人肠道 Organoids 上皮屏障通透性的实时测量
December 18th, 2017
本协议描述了在人体肠道 organoids 中采用荧光显微镜和活细胞显微镜进行药物治疗后 real-time 上皮屏障通透性的测量。
该程序的总体目标是测量人类肠道类器官中上皮屏障通透性随时间的变化。这种方法可以帮助回答胃肠病学领域的关键问题，例如特定毒素、细菌产物甚至药物治疗如何改变上皮屏障通透性。该技术的主要优点是它允许实时可视化和定量测量上皮屏障通透性，并使用人类肠道上皮组织。
在显微注射人肠道类器官之前，必须设置显微注射器，并按照文本方案中的说明准备、安装和测试微毛细管。要用注射材料填充微毛细管，请将玻璃微毛细管的尖端浸入 FITC-葡聚糖注射悬液中，小心避免将微毛细管的尖端压在管的侧面或底部。拉回矿物油注射器，将大约 10 微升 FITC-葡聚糖悬浮液吸入微毛细管。
当显微注射悬浮液填充玻璃微毛细管长度的 90% 时，停止填充微毛细管。在从显微注射溶液中取出微毛细管之前，轻轻压下注射器，以确保微毛细管的尖端不包含气袋。从细胞培养箱中取出人肠道类器官培养板，并使用显微注射器转移到生物安全柜中。
从培养板上取下盖子，将第一个孔置于显微镜载物台的中心，以便在最低放大倍率设置下通过示波器的目镜清晰可见。转动显微作器臂，使显微毛细管以相对于显微镜载物台大于 45 度的角度指向培养孔中。将微毛细管的尖端置于第一个培养孔上方约一厘米处，距离培养基表面约 1 厘米。
检查玻璃丝的尖端和人类肠道类器官是否都可以通过目镜看到。成功显微注射的关键是在尝试显微注射之前仔细地将微毛细管与类器官对齐。我总是建议新用户在尝试关键实验之前先用备用组织进行练习。
顺时针转动 z 轴控制旋钮，缓慢推进微毛细管。用微毛细管尖端刺穿人肠道类器官。当微毛细管开始施加压力时，人体肠道类器官的外表面会略微凹陷，当尖端穿透管腔时，外表面会弹回原状。
如果难以看到管腔内微毛细管的尖端，请调整解剖显微镜的照明或放大设置。当微毛细管的尖端正确定位在靠近人体肠道类器官中心的位置时，将手从显微作器控件上移开。轻轻按下装满矿物油的注射器，将显微注射溶液推出微毛细血管并进入人体肠道类器官腔。
人肠道类器官可能会略微膨胀以适应注射量。将微毛细管置于培养基上方，以避免在作过程中对人体肠道类器官造成意外损伤，移动到下一个人体肠道类器官靶标。在两次治疗之间或发生破损时，更换微毛细管。
松开显微作器臂末端的夹子，然后从微量移液器支架上取下显微毛细管。为了测试递送到顶端上皮的化合物，应将化合物重悬于含有 2 毫克/毫升 FITC-葡聚糖的无菌 PBS 中。在这个代表性实验中，重悬艰难梭菌毒素 TcdA，在显微注射前在含有 FITC-葡聚糖的 PBS 中加入 12.8 纳克/微升。
如上一节所示，将化合物显微注射到人肠道类器官腔中。为了测试输送到基底侧室的化合物，在显微注射 FITC-葡聚糖后，用含有两个毫摩尔 EGTA 作为阳性对照、单独 PBS 载体作为阴性对照或其他实验化合物的新培养基替换外部培养基。显微注射后立即开始实时成像。
该代表性明场图像显示了显微注射 FITC-葡聚糖后的组织来源的人肠道类器官。即使不使用特定的滤光片组，荧光信号也很明显。用悬浮在 PBS 中的 4 千道尔顿 FITC 偶联葡聚糖或含有艰难梭菌毒素 TcdA 的 PBS 显微注射干细胞来源的人肠道类器官。
作为阳性对照，将 EGTA 添加到注射 PBS 和 FITC-葡聚糖的人肠道类器官亚群中的人肠道类器官培养基中。对人类肠道类器官进行 20 小时的成像。如这些图像所示，注射 PBS 的人肠道类器官几乎保留了 T 零处存在的所有荧光信号。
然而，同样注射 TcdA 或用 EGTA 处理的人肠道类器官在显微注射后 8 小时表现出荧光强度显着降低。对所有时间点所有人类肠道类器官的成像数据进行量化，以生成一个高分辨率数据集，表示每种实验条件下荧光强度随时间的相对变化。一旦掌握，这项技术可以在大约 30 分钟到 1 小时内完成，具体取决于实验条件的数量。
在尝试此程序时，重要的是要记住要有耐心，并在显微注射前将人体肠道类器官与微毛细血管对齐时花点时间。在此程序之后，可以执行其他方法，如 PCR、western blot 和 RNA seek，以回答有关人肠道类器官对注射材料的反应的其他问题。这项技术的发展使我们能够检查细菌毒素、药物、细胞因子甚至活微生物对人类肠道类器官上皮屏障功能的影响。
观看此视频后，您应该对如何将荧光标记的葡聚糖和其他实验材料显微注射到人肠道类器官的腔中有了很好的了解。不要忘记，在处理细菌毒素或活生物体时，它可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如使用适当的 PPE。最后，要特别小心避免穿刺伤，因为微毛细血管非常锋利。
概览
本协议描述了一种在人类肠道类器官中实时测量上皮屏障通透性的方法。利用荧光和活细胞显微镜技术，该技术使研究人员能够可视化和量化药理学处理后通透性的变化。
关键研究组成部分
科学领域
- 胃肠病学
- 细胞生物学
- 显微镜技术
背景
- 上皮屏障完整性对于肠道健康至关重要。
- 破坏可能导致各种胃肠道疾病。
- 实时测量技术增强了对通透性变化的理解。
- 人类肠道类器官为研究上皮功能提供了相关模型。
研究目的
- 测量毒素和药理学处理对上皮屏障通透性的影响。
- 实时可视化通透性的变化。
- 为未来的胃肠病学研究建立可靠的方法。
使用的方法
- 将FITC-右旋糖酐微注射到人类肠道类器官中。
- 活体成像监测荧光信号随时间的变化。
- 定量分析荧光强度以评估通透性。
- 使用对照验证实验条件。
主要结果
- 人类肠道类器官在用PBS处理时保持荧光信号。
- TcdA和EGTA处理显著降低了荧光。
- 生成定量数据，显示相对的通透性变化。
- 该技术可以在30分钟到1小时内高效完成。
结论
- 该方法为研究上皮屏障功能提供了宝贵的工具。
- 实时成像增强了对通透性动态的理解。
- 未来的应用可能包括测试各种药理学药剂。
常见问题
Executive Industry Relevance
Real-time measurement of epithelial barrier permeability in human intestinal organoids enables high-resolution, quantitative assessment of barrier function in a human-relevant 3D system. This capability is critical for de-risking early discovery hypotheses around gut barrier modulation and for evaluating the impact of pharmacologic agents, toxins, or microbial products on epithelial integrity. The approach supports predictive confidence at the intersection of target validation and preclinical model selection for gastrointestinal drug discovery portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of epithelial barrier function in a physiologically relevant human model.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying barrier disruption in response to candidate agents or toxins.
- Facilitates functional target validation for pathways implicated in barrier integrity and disease.
- Provides quantitative data to inform go/no-go decisions in early-stage programs.
Screening & Assay Development
- Establishes a reproducible, quantitative assay for barrier permeability using live imaging and fluorescent tracers.
- Allows for standardized comparison of compound effects across multiple experimental conditions.
- Supports assay scalability and adaptation for screening pharmacologic or microbial modulators of barrier function.
- Enables robust evaluation of compound-induced changes in epithelial integrity.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant human tissue models for translational biomarker development.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling downstream molecular analyses post-microinjection.
- Reduces translational risk by modeling human-specific responses to candidate interventions.
- Supports risk-adjusted advancement of compounds targeting epithelial barrier pathways.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling functional assessment of barrier integrity in human organoids, supporting both target validation and lead evaluation workflows.
- Discovery Biology: Quantifies real-time changes in barrier permeability to clarify pathway involvement and biological mechanism.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs suitable for compound comparison and assay standardization.
- Analytics: Provides high-resolution temporal data on fluorescent tracer retention or loss, supporting statistical analysis of permeability changes.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models by leveraging human-derived organoids and enabling downstream molecular profiling.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible platform adaptable to diverse experimental questions and compound classes in gastrointestinal research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in barrier-targeted programs and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes permeability assessment with scalable, reproducible workflows.
- Strategic Value: Informs early go/no-go decisions and enhances capital efficiency by prioritizing validated targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of assets with demonstrated barrier-modulating activity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microinjection and live cell imaging of 3D organoid cultures.
- Demands access to inverted fluorescence microscopy and precise micromanipulation equipment.
- Necessitates cross-team standardization of injection and imaging protocols for reproducibility.
- Adaptable to both tissue-derived and stem cell-derived human intestinal organoids with minor protocol modifications.
- Careful handling and biosafety precautions are essential when working with toxins or live microorganisms.
