Name: 人肠道 Organoids 上皮屏障通透性的实时测量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: 学习使用人肠道类器官实时测量上皮屏障通透性的方法。通过FITC-葡聚糖微注射和活细胞成像技术，可视化并量化药物处理对肠道屏障功能的影响，为胃肠病学研究提供可靠工具。

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作者谨此感谢 Stephanie Spohn 博士和 Basel Abuaita 博士在类器官显微注射方面提供的诸多有益讨论。JRS 由肠道干细胞联盟（Intestinal Stem Cell Consortium，U01DK103141）资助，该项目由美国国家糖尿病、消化与肾脏疾病研究所（NIDDK）和美国国家过敏与传染病研究所（NIAID）共同资助。JRS 和 VBY 由美国国家过敏与传染病研究所（NIAID）资助的肠道疾病新型替代模型系统联盟（Novel, Alternative Model Systems for Enteric Diseases, NAMSED，U19AI116482）提供支持。DRH 获得美国国家过敏与传染病研究所（NIAID, T32AI007528）资助的微生物致病机制培训项目以及密歇根临床与健康研究所（Michigan Institute for Clinical and Health Research）获得的临床与转化科学奖（UL1TR000433）的支持。
本研究中使用的完整数据文件和数据分析代码可在 https://github.com/hilldr/HIO_microinjection 获取。

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作者声明无竞争性财务利益或其他利益冲突。

本方案建立了一种通用方法，用于对人多能干细胞（hPSC）来源的类肠体（HIOs）以及组织来源的肠道类器官进行显微注射，并实时测量上皮屏障通透性。我们还展示了如何分析和解读采用这些方法所获得的数据。鉴于肠道类器官模型系统日益广泛的应用16,20,21,28，以及长期以来对肠道屏障通透性作为生理相关功能性指标的研究兴趣3,4,5,6，我们预计本领域的其他研究人员将能够应用并在此方法基础上进一步拓展研究。
该技术的应用中有若干关键步骤。在进行大量显微注射实验之前，应确保能够获得高质量的源自人多能干细胞（hPSC）或组织的类器官（HIO）组织。尽管采用既定方法生成的HIO在组织身份和细胞形态上具有高度可重复性，但其宏观结构可能存在异质性，表现为大小和形状的差异24。理想的用于显微注射及实时腔内荧光检测的HIO应呈球形，具有单一半透明腔室，直径约为1 mm。在某些情况下，显微注射可能失败，导致HIO塌陷或注入物质明显泄漏。用户可根据需要使用标准微量移液器将失败的HIO从培养孔中移除。在选择用于显微注射和成像的HIO时，需考虑成像平台所配备的物镜。通常，2–4X物镜最适合完整捕获HIO的荧光信号；但如果低倍物镜不可用，或所用HIO直径&#60;1 mm，则可使用10X物镜。成像软件必须支持在设定的时间点自动采集荧光图像。
为了满足实验需求，本方案有多种可能的修改方式。例如，屏障功能检测的结果可能取决于所用化合物的分子大小43，因此可考虑测试不同分子量的葡聚糖制剂。此外，除荧光成像外，还可进行明场成像，以评估组织的整体结构完整性25。在进行活菌显微注射时25,28,31,32,33,44，可能需要在显微注射前或注射后向HIO培养基中添加青霉素和链霉素或庆大霉素。显微毛细管外壁在填充细菌培养悬液时会被污染，这可能导致污染物转移至HIO培养基中。另一种方法是将HIO悬浮于细胞外基质（例如Matrigel）中且不加培养基的情况下进行显微注射，并在注射完成后添加培养基。此方法可将污染限制于细胞外基质及HIO的外部表面。在设计微生物生长实验时，可能需要在显微注射后1 - 2&#160;h内去除培养基中的抗生素，以避免抑制或阻碍显微注射微生物的生长。
最后，需要认识到并非所有研究人员都能获得适用于体外成像的显微镜设备，因此有必要指出，本实验方案中所述的荧光数据采集步骤也可应用于使用标准落射荧光显微镜在固定时间点拍摄的图像，无需自动图像采集或环境控制装置。此类方法的实例可见于 Leslie 和 Huang 等25 的研究，他们检测了人多能干细胞（hPSC）来源的肠类器官中C. difficile毒素的活性；以及 Karve 和 Pradan 等44 的研究，他们通过显微注射将活的E. coli注入类似的hPSC来源肠类器官，并检测了上皮屏障通透性。手动操作成像设备可能导致荧光信号的变异增大且标准化困难。在对注射了FITC-葡聚糖的HIOs进行手动成像时，必须在整个实验过程中保持固定的放大倍数、荧光激发强度和曝光时间，以避免荧光强度测量值发生失真。

肠上皮形成一种选择性屏障，介导营养物质、H2O₂、离子和代谢废物，同时尽量减少管腔与间质组织或血液供应之间通过非特异性扩散介导的其他颗粒的交换1,2肠道上皮屏障的非特异性通透性长期以来一直被视为健康和疾病状态下的一项关键功能参数。3,4,5,6，反映了小分子通过上皮细胞旁路间隙的扩散速率。上皮屏障通透性的测定可在动物模型中进行7 以及在人类患者中8 通过摄入乳果糖（乳果糖在胃肠道中无特异性转运体），随后采集并测定外周血中乳果糖的浓度。其他可用于评估屏障功能的摄入型标志物，如荧光标记的碳水化合物，也可使用。9,10该方法已针对在Transwell支持物上培养的肠上皮细胞模型进行了优化11，一种简化的研究方法，虽能提高实验控制性，但因其对……的预测能力较差而受到批评 体内 由于缺乏分化的上皮亚型和组织结构而导致通透性12使用腔室代表了另一种方法，可实现对完整肠黏膜上皮屏障功能的测定 离体13该技术的应用常因组织的可获得性及状态而受限13,14因此，有必要开发新的方法，以在可重复性、通量与生理相关性之间取得平衡。
近期进展 体外 器官发生研究已促使三维组织培养模型系统被采纳为一种复杂组织动态重建的先进平台15,16,17,18,19,20,21,22,23特别是由人多能干细胞（hPSC）衍生的人肠类器官（HIOs）19,24 已成为研究宿主-微生物相互作用和上皮屏障动态的可重复且实验上易于操作的模型系统25,26,27,28类似地，来源于人体组织的类器官（也称为肠类器官）可通过简单的活检手术获取，并可作为研究人体生理学和疾病的可操作体系。15,29,30人类肠道类器官的显微注射可实现实验化合物的递送25 或活的微生物25,31,32,33 类器官腔内顶端上皮表面。Leslie 和 Huang 等25 最近采用该技术，在暴露于细菌毒素后，通过向人肠道类器官（HIOs）显微注射荧光素异硫氰酸酯（FITC）标记的葡聚糖来测量屏障通透性。
本方案旨在为利用荧光显微镜检测人多能干细胞（hPSC）来源的类肠器官（HIOs）及组织来源的类肠器官（HIOs）上皮屏障通透性提供操作指南。经过少量修改后，本方案也可作为向HIOs显微注射实验化合物的基本操作参考。用户可在显微注射后，结合本方案补充其他或替代性的下游应用。

<table><tbody><tr><td>EGTA 0.5 M 无菌溶液（pH 8.0）</td><td>Bioworld</td><td>405200081</td><td></td></tr><tr><td>细胞外基质溶液（Matrigel）</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Deltavision RT 活细胞成像系统</td><td>GE Life Sciences</td><td>29065728</td><td>http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences/brands/deltavision/</td></tr><tr><td>相机</td><td>GE Life Sciences</td><td>29065728</td><td>包含于 Deltavision 系统中</td></tr><tr><td>softWoRx 成像软件</td><td>GE Life Sciences</td><td>29065728</td><td>包含于 Deltavision 系统中</td></tr><tr><td>生物安全柜</td><td>Labconco</td><td>Cell Logic+</td><td>http://www.labconco.com/product/purifier-cell-logic-class-ii-type-a2-biosafety-cabinets-2/4262</td></tr><tr><td>1× PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>高级 DMEM-F12 培养基</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td><td>ENR 培养基组分；参见 McCraken 等人 &lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;24&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>B27 补充剂（50×）</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td>ENR 培养基组分；参见 McCraken 等人 &lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;24&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺（100×）</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>ENR 培养基组分；参见 McCraken 等人 &lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;24&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>HEPES 缓冲液</td><td>Life Technologies</td><td>15630080</td><td>ENR 培养基组分；参见 McCraken 等人 &lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;24&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>显微操作器</td><td>Narshge</td><td>UM-3C</td><td></td></tr><tr><td>微操纵器</td><td>Narshge</td><td>UM-1PF</td><td></td></tr><tr><td>移液管架</td><td>Narshge</td><td>UP-1</td><td>可替代 Xenoworks 移液管架</td></tr><tr><td>磁力支架</td><td>Narshge</td><td>GJ-1</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Olympus</td><td>SX61</td><td>推荐型号，其他型号也可能兼容</td></tr><tr><td>Olympus IX71 荧光显微镜</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td>包含于 Deltavision 系统中</td></tr><tr><td>CoolSNAP HQ2 相机</td><td>Photometrics</td><td>29065728</td><td>包含于 Deltavision 系统中</td></tr><tr><td>重组 &lt;em&gt;C. difficile&lt;/em&gt; 毒素 A/TcdA 蛋白</td><td>R&amp;D Systems</td><td>8619-GT-020</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>R&amp;D Systems</td><td>236-EG</td><td>ENR 培养基组分；参见 McCraken 等人 &lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;24&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>R-spondin 1</td><td>R&amp;D Systems</td><td>4645-RS</td><td>ENR 培养基组分；参见 McCraken 等人 &lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;24&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Noggin</td><td>R&amp;D Systems</td><td>6057-NG</td><td>ENR 培养基组分；参见 McCraken 等人 &lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;24&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>矿物油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>FITC-葡聚糖（4 kDa）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46944</td><td></td></tr><tr><td>微电极拉制仪</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-30</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II 培养皿载玻片</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>154526PK</td><td></td></tr><tr><td>玻璃毛细管丝</td><td>WPI</td><td>TW100F-4</td><td></td></tr><tr><td>微移液管架</td><td>Xenoworks</td><td>BR-MH2</td><td>首选设备</td></tr><tr><td>模拟管路套件</td><td>Xenoworks</td><td>BR-AT</td><td></td></tr><tr><td>1/16 英寸透明卡环</td><td>Xenoworks</td><td>V001104</td><td></td></tr><tr><td>1-1.2 mm O 型圈</td><td>Xenoworks</td><td>V300450</td><td></td></tr></tbody></table>

人肠道类器官上皮屏障通透性的实时测量

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

通过活检获取的肠道组织或由多能干细胞经定向分化生成的肠道组织，其三维培养技术的进展已带来复杂的 体外 肠道黏膜模型。利用这些新兴的模型系统需要对原本为二维培养系统和动物模型开发的工具与技术进行适应性调整。本文介绍了一种实时测量人肠道类器官上皮屏障通透性的技术。该技术通过显微注射荧光标记的葡聚糖，并在配备落射荧光滤光片的倒置显微镜下进行成像来实现。对肠道类器官屏障通透性进行实时测量，有助于在人肠道上皮组织中获得高分辨率的时间序列数据，尽管该技术也可应用于固定时间点的成像分析。本方案可轻松适用于检测药物制剂、细菌产物或毒素，以及活体微生物处理后上皮屏障通透性的变化。经过少量修改后，本方案也可作为肠道类器官显微注射的基本操作指南，使用者可根据需要在显微注射后结合其他或替代性的下游应用。

HIOs 由人多能干细胞分化而来，并在细胞外基质溶液中进行培养，方法如前所述19,24培养4周后，HIOs已充分扩张，可进行显微注射。将HIOs显微注射含有4 kDa FITC标记的葡聚糖的PBS溶液，或仅含PBS的溶液 艰难梭菌 毒素 TcdA C. difficile 是一种机会性胃肠道病原体，可在人肠道类器官（HIOs）中表现出毒素介导的上皮细胞毒性25作为阳性对照，在部分注射了PBS和FITC-葡聚糖的HIO类器官中，向培养基中添加EGTA。EGTA是一种钙螯合剂，可引起肌动蛋白细胞骨架迅速去聚合。42在受控环境培养箱内的活细胞成像显微镜下实时监测FITC荧光，并以10分钟为间隔采集图像。
对成像数据的事后分析揭示了FITC荧光保留率存在显著差异（图5）。注射PBS的HIOs在t = 0时几乎保留了全部荧光信号，而同时注射TcdA或经EGTA处理的HIOs在显微注射后8小时荧光强度显著降低（图5A）。对所有HIOs在所有时间点的成像数据进行量化，生成了一个高分辨率数据集，用以表示每种实验条件下荧光强度随时间的相对变化（图5B）。通过计算每组处理的FITC平均消除时间（t1/2 ）并使用Student's t-检验比较各组间t1/2的差异，评估上皮通透性的变化（表1）。对照处理的HIOs在超过16小时内保留了大部分FITC荧光信号（t1/2 = 17 ± 0.3 h）。EGTA处理显著缩短了FITC-葡聚糖的消除时间，相较于对照HIOs（t1/2 = 2.6 ± 0.2 h；P = 1.3 × 10-8）。与先前发表的结果一致25，显微注射TcdA显著增加了上皮屏障通透性，相较于对照处理（t1/2 = 7.6 ± 0.6 h；P = 5.4 × 10-4）。因此，外部施加（EGTA）和显微注射（TcdA）的化合物均能引起HIOs中上皮屏障通透性的显著改变。这些结果表明，多种药物制剂、代谢物、细菌产物、细胞因子、生长因子及其他化合物对上皮屏障功能的影响均可通过该方法进行评估。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>处理</td>
			<td>半衰期 (h)</td>
			<td>标准误 (h)</td>
			<td>95% 置信区间下限 (h)</td>
			<td>95% 置信区间上限 (h)</td>
			<td>n</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>对照</td>
			<td>17.11</td>
			<td>0.3</td>
			<td>16.45</td>
			<td>17.78</td>
			<td>11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>2.58</td>
			<td>0.19</td>
			<td>1.78</td>
			<td>3.38</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TcdA</td>
			<td>7.56</td>
			<td>0.63</td>
			<td>5.93</td>
			<td>9.18</td>
			<td>6</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：经EGTA或TcdA处理的HIO中FITC-葡聚糖的平均消除时间（t1/2）。单位为显微注射后的小时数。
<img alt="显微操作装置，包括显微镜、显微注射仪和矿物油注射器；细胞注射研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 1"> 
图1：用于人肠道类器官（HIO）显微注射的显微注射仪与显微操作器的基本布局。 本图展示了进行HIO显微注射所用的全套设备。关键组件已标注，相关订购信息见材料表。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于精确制造微电极的电极拉制仪装置示意图，包含机械调节部件。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：微电极拉制仪。 铜制加热线圈 hc、上夹具 c1、下夹具（c2）、拉制臂（pa）和加热选择拨动开关（ht）由箭头标示。HEAT 1 和 PULL 的正确设置值以红色文字标出。插图显示了正确安装的玻璃丝，已准备加热。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="类胚体形成、微量移液转移（A）和显微图像（B），比例尺为 100 μm。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：注射了FITC-葡聚糖的组织来源人肠道类器官（HIO）的代表性图像。（A）显示玻璃微毛细管在插入HIO并进行显微注射前的定位图像。（B）显微注射FITC-葡聚糖后组织来源人肠道类器官的明场图像。请注意，即使不使用特定滤光片组，荧光信号依然清晰可见。这种显色有助于提高显微注射的精确性。3倍放大倍数 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="显微镜设置工作流程图；激发/发射、图像采集、TIFF 导出过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4：活体成像工作流程。（A）截图展示了设置显微镜参数、在载玻片上定位 HIO 以及保存每个待成像 HIO 对应载物台位置所需的步骤。（B）在 A 中指定的每个位置，以固定时间间隔采集 FITC 通道图像的成像前设置。（C）成像后将 DV 格式数据文件导出为 TIFF 图像，每个 HIO 在每个时间点对应一张 TIFF 图像。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="FITC-葡聚糖通透性实验结果；随时间变化的显微镜图像及强度图；EGTA，TcdA。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 5"> 
图5：代表性实验结果。（A）将2 mg/mL FITC-葡聚糖（4 kDa）显微注射入干细胞来源的人肠道类器官（HIO），并进行连续20小时成像。HIO同时接受PBS（对照）、艰难梭菌毒素TcdA（12.8 ng/µL）显微注射，或在外部培养基中添加2 mM EGTA处理。4倍放大。（B）PBS（对照）、TcdA或EGTA处理的HIO中，归一化FITC平均强度随时间变化的曲线图。误差条表示标准误（S.E.M.），n = 11个HIO（对照组），3个HIO（EGTA组），6个HIO（TcdA组）。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

本方案描述了在对人肠道类器官进行药物处理后，利用荧光显微镜和活细胞显微镜实时测量上皮屏障通透性的方法。

通过活检获取的肠道组织或由多能干细胞经定向分化生成的肠道组织，其三维培养技术的进展已导致……

本实验的总体目标是随时间测量人类肠道类器官中上皮屏障的通透性。该方法有助于解答胃肠病学领域的一些关键问题，例如特定毒素、细菌产物甚至药物治疗如何影响上皮屏障的通透性。该技术的主要优势在于，能够在实时条件下对人类肠道上皮组织的屏障通透性进行可视化观察和定量测定。在对人肠道类器官进行显微注射之前，必须按照文本方案中的描述设置显微注射仪，并准备、安装和测试显微毛细管。为将注射材料充入微毛细管，需将玻璃微毛细管的尖端浸入FITC-葡聚糖注射悬液中，注意避免微毛细管尖端触碰管壁或管底而折断。回抽矿物油注射器，将约10 µL的FITC-葡聚糖悬液吸入微毛细管中。当显微注射液填充至玻璃毛细管长度的90%时，停止填充毛细管。在将毛细管从显微注射溶液中取出前，轻微下压注射器，以确保毛细管尖端不残留气泡。从细胞培养孵箱中取出人肠道类器官培养板，转移至配备显微注射仪的生物安全柜中。取下培养板的盖子，将第一个孔置于显微镜载物台中央，使其在最低放大倍数下通过目镜清晰可见。调节显微操作臂，使微毛细管以相对于显微镜载物台大于45度的角度向下指向培养孔。将微毛细管的尖端定位在第一个培养孔上方，距培养基表面约一厘米处。通过目镜检查玻璃毛细管尖端和人肠道类器官是否均清晰可见。成功进行显微注射的关键是在尝试注射前仔细将微毛细管与类器官对齐。我始终建议新手用户在开展关键实验前，先利用备用组织进行练习。顺时针转动 z 轴控制旋钮，缓慢推进微毛细管。用微毛细管尖端刺穿人肠道类器官。当微毛细管开始施加压力时，人肠道类器官的外表面会轻微下陷，并在尖端穿透腔体时迅速恢复原状。如果难以观察到微毛细管尖端在腔内的位置，可调整体视显微镜的照明或放大倍数。当微毛细管正确放置，其尖端接近人肠道类器官腔中心时，将手从显微操作仪控制装置上移开。轻微按压装有矿物油的注射器，将显微注射液从微毛细管中推出，并注入人肠道类器官腔内。人肠道类器官可能会轻微膨胀以容纳注射体积。将微毛细管置于培养基上方，以避免操作过程中意外损伤人肠道类器官，随后移动至下一个目标人肠道类器官。在不同处理之间或发生破损时，更换微毛细管。松开显微操作臂末端的夹具，将微毛细管从微量移液器 holder 中取出。为了检测递送至顶端上皮的化合物，应将化合物重新悬浮于含有每毫升 2 毫克 FITC-葡聚糖的无菌 PBS 中。在此代表性实验中，将艰难梭菌毒素 TcdA 重新悬浮，并在显微注射前加入含有 FITC-葡聚糖的 PBS 中，使其终浓度为每微升 12.8 纳克。将化合物显微注射至人肠道类器官腔内，操作方法如前一节所示。若需检测递送至基底侧区室的化合物，在显微注射FITC-葡聚糖后，将外部培养基更换为含有2毫摩尔EGTA的新培养基作为阳性对照，仅含PBS溶剂的新培养基作为阴性对照，或其他实验化合物。显微注射后立即开始活体成像。此代表性明场图像显示了显微注射FITC-葡聚糖后来源于组织的人肠道类器官。即使不使用特定滤光片，荧光信号依然清晰可见。来源于干细胞的人肠道类器官被显微注射了溶于PBS的4千道尔顿FITC标记葡聚糖，或含有艰难梭菌毒素TcdA的PBS。作为阳性对照，在一部分注射了 PBS 和 FITC-葡聚糖的人类肠道类器官中，向培养基中添加 EGTA。对人类肠道类器官进行持续 20 小时的成像观察。如这些图像所示，注射 PBS 的人类肠道类器官几乎保留了 T 零时刻存在的全部荧光信号。然而，注射了 TcdA 或经 EGTA 处理的人肠道类器官在显微注射后八小时也表现出荧光强度显著下降。对所有时间点的所有人肠道类器官成像数据进行量化，以生成高分辨率数据集，反映每种实验条件下荧光强度随时间的相对变化。一旦掌握该技术，根据实验条件的数量，操作可在大约 30 分钟至一小时内完成。在进行该操作时，重要的是要记住保持耐心，在显微注射前将人肠道类器官与微毛细管对齐时需仔细操作。完成该步骤后，可进一步采用其他方法，如PCR、蛋白质印迹（western blot）和RNA测序（RNA seek），以回答有关人肠道类器官对注射物质反应的更多问题。该技术的建立使我们能够研究细菌毒素、药理学试剂、细胞因子甚至活的微生物对人肠道类器官上皮屏障功能的影响。观看本视频后，您应能够充分掌握如何将荧光标记的葡聚糖及其他实验材料显微注射至人肠道类器官腔内的操作方法。请注意，在处理细菌毒素或活体生物时，可能存在极高危险性，因此在进行该操作时，必须采取适当防护措施，例如穿戴合适的个人防护装备（PPE）。最后，需特别小心避免刺伤，因为显微毛细管极为锋利。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

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