图像都将被分析，程序将显示 &#34;完成&#34; 在所有图像分析完成后，于右侧文本框中进行填写。</li>
		<li>点击 匹配与清理 按钮。此操作将把检测到的细胞体与它们所在的检测胶囊进行匹配，并通过从胶囊中减去细胞体来计算真实的胶囊半径。 
		注意：如果该算法用于检测荧光或其他仅检测到一个圆的情况，则此步骤无需执行。相反，请单击 仅拉动躯干部分 或 仅拉取胶囊 分别点击按钮以仅收集蓝色或绿色圆圈的数据。需要注意的是，如果仅获取胶囊数据，则半径将指细胞的总半径，因为无法扣除细胞体本身的半径。</li>
		<li>在以下位置找到已完成的数据 &#34;CleanedOuput.csv&#34; 图像目录中的文件。如果仅选择了一组数据，文件将被标记为 &#34;CleanedBodies.csv&#34; 或 &#34;CleanedCapsules.csv&#34;.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Park, B. J., Wannemuehler, K. A., Marston, B. J., Govender, N., Pappas, P. G., Chiller, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+the+current+global+burden+of+cryptococcal+meningitis+among+persons+living+with+HIV%2FAIDS%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS.</a> AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).</li>
<li>Kwon-Chung, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptococcus+neoformans+and+Cryptococcus+gattii%2C+the+etiologic+agents+of+cryptococcosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii, the etiologic agents of cryptococcosis.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (7), 019760(2014).</li>
<li>Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+of+Cryptococcus+neoformans.+Regulation+of+capsule+synthesis+by+carbon+dioxide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide.</a> J Clin Invest. 76 (2), 508(1985).</li>
<li>Rumbaugh, J., Pool, A., Gainey, L., Forrester, K., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.neurology.org/content/80/7_Supplement/P04.007">The Role of Cryptococcal Capsule in Pathogenesis of Cryptococcal Meningitis.</a> Neurology. 80 (7), Supplement (P04.007) 007(2013).</li>
<li>Bojarczuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptococcus+neoformans+Intracellular+Proliferation+and+Capsule+Size+Determines+Early+Macrophage+Control+of+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Cryptococcus neoformans Intracellular Proliferation and Capsule Size Determines Early Macrophage Control of Infection.</a> Sci Rep. 6, (2016).</li>
<li>Robertson, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptococcus+neoformans+Ex+Vivo+Capsule+Size+Is+Associated+With+Intracranial+Pressure+and+Host+Immune+Response+in+HIV-associated+Cryptococcal+Meningitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Cryptococcus neoformans Ex Vivo Capsule Size Is Associated With Intracranial Pressure and Host Immune Response in HIV-associated Cryptococcal Meningitis.</a> J Infect Dis. 209 (1), 74-82 (2014).</li>
<li>Araujo, G. deS., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capsules+from+Pathogenic+and+Non-Pathogenic+Cryptococcus+spp.+Manifest+Significant+Differences+in+Structure+and+Ability+to+Protect+against+Phagocytic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Capsules from Pathogenic and Non-Pathogenic Cryptococcus spp. Manifest Significant Differences in Structure and Ability to Protect against Phagocytic Cells.</a> PLoS One. 7 (1), 29561(2012).</li>
<li>García-Rivera, J., Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptococcus+neoformans+CAP59+%28or+Cap59p%29+Is+Involved+in+the+Extracellular+Trafficking+of+Capsular+Glucuronoxylomannan%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Cryptococcus neoformans CAP59 (or Cap59p) Is Involved in the Extracellular Trafficking of Capsular Glucuronoxylomannan.</a> Eukaryot Cell. 3 (2), 385-392 (2004).</li>
<li>Guimarães, A. J., Frases, S., Cordero, R. J. B., Nimrichter, L., Casadevall, A., Nosanchuk, J. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2891871/">Cryptococcus neoformans responds to mannitol by increasing capsule size in vitro and in vivo: Mannitol impacts the structure of C. neoformans capsule.</a> Cell Microbiol. 12 (6), 740-753 (2010).</li>
<li>Zaragoza, O., Fries, B. C., Casadevall, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC219591/">Induction of Capsule Growth in Cryptococcus neoformans by Mammalian Serum and CO2.</a> Infect and Immun. 71 (11), 6155-6164 (2003).</li>
<li>Rossi, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Resistance+to+Fluconazole+on+Virulence+and+Morphological+Aspects+of+Cryptococcus+neoformans+and+Cryptococcus+gattii+Isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Impact of Resistance to Fluconazole on Virulence and Morphological Aspects of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii Isolates.</a> Front Microbiol. 7, (2016).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

该技术的关键步骤是制备印度墨水玻片和获取显微镜图像。尽管该算法已成功应用于多种玻片和成像技术，本文所述为推荐的实验方案。多糖荚膜的检测基于印度墨水颗粒无法进入荚膜区域的原理，因为这些颗粒过大，无法穿透多糖纤维网络。印度墨水被排除后，在深色背景上形成明亮的环状区域。算法通过检测环状结构与其背景之间的对比度来识别圆形。因此，较浓的印度墨水染色可提高多糖荚膜与背景之间的对比度，从而提升信噪比，改善结果质量。相反，细胞本体则表现为明亮背景上的暗色圆形。细胞本体的形态会因显微镜焦平面的设置不同而变化，在细胞顶部或底部时呈现为弥散的灰色圆形，而在中心位置时则表现为致密的暗带。基于上述相同原因，图像采集时应选择细胞本体呈现为致密暗带的焦平面，以获得最准确的圆形检测结果。
本文所报道的方法经过了多次修改和故障排查。该算法最初编写时，基于所使用的显微镜，预期细胞大小不会小于4像素或大于60像素。为了将该算法的应用扩展到不同的放大倍数和细胞尺寸，这些固定限制已被本方案中描述的用户输入字段所取代。用户现在可以针对每个实验输入特定参数，以实现最高准确性。如果将该算法应用于Cryptococcus<...

Cryptococcus neoformans 是一种在全球范围内普遍存在的致病性酵母菌，主要在免疫功能低下的人群中引发人类疾病。C. neoformans 尤其是撒哈拉以南非洲地区因感染性疾病导致年度死亡的重要病因之一1。隐球菌感染的主要临床表现为脑膜脑炎，其发生机制为受感染的巨噬细胞以“特洛伊木马”方式携带病原体侵入中枢神经系统，或病原体直接穿越血脑屏障。C. neoformans 表达多种毒力因子，包括在人体体温下复制的能力、脲酶活性、黑色素形成以及多糖荚膜的生成2。该多糖荚膜由重复的葡醛甘露聚糖（glucuronoxylomannan）和葡醛甘露聚半乳糖（glucoronoxylomannangalactan）聚合物组成，可作为保护性屏障，抵御环境应激和宿主免疫应答等因素的攻击2。
尽管隐球菌多糖荚膜的大小与毒力之间的关联并不一致，但已有证据表明荚膜大小是致病过程中的一个影响因素2,3,4,5,6,7。荚膜大小与脑膜炎病理相关6，可影响巨噬细胞控制隐球菌（Cryptococcus）感染的能力5，若缺失则可能导致毒力丧失8。因此，在隐球菌研究中，荚膜大小的测量十分常见，但目前该领域尚无统一的荚膜测量方法标准。
目前，C. neoformans 多糖荚膜的测量依赖于对显微镜图像进行人工测量，而不同实验室在图像获取和测量方法上存在差异9,10,11。该方法的一个直接问题是，某些研究需要获取数千个单独的测量数据，这使得保持准确性和可靠性变得困难。此外，即使结果已发表，测量方法的描述也常常不够充分。许多出版物并未说明其测量是如何获得的、使用了哪个焦平面、如何确定荚膜识别的阈值、采用的是半径还是直径、是单次测量还是多次测量取平均值，或其他细节。一些出版物仅说明所使用的程序，例如&#34;使用 Adobe Photoshop CS3 测量细胞&#34;11。这种缺乏标准化和详细报告的情况可能导致实验难以甚至无法重复。人眼视力、计算机亮度、显微镜设置、载玻片照明以及其他因素不仅在不同个体之间存在差异，也在不同样本之间变化，而基于像素强度值比率的计算则可在样本间保持恒定和适用。本技术的开发旨在为此前尚无标准方法的领域提供一种标准化、准确、快速且简便的荚膜尺寸测量方法。
如前所述，CHT 算法已有较长历史，此前已有用于自动检测圆形的脚本。本方法在两个方面优于其他脚本。首先，仅检测圆形并不足够，因为隐球菌细胞需要检测两个相互关联的同心圆结构。本方法可特异性识别荚膜内的细胞本体，区分两者，并仅对相关的细胞本体-荚膜配对进行计算。其次，即使遵循相同实验方案，不同研究人员获得的图像仍可能存在差异。通过允许研究人员控制算法的每一个参数，该工具可针对多种图像采集方法进行调整，无需统一使用标准化的显微镜、物镜、滤光片等设备。
该技术可广泛应用于研究者需要在图像中检测与背景形成对比的圆形物体的任何情况。无论是比背景亮还是比背景暗的圆形，均可通过此技术进行检测、计数和测量。

<table><tbody><tr><td>印度墨水</td><td>Becton, Dickinson and Co.</td><td>261194</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost 显微镜载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-143</td><td>25x75x1</td></tr><tr><td>Fisherfinest 高级盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-B</td><td>22x22-1</td></tr><tr><td>Sally Hansen Hard as Nails Xtreme Wear 指甲油</td><td>Sally Hansen</td><td>N/A</td><td>109 不可见</td></tr><tr><td>SAB培养基</td><td>Sigma</td><td>S3306</td><td></td></tr><tr><td>新型隐球菌</td><td>ATCC</td><td>208821</td><td>H99 菌株</td></tr><tr><td>奥林巴斯 AX70 显微镜</td><td>Olympus</td><td>AX70TRF</td><td>已停用；明场显微镜</td></tr><tr><td>Qimaging Retiga 1300</td><td>Qimaging</td><td>N/A</td><td>已停用；显微镜相机附件</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>N/A</td><td>推荐使用最新版本</td></tr><tr><td>Python 编程语言</td><td>Python</td><td>N/A</td><td>版本2必要；推荐2.7</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>微软</td><td>N/A</td><td>推荐使用最新版本</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Sigma</td><td>P3813</td><td></td></tr></tbody></table>

cryptococcal 物种多糖荚膜和细胞体的自动测量

Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

该技术的目的是为大量多糖荚膜的测量提供一种一致、准确且可操作的流程。
首先，基于为每幅图像唯一计算的强度值生成阈值图像。然后，利用成熟的圆霍夫变换（Circle Hough Transformation, CHT）算法，根据物体与背景之间的对比度检测圆形。最后，根据中心坐标和半径大小将检测到的细胞荚膜与细胞体进行匹配，并将数据以易于管理的电子表格形式导出给用户。
该技术的优势虽然简单但意义重大。首先，由于这些计算由算法而非人工完成，准确性和可靠性均得到提高。无论分析多少样本，准确性和可靠性均不会下降。其次，该方法为隐球菌（Cryptococcus）研究领域建立了潜在的标准操作流程，取代了目前各实验室间荚膜测量方法不一的现状。第三，鉴于人工荚膜测量过程缓慢且单调，自动化技术可实现对大量酵母细胞的快速测量，从而促进高通量数据分析并获得更强大的统计学结果。
该技术的主要局限性源于算法的工作原理。首先，该算法仅能生成圆形。尽管隐球菌（Cryptococcus）细胞及其荚膜呈圆形形态，但此技术难以应用于非圆形物体的检测。其次，由于圆形的检测方式，霍夫圆变换（CHT）算法可能基于多个聚集圆形的外缘检测出巨大的伪圆形。然而，任何被包含在伪圆形内的错误识别的细胞结构均可被轻易识别并从最终数据集中剔除。
本技术旨在通过印度墨水明场显微镜法测量Cryptococcus物种的环状多糖荚膜；尽管该方法也可应用于其他基于对比度的环状物体测量。

首先使用明场显微镜结合相机对印度墨水染色的玻片进行显微成像，以获取图像（图1A）。为获得理想图像，应确保细胞分散且密度足够低，避免视野过于密集，同时使用足量染料以在细胞与背景之间形成良好对比。如实验方案所述，最佳图像所需的细胞数量会因样本、显微镜型号及所用物镜的不同而有所变化。关键要点包括：确保细胞不发生聚集或重叠，细胞的焦平面之间无明显差异，并且背景中可见明显的印度墨水染色（至少占视野的25%）。这些条件使算法能够通过计算平均像素强度值并加上标准差，为每幅图像确定一个独特的阈值。像素强度高于该阈值的被视为白色，低于该阈值的被视为黑色。由此生成的图像可清晰锐利地显示荚膜的边界（图1B）。算法据此获得一个具有强对比度的黑底白边圆形区域用于识别荚膜，而原始图像则提供一个白底黑边的圆形区域用于识别细胞本体。程序会生成一个代表性的检测圆可视化图（图1</...

该技术描述了一种用于测量多糖荚膜和菌体半径的自动化批量图像处理程序。尽管该程序最初是为Cryptococcus neoformans的荚膜测量而设计，但其自动化图像处理功能也可应用于其他基于对比度的圆形物体检测。

Cryptococcal 物种多糖荚膜和细胞体的自动测量

该技术的目的是为大量多糖荚膜的测量提供一种一致、准确且可操作的流程。

该技术的总体目标是实现繁琐的手动测量的自动化。该方法有助于回答隐球菌研究领域中的关键问题，例如荚膜或细胞体大小与不同毒力特征之间的关系。该技术的主要优势在于，能够在无疲劳状态下对大量样本进行分析。该技术的应用前景可拓展至隐球菌病的治疗，因为荚膜和细胞体大小是该病原体的重要特征。准备墨汁染色玻片时，首先用移液器吸取10 µL隐球菌样品滴加到载玻片上。任何圆形酵母菌株均可使用，但在本实验中仅使用了H99菌株。用移液器吸取2 µL印度墨水染液滴加到样品上，通过将移液器枪头压入样品并以圆形方式移动，使染液充分混匀，直至印度墨水均匀分布。将盖玻片的一侧边缘紧贴载玻片表面，固定左侧边缘，然后轻轻而均匀地将盖玻片的另一侧放下，覆盖在样品上。将载玻片在空气中干燥五分钟。然后，在盖玻片边缘涂上一层薄薄的指甲油，以形成密封并保存印度墨水染色样本。成像时，将载玻片置于明场显微镜下，连接摄像头，并使用已知的像素与微米换算比例进行观察。调整滤光片、物镜和对比度，确保视野中隐球菌细胞分布密集但不过于拥挤，细胞荚膜与背景之间具有清晰的对比度，并且细胞体聚焦良好，呈现为一条深色条带。拍摄图像后，将它们保存到一个单独的目录中，并使用清晰的文件名命名，因为测量算法将在该目录下的所有图像上运行，输出数据将根据图像文件的名称进行组织。按照文本方案中的说明完成算法设置后，通过双击 QCA.py 来运行程序。按照程序中列出的步骤，输入图像文件的扩展名，扩展名前加一个句点，并用分号分隔。然后点击“Enter”按钮。通过点击“Select Directory”按钮选择图像文件所在的目录，并选中包含这些图像的文件夹。单击“生成图像列表”按钮，以生成目录中图像文件的列表。图像将显示在右侧的文本框中。请检查并确保列表准确且完整。接下来，单击“选择随机图像”按钮，从列表中选择一幅随机图像作为预览。然后输入显微镜物镜和像素合并（binning）设置。如果默认设置与所使用的显微镜不匹配，请选择“自定义像素转换”，并输入图像文件的像素到微米的转换系数。选择后，点击“计算转换”按钮，并根据右侧文本框中的内容确认转换结果是否正确。为输入圆检测的算法参数，请输入外胶囊检测可识别的最小和最大半径，分别作为最小和最大胶囊半径的输入值；然后输入细胞体检测可识别的最小和最大半径，分别作为最小和最大细胞体半径的输入值。现在，移动胶囊和细胞体敏感度滑块，以调整算法的敏感度阈值。低敏感度会更严格，减少假阳性圆环的检测，但也可能导致真实圆环的检出数量减少。相反，高敏感度会提高检测率，但可能增加假阳性圆环的出现。最大化检测到的实体和囊状结构数量，并目视检查圆形轮廓是否拟合正确。检测到的囊内实体数量将显示在右侧的文本框中。否则，请调整算法参数，直至结果准确为止。单击“开始分析”按钮，对整个图像文件目录运行检测算法。程序将逐一分析每张图像，并在所有图像分析完成后，在右侧文本框中显示“完成”。然后，单击“匹配与清理”按钮。这将把检测到的细胞体与它们所在的检测胶囊进行匹配，并通过从胶囊中减去细胞体来计算真实的胶囊半径。在图像目录中，找到 CleanedOutput.csv 文件中的已完成数据。如果仅选择了一组数据，文件将被命名为 CleanedBodies.csv 或 CleanedCapsules.csv。如本张印度墨水染色玻片的显微图像所示，细胞彼此分离，且密度足够低，不会过度占据视野。已使用足量的染色剂以在细胞与背景之间形成对比。该算法通过计算平均强度值并加上标准差，为每幅图像确定一个独特的阈值。强度高于阈值的像素被视为白色，强度低于阈值的像素被视为黑色。细胞体必须在胶囊的白色背景上呈现为一个浓黑、饱满的圆形。最佳的焦平面是细胞体显示为一条深色、集中的带状区域。该焦平面可作为标准，因为它能正确聚焦细胞。通过使用UVITEX对细胞壁进行可视化观察可以确认这一点，UVITEX是一种染料，能够清晰地呈现出轮廓分明、聚焦良好的细胞壁，而细胞中心区域信号较弱。当严格按照实验方案操作并获得理想图像时，该算法具有较高的准确性和可靠性。然而，如果实验操作不当，或由于染色不佳、细胞过度密集或其他前述参数导致图像质量不理想，则算法的准确性会下降，无法重现人工测量的结果。一旦掌握，该技术若操作得当，大约可在 10 分钟内完成。在尝试该操作时，重要的是要提前熟悉如何获取最佳图像，以便在处理真实样品时能够从容应对。该技术建立后，为隐球菌研究领域的科研人员探索荚膜和细胞体大小提供了可能，只要在成像系统中能够清晰分辨两者，即可进行相关研究。观看本视频后，您应该能够充分理解如何测量隐球菌的荚膜和细胞体。请务必注意，操作隐球菌可能具有极高的危险性，因此在进行该实验时，必须始终采取基本的生物安全二级（BSL2）防护措施。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

自动测量隐球菌种多糖胶囊和细胞体

本视频演示了一种调理-黏附试验，用于研究经调理的细菌与免疫细胞之间的相互作用。将用含抗荚膜抗体的待测血清处理过的荧光标记细菌与巨噬细胞共同孵育。在对巨噬细胞进行荧光染色后，通过显微镜观察附着在巨噬细胞表面的细菌，以实现可视化检测。...

一种用于评估抗荚膜抗体对荚膜细菌调理作用的调理-黏附检测法

本文展示了如何利用图像细胞计量技术对与培养中宿主细胞相关的致病性真菌进行定量分析。该技术可作为菌落形成单位（CFU）计数的替代方法。...

使用图像流式细胞术定量与宿主细胞相关的致病性真菌

在此，我们介绍一种表型检测方法，适用于小干扰合成RNA（siRNA）、化学化合物的高通量/高内涵筛选 结核分枝杆菌 突变文库。该方法依赖于荧光标记的检测 结核分枝杆菌...

一种用于高通量/高内涵筛选的细胞内分枝杆菌定量显微表型检测方法

我们提出一种自动化、模块化的高通量方法，用于小规模微生物胞外多糖的鉴定与表征。该方法结合快速初筛以分析分泌多糖的总量，以及详细的碳水化合物指纹图谱分析，从而实现对新分离细菌菌株或完整菌株库的快速筛选。...

自动化模块化高通量胞外多糖筛选平台结合高灵敏度碳水化合物指纹图谱分析

荚膜多糖是新型隐球菌（Cryptococcus...

大小很重要：Cryptococcus neoformans 荚膜直径的测量

我们展示了利用不连续密度梯度根据细菌荚膜产生情况分离细菌群体的方法。该方法可用于比较不同培养物之间的荚膜含量、分离具有特定荚膜表型的突变株，或鉴定荚膜调控因子。本文描述了该检测方法的优化及操作流程。...

利用不连续密度梯度按荚膜含量分离细菌

本文详细介绍了一种制备隐球菌细胞与阿米巴原虫共培养体系的实验方案，该体系通过静态荧光图像和高分辨率透射电子显微镜图像进行研究。文中展示了定量数据如何补充此类定性信息。...

显微技术与荧光读取在研究中的互补应用 隐球菌-阿米巴相互作用

本方案旨在对数百个微生物细胞实现原子力显微镜（AFM）测量的自动化。首先，将微生物固定在PDMS印章微结构中，随后对数百个固定的细胞自动进行力谱测量。...

对数百个C. albicans细胞进行生物原子力显微镜测量的自动化

我们提出了一种用于鉴定和定量酿酒酵母（Saccharomyces...

使用液相色谱串联质谱法对Saccharomyces cerevisiae进行定量代谢组学分析

单颗粒冷冻电子显微镜技术需要合适的软件包和用户友好的流程，以实现高通量的自动数据采集。本文介绍了完全自动化的图像采集软件包Latitude-S及其在低剂量条件下收集玻璃态生物大分子数据的实际操作流程。...

适用于单颗粒冷冻电镜的用户友好、高通量、全自动数据采集软件

此处使用裂殖酵母作为异源宿主，表达与GFP构成融合蛋白的细菌细胞骨架蛋白（如FtsZ和MreB），以观察其聚合行为。同时，通过荧光显微镜成像鉴定影响这些蛋白聚合的化合物。...

以裂殖酵母作为靶向细菌细胞骨架蛋白的抗菌药物筛选平台

了解如何使用自动化图像处理算法测量Cryptococcus neoformans的多糖胶囊和细胞体半径。该方法通过印度墨汁染色和明场显微镜实现高通量分析，显著提高研究效率并减少人工测量疲劳。

Cryptococcal 物种多糖荚膜和细胞体的自动测量

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