Cryptococcal 物种多糖荚膜和细胞体的自动测量

该技术的总体目标是实现繁琐的手动测量的自动化。该方法有助于回答隐球菌研究领域中的关键问题，例如荚膜或细胞体大小与不同毒力特征之间的关系。该技术的主要优势在于，能够在无疲劳状态下对大量样本进行分析。

该技术的应用前景可拓展至隐球菌病的治疗，因为荚膜和细胞体大小是该病原体的重要特征。准备墨汁染色玻片时，首先用移液器吸取10 µL隐球菌样品滴加到载玻片上。任何圆形酵母菌株均可使用，但在本实验中仅使用了H99菌株。

用移液器吸取2 µL印度墨水染液滴加到样品上，通过将移液器枪头压入样品并以圆形方式移动，使染液充分混匀，直至印度墨水均匀分布。将盖玻片的一侧边缘紧贴载玻片表面，固定左侧边缘，然后轻轻而均匀地将盖玻片的另一侧放下，覆盖在样品上。

将载玻片在空气中干燥五分钟。然后，在盖玻片边缘涂上一层薄薄的指甲油，以形成密封并保存印度墨水染色样本。成像时，将载玻片置于明场显微镜下，连接摄像头，并使用已知的像素与微米换算比例进行观察。

调整滤光片、物镜和对比度，确保视野中隐球菌细胞分布密集但不过于拥挤，细胞荚膜与背景之间具有清晰的对比度，并且细胞体聚焦良好，呈现为一条深色条带。拍摄图像后，将它们保存到一个单独的目录中，并使用清晰的文件名命名，因为测量算法将在该目录下的所有图像上运行，输出数据将根据图像文件的名称进行组织。按照文本方案中的说明完成算法设置后，通过双击 QCA.py 来运行程序。

按照程序中列出的步骤，输入图像文件的扩展名，扩展名前加一个句点，并用分号分隔。然后点击“Enter”按钮。通过点击“Select Directory”按钮选择图像文件所在的目录，并选中包含这些图像的文件夹。

单击“生成图像列表”按钮，以生成目录中图像文件的列表。图像将显示在右侧的文本框中。请检查并确保列表准确且完整。

接下来，单击“选择随机图像”按钮，从列表中选择一幅随机图像作为预览。然后输入显微镜物镜和像素合并（binning）设置。如果默认设置与所使用的显微镜不匹配，请选择“自定义像素转换”，并输入图像文件的像素到微米的转换系数。

选择后，点击“计算转换”按钮，并根据右侧文本框中的内容确认转换结果是否正确。为输入圆检测的算法参数，请输入外胶囊检测可识别的最小和最大半径，分别作为最小和最大胶囊半径的输入值；然后输入细胞体检测可识别的最小和最大半径，分别作为最小和最大细胞体半径的输入值。

现在，移动胶囊和细胞体敏感度滑块，以调整算法的敏感度阈值。低敏感度会更严格，减少假阳性圆环的检测，但也可能导致真实圆环的检出数量减少。相反，高敏感度会提高检测率，但可能增加假阳性圆环的出现。

最大化检测到的实体和囊状结构数量，并目视检查圆形轮廓是否拟合正确。检测到的囊内实体数量将显示在右侧的文本框中。否则，请调整算法参数，直至结果准确为止。

单击“开始分析”按钮，对整个图像文件目录运行检测算法。程序将逐一分析每张图像，并在所有图像分析完成后，在右侧文本框中显示“完成”。然后，单击“匹配与清理”按钮。

这将把检测到的细胞体与它们所在的检测胶囊进行匹配，并通过从胶囊中减去细胞体来计算真实的胶囊半径。在图像目录中，找到 CleanedOutput.csv 文件中的已完成数据。

如果仅选择了一组数据，文件将被命名为 CleanedBodies.csv 或 CleanedCapsules.csv。如本张印度墨水染色玻片的显微图像所示，细胞彼此分离，且密度足够低，不会过度占据视野。

已使用足量的染色剂以在细胞与背景之间形成对比。该算法通过计算平均强度值并加上标准差，为每幅图像确定一个独特的阈值。强度高于阈值的像素被视为白色，强度低于阈值的像素被视为黑色。

细胞体必须在胶囊的白色背景上呈现为一个浓黑、饱满的圆形。最佳的焦平面是细胞体显示为一条深色、集中的带状区域。该焦平面可作为标准，因为它能正确聚焦细胞。

通过使用UVITEX对细胞壁进行可视化观察可以确认这一点，UVITEX是一种染料，能够清晰地呈现出轮廓分明、聚焦良好的细胞壁，而细胞中心区域信号较弱。当严格按照实验方案操作并获得理想图像时，该算法具有较高的准确性和可靠性。然而，如果实验操作不当，或由于染色不佳、细胞过度密集或其他前述参数导致图像质量不理想，则算法的准确性会下降，无法重现人工测量的结果。

一旦掌握，该技术若操作得当，大约可在 10 分钟内完成。在尝试该操作时，重要的是要提前熟悉如何获取最佳图像，以便在处理真实样品时能够从容应对。该技术建立后，为隐球菌研究领域的科研人员探索荚膜和细胞体大小提供了可能，只要在成像系统中能够清晰分辨两者，即可进行相关研究。

观看本视频后，您应该能够充分理解如何测量隐球菌的荚膜和细胞体。请务必注意，操作隐球菌可能具有极高的危险性，因此在进行该实验时，必须始终采取基本的生物安全二级（BSL2）防护措施。