人肠道类器官上皮屏障通透性的实时测量

本实验的总体目标是随时间测量人类肠道类器官中上皮屏障的通透性。该方法有助于解答胃肠病学领域的一些关键问题，例如特定毒素、细菌产物甚至药物治疗如何影响上皮屏障的通透性。该技术的主要优势在于，能够在实时条件下对人类肠道上皮组织的屏障通透性进行可视化观察和定量测定。

在对人肠道类器官进行显微注射之前，必须按照文本方案中的描述设置显微注射仪，并准备、安装和测试显微毛细管。为将注射材料充入微毛细管，需将玻璃微毛细管的尖端浸入FITC-葡聚糖注射悬液中，注意避免微毛细管尖端触碰管壁或管底而折断。回抽矿物油注射器，将约10 µL的FITC-葡聚糖悬液吸入微毛细管中。

当显微注射液填充至玻璃毛细管长度的90%时，停止填充毛细管。在将毛细管从显微注射溶液中取出前，轻微下压注射器，以确保毛细管尖端不残留气泡。从细胞培养孵箱中取出人肠道类器官培养板，转移至配备显微注射仪的生物安全柜中。

取下培养板的盖子，将第一个孔置于显微镜载物台中央，使其在最低放大倍数下通过目镜清晰可见。调节显微操作臂，使微毛细管以相对于显微镜载物台大于45度的角度向下指向培养孔。将微毛细管的尖端定位在第一个培养孔上方，距培养基表面约一厘米处。

通过目镜检查玻璃毛细管尖端和人肠道类器官是否均清晰可见。成功进行显微注射的关键是在尝试注射前仔细将微毛细管与类器官对齐。我始终建议新手用户在开展关键实验前，先利用备用组织进行练习。

顺时针转动 z 轴控制旋钮，缓慢推进微毛细管。用微毛细管尖端刺穿人肠道类器官。当微毛细管开始施加压力时，人肠道类器官的外表面会轻微下陷，并在尖端穿透腔体时迅速恢复原状。

如果难以观察到微毛细管尖端在腔内的位置，可调整体视显微镜的照明或放大倍数。当微毛细管正确放置，其尖端接近人肠道类器官腔中心时，将手从显微操作仪控制装置上移开。轻微按压装有矿物油的注射器，将显微注射液从微毛细管中推出，并注入人肠道类器官腔内。

人肠道类器官可能会轻微膨胀以容纳注射体积。将微毛细管置于培养基上方，以避免操作过程中意外损伤人肠道类器官，随后移动至下一个目标人肠道类器官。在不同处理之间或发生破损时，更换微毛细管。

松开显微操作臂末端的夹具，将微毛细管从微量移液器 holder 中取出。为了检测递送至顶端上皮的化合物，应将化合物重新悬浮于含有每毫升 2 毫克 FITC-葡聚糖的无菌 PBS 中。在此代表性实验中，将艰难梭菌毒素 TcdA 重新悬浮，并在显微注射前加入含有 FITC-葡聚糖的 PBS 中，使其终浓度为每微升 12.8 纳克。

将化合物显微注射至人肠道类器官腔内，操作方法如前一节所示。若需检测递送至基底侧区室的化合物，在显微注射FITC-葡聚糖后，将外部培养基更换为含有2毫摩尔EGTA的新培养基作为阳性对照，仅含PBS溶剂的新培养基作为阴性对照，或其他实验化合物。显微注射后立即开始活体成像。

此代表性明场图像显示了显微注射FITC-葡聚糖后来源于组织的人肠道类器官。即使不使用特定滤光片，荧光信号依然清晰可见。来源于干细胞的人肠道类器官被显微注射了溶于PBS的4千道尔顿FITC标记葡聚糖，或含有艰难梭菌毒素TcdA的PBS。

作为阳性对照，在一部分注射了 PBS 和 FITC-葡聚糖的人类肠道类器官中，向培养基中添加 EGTA。对人类肠道类器官进行持续 20 小时的成像观察。如这些图像所示，注射 PBS 的人类肠道类器官几乎保留了 T 零时刻存在的全部荧光信号。

然而，注射了 TcdA 或经 EGTA 处理的人肠道类器官在显微注射后八小时也表现出荧光强度显著下降。对所有时间点的所有人肠道类器官成像数据进行量化，以生成高分辨率数据集，反映每种实验条件下荧光强度随时间的相对变化。一旦掌握该技术，根据实验条件的数量，操作可在大约 30 分钟至一小时内完成。

在进行该操作时，重要的是要记住保持耐心，在显微注射前将人肠道类器官与微毛细管对齐时需仔细操作。完成该步骤后，可进一步采用其他方法，如PCR、蛋白质印迹（western blot）和RNA测序（RNA seek），以回答有关人肠道类器官对注射物质反应的更多问题。该技术的建立使我们能够研究细菌毒素、药理学试剂、细胞因子甚至活的微生物对人肠道类器官上皮屏障功能的影响。

观看本视频后，您应能够充分掌握如何将荧光标记的葡聚糖及其他实验材料显微注射至人肠道类器官腔内的操作方法。请注意，在处理细菌毒素或活体生物时，可能存在极高危险性，因此在进行该操作时，必须采取适当防护措施，例如穿戴合适的个人防护装备（PPE）。最后，需特别小心避免刺伤，因为显微毛细管极为锋利。