Name: 基于自动对准的大面积扫描探针光刻及其在细胞培养研究中的应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: 学习基于自动对准的大面积扫描探针光刻技术，利用PDMS探针阵列和原子力显微镜制备纳米结构表面，用于研究间充质干细胞与材料表面的相互作用，为生物材料设计提供基础依据。

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作者感谢来自多个渠道的经费支持，包括英国工程与物理科学研究理事会（资助编号：EP/K011685/1、EP/K024485/1）以及为JH提供的研究生奖学金；勒弗休姆信托基金（RPG-2014-292）；惠康信托机构战略支持基金（105610/Z/14/Z）；英国文化协会（216196834）；曼彻斯特大学提供的曼彻斯特大学研究所（UMRI）启动基金以及授予SW的校长博士奖学金。同时，作者对Dr. Andreas Lieb（Nanosurf AG）提供的技术协助表示诚挚感谢。

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比对算法及软件由曼彻斯特大学开发并拥有专有权利。可从 http://www.click2go.umip.com/ 下载。

本方案旨在为用户提供一种便捷的方法，以在大面积（cm2）上快速实现具有高均匀性和可控特征尺寸的纳米光刻图案化。具有大面积纳米图案的基底可进一步用于多种应用。该技术的一个主要应用是构建用于细胞-表面相互作用研究的纳米结构表面。本报告展示了在这些材料上进行细胞培养的一些典型示例，证明了纳米结构基底对hMSC形态的调控作用。
该方案的关键在于实现了对准步骤（步骤4）的自动化，从而能够在表面上大规模、高均匀性地制备出特征结构，分辨率可达纳米级，进而显著加快细胞培养实验的周转速度。采用此对准算法进行的聚合物笔光刻技术可在约30分钟内生成纳米级结构。然而，自动对准的可重复性和准确性，以及所制备图案特征的均匀性，在很大程度上依赖于所制备探针阵列的质量（步骤1和2）。若制备过程中存在缺陷，导致探针钝化、断裂或缺失——例如封装过程中残留气泡（步骤1.5）或探针与母版分离不当（步骤1.8）——均可能导致对准不准确，从而影响光刻质量。
该报道的方法与依赖力反馈的其他对准方法具有一共同局限性。准确判断探针何时与表面接触，受限于必须考虑周围环境引起的背景振动以及样品台移动所产生的干扰。通常情况下，传感器的力灵敏度处于微牛（µN）量级（本例中为2 µN），但为了防止因背景噪声导致的“假阳性”信号，对准算法仅将至少490 µN的力认定为探针与表面之间确实发生接触。13 因此，该方法往往会产生较大的特征结构（1-2 µm），因为探针必须在较大距离上延伸 z-轴（从而产生更大的力）以记录接触。为进行补偿，可通过减小 z光刻步骤中沿轴方向行进的距离（例如，将步骤 5.2.3.2 中的“Black”设置由 5 µm 改为 3 µm。
然而，即使存在这一限制，该自动化算法仍能够解决并行扫描探针光刻技术应用中的一个关键问题，因为此前对准一直是这些技术实施过程中最耗时且最不精确的步骤。如今，该自动化技术已将制造过程的限速步骤从对准转移到光刻写入本身。尽管本方案展示了该对准程序在PPL中的应用，但该框架也可适用于多种扫描探针光刻（SPL）技术，例如脂质-DPN26 和基质辅助光刻27，以及未来潜在的催化探针系统28。

纳米技术的进步依赖于能够高效且可靠地在表面制造纳米尺度结构的技术发展。1,2 然而，要在大范围区域（多个 cm）上生成此类特征2以相对较低的成本可靠地实现这一目标并非易事。大多数现有技术源自半导体工业，依赖消融性光刻技术来制造“硬”材料。近年来，源自扫描探针显微技术（SPM）的光刻方法已成为快速构建纳米级设计的一种便捷且多功能的途径。3 基于扫描探针显微镜（SPM）的技术能够方便且快速地“书写”任意用户定义的图案。其中最著名的是蘸笔纳米光刻术（DPN），由 Mirkin 率先开创。 等,4 其中，利用扫描探针作为“笔”，将分子“墨水”转移到表面，以类似于书写的方式在表面形成微纳结构。在常温环境下，当探针在表面扫描时，“墨水”分子被转移至表面 通过 探针与表面之间形成的水弯月面（图1因此，DPN 可实现多种材料的纳米光刻沉积，包括聚合物和生物分子等“软”材料。5 使用带有流体输送通道的探针构建的相关技术，也被称作“纳米移液管”和“纳米喷泉笔”，已有相关报道。6,7,8
SPM衍生光刻技术更广泛应用的主要障碍是通量问题，因为使用单个探针在厘米尺度的区域上进行图案化需要过长的时间。早期解决该问题的努力集中在基于悬臂梁的DPN并行化上，已有报道采用“一维”和“二维”（2D）探针阵列对厘米尺寸的区域进行光刻5,9。然而，这些悬臂梁阵列需通过相对复杂的多步制造工艺制备，且结构较为脆弱。聚合物笔光刻技术（PPL）的发明通过将标准SPM悬臂梁替换为键合在玻璃载片上的二维软质硅氧烷弹性体探针阵列，解决了这一问题10。这种简单的探针结构显著降低了大面积图案化的成本和复杂性，使纳米光刻技术得以拓展到更广泛的应用领域。这种无悬臂梁的架构还进一步发展为硬尖端软弹簧光刻技术11，该技术结合了软弹性体基底与硬质硅尖端，相比使用软弹性体尖端所制备的图案，可实现更高的分辨率。
在实施这些二维阵列技术时，一个关键因素是探针阵列必须与表面基底完全平行，以便在使用光刻技术时，所有探针能够同时接触表面。即使存在微小的错位，也会导致阵列一侧到另一侧的特征尺寸出现显著差异，因为在阵列下降过程中，部分探针会较早接触表面，而其他探针则会较晚接触甚至完全不接触。12 对于PPL技术而言，精确对齐尤为重要，因为柔软的弹性体探针具有可变形性：较早接触表面的探针会被压缩，从而在表面上留下更大的接触印迹。
早期关于PPL的研究采用纯视觉检查来引导对准过程，通过在阵列上方安装摄像头，观察锥形探针与表面接触时的形变情况。10 对准的判断依据是观察探针的哪一侧先与表面接触，然后调整角度并重复该过程，通过迭代方式直至探针两侧接触表面的差异在肉眼看来无法分辨。由于该对准过程依赖于操作者主观的视觉判断，因此可重复性较低。
随后，人们开发出一种更为客观的方法，即在基底下方安装力传感器，用于测量探针与表面接触时所施加的力。12 通过调节倾斜角度以最大化所施加的力，从而实现对准，该力的最大值表明所有探针已同时与表面接触。该方法表明，可实现与表面平行度偏差在0.004°以内的对准精度。目前，这种“力反馈调平”技术已在两项独立研究中被集成到全自动系统中。13,14 这两种系统均采用三组力传感器，分别安装在基底下方或探针阵列上方，用于测量探针阵列与表面接触时所施加的力的大小。这些系统具有高精度，可在1 cm的尺度上实现≤0.001°的对准误差，14 或在1.4 cm尺度上实现≤0.0003°的对准误差。13 这些自动对准系统还显著节省了操作人员的时间，并大幅缩短了光刻工艺的总体耗时。
该技术实现的高通量表面制备的一个主要应用是细胞培养基底的构建。目前已有充分证据表明，通过调控细胞与表面结构之间的初始相互作用，可以操控细胞表型，且这种调控在纳米尺度上可得到进一步增强。15 具体而言，扫描探针光刻技术已被证明是制备多种纳米结构表面以用于此类细胞培养实验的简便方法。16 例如，已有研究利用PPL和DPN技术构建出具有自组装单分子层和细胞外基质蛋白纳米图案的表面，用于探究纳米修饰材料在材料诱导干细胞分化方面的潜力。17
本方案描述了一种改进的原子力显微镜（AFM）系统，可用于实现大面积的探针诱导局部沉积（PPL）。我们详细介绍了利用多个力传感器检测作用力以确定探针与表面接触的方法，并结合一种可自动完成迭代对准过程的算法。此外，还描述了将细胞外基质蛋白纤连蛋白功能化修饰于这些图案表面，以及人源间充质干细胞（hMSC）的培养过程，以此展示PPL制备的表面在细胞培养中的应用。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;仪器&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>安装在电动5轴（XYZ&amp;Theta;&amp;Phi;）平移与测角仪平台上的FlexAFM</td><td>NanoSurf</td><td>P40008</td><td></td></tr><tr><td>AFM控制软件</td><td>NanoSurf</td><td>C3000</td><td></td></tr><tr><td>雕刻笔</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z225568</td><td></td></tr><tr><td>等离子清洗机</td><td>Harrick plasma</td><td>PDC-32G-2</td><td></td></tr><tr><td>PlasmaFlo</td><td>Harrick plasma</td><td>PDC-FMG-2</td><td></td></tr><tr><td>经济型干燥氧气服务泵</td><td>Harrick plasma</td><td>PDC-OPE-2</td><td></td></tr><tr><td>试管旋转仪</td><td>Stuart</td><td>SB3</td><td></td></tr><tr><td>真空干燥器</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5311-0250</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q超纯水系统</td><td>Merck Millipore</td><td>ZRXQ015WW</td><td></td></tr><tr><td>模块化湿度发生器</td><td>proUmid</td><td>MHG32</td><td></td></tr><tr><td>Proline Plus移液器 100–1000 &amp;micro;L</td><td>Sartorius</td><td>728070</td><td></td></tr><tr><td>硅模板</td><td>NIL Technology</td><td>定制</td><td></td></tr><tr><td>直立式快照荧光显微镜</td><td>Olympus</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>显微镜物镜</td><td>Olympus</td><td>10x 和 60x UPlan FLN &amp;infin;/-/FN 26.5</td><td></td></tr><tr><td>直立式明场显微镜</td><td>Leica</td><td>DM 2500M</td><td></td></tr><tr><td>超声波清洗机</td><td>Ultrawave Ltd.</td><td>U95</td><td></td></tr><tr><td>用于记录和解读自动对准结果的电子表格</td><td>Microsoft</td><td>Excel</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-丙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34863</td><td>易燃</td></tr><tr><td>显微镜载玻片，透明，磨边</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>451000</td><td></td></tr><tr><td>（7&amp;ndash;8% 乙烯基甲基硅氧烷）-二甲基硅氧烷共聚物，三甲基硅氧基封端</td><td>Gelest</td><td>VDT-731</td><td></td></tr><tr><td>1,3,5,7-四甲基-1,3,5,7-四乙烯基环四硅氧烷</td><td>Gelest</td><td>SIT7900.0</td><td></td></tr><tr><td>铂(0)-1,3-二乙烯基-1,1,3,3-四甲基二硅氧烷络合物溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>479527</td><td>有害，有毒</td></tr><tr><td>（25&amp;ndash;35% 甲基氢硅氧烷）-二甲基硅氧烷共聚物，三甲基硅氧烷封端</td><td>Gelest</td><td>HMS-301</td><td></td></tr><tr><td>称量舟 100 mL</td><td>Scientific Laboratory Supplies</td><td>BALI828</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德吸管</td><td>Appleton Woods</td><td>KS230</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>SARSTEDT</td><td>82.1473</td><td></td></tr><tr><td>剃须刀片</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ST10-031T</td><td></td></tr><tr><td>导电碳胶带</td><td>Agar scientific</td><td>AGG3939</td><td></td></tr><tr><td>16-巯基十六烷酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448303-1G</td><td>有害，有毒</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34852</td><td>易燃</td></tr><tr><td>镀金显微镜载玻片</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>643203</td><td>开封后，金表面至少1个月内仍对硫醇保持反应活性</td></tr><tr><td>硫脲</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8656</td><td>有害，有毒</td></tr><tr><td>硝酸铁(III)九水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>529303</td><td>有害，有毒</td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84415</td><td>有害，有毒</td></tr><tr><td>(11-巯基十一烷基)六(乙二醇)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>675105</td><td>有害，有毒</td></tr><tr><td>人血浆来源纤连蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0895</td><td></td></tr><tr><td>硝酸钴(II)六水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>203106</td><td>有害，有毒</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s磷酸盐缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>MSCGM间充质干细胞生长培养基</td><td>Lonza UK</td><td>PT-3001</td><td></td></tr><tr><td>人源间充质干细胞</td><td>Lonza UK</td><td>PT-2501</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge X1离心机</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004210</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR离心管</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188261</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Fisher Scientific</td><td>P/0840/53</td><td>有害，有毒</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488鬼笔环肽</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>&quot;在文稿中为“去垢剂”&quot;</td></tr><tr><td>含DAPI的VECTASHIELD抗荧光淬灭封片剂</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>兔抗纤连蛋白抗体</td><td>Abcam</td><td>ab2413</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 594标记</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R37117</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3912</td><td></td></tr><tr><td>12孔板</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10253041</td><td></td></tr><tr><td>T75细胞培养瓶</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10790113</td><td></td></tr><tr><td>悬臂梁</td><td>BudgetSensor</td><td>ContAl-G</td><td></td></tr></tbody></table>

大面积扫描探针纳米光刻技术通过自动对准实现及其在细胞培养研究用基底制备中的应用

Large-area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment and Its Application to Substrate Fabrication for Cell Culture Studies

扫描探针显微技术推动了多种构建性（“增材式”）自上而下纳米结构加工方法的发展。传统上，扫描探针光刻技术的主要局限在于单探针系统固有的低通量问题。这一问题已通过采用多探针阵列的方式得以解决，从而实现纳米光刻通量的提升。为了实施此类并行化纳米光刻，探针阵列与基底表面的精确对准至关重要，以确保在开始光刻图形化时所有探针能够同时接触表面。本实验方案描述了利用聚合物笔光刻技术在厘米尺度区域内制备纳米级结构的方法，该过程借助一种算法实现了探针阵列快速、精确且自动化的对准。在此，通过在金基底上进行硫醇分子的纳米光刻，展示了高度均一结构的生成。随后，这些图形被功能化修饰以负载纤连蛋白，用于表面导向的细胞形态学研究。

为检查自动对准是否成功，需查看对准数据（来自步骤4.8的电子表格）所绘制的图表。当对准过程成功时，对应于样品台沿θ轴和φ轴倾斜角度的两条曲线会显示出一系列上升和下降的数据点。在每条曲线中，对数据点进行两次线性拟合，可得到一个明确的交点“峰”，该峰指示了最大的z向延伸量以及实现对准所对应的角度（图4A和4B）。此过程需重复四次（即，每个轴各两次），并绘制成四组坐标的集合。每对坐标之间的交点即表示整体最优角度（图4C）13。在对准未成功的情况下，可观察到相应的θ角和φ角曲线无法获得高质量的线性拟合，或不出现交点（图5）。此类对准失败通常是因为阵列修剪不当或安装至探针夹持器时位置不正（步骤1.7、1.8和2.2）。在此类情况下，应弃用该阵列，并制备和安装新的阵列（步骤1和2），然后重复对准过程（步骤4）。
在通过PPL使用MHA完成成功对准和光刻后，采用侧向力显微镜对图案化的金基底进行成像，以检测是否已发生沉积。此外，在蚀刻未被硫醇保护的金区域后，还通过光学显微镜对打印表面进行更大范围的观察（图6 和 图7）。然而，蚀刻后的图案不能用于进一步的功能化修饰，仅可用于确认一批打印基底样品中具有代表性的图案化效果。如果蚀刻图案显示出对应于单个探针笔的空白区域（图8），则表明探针阵列的制备未成功，部分探针可能已损坏或缺失。此类探针的不均匀性可能是由于使用了旧的母版，其上的全氟化涂层已磨损（步骤1.3），导致在将阵列从母版分离时部分探针被撕裂。在此类情况下，应使用新的母版。该结果也可能归因于玻璃背板与母版之间夹杂了气泡（步骤1.5），或在固化后探针阵列未能从母版上干净地分离（步骤1.8）。
孵育hMSCs后，还采集了纤维连接蛋白功能化表面的荧光显微镜图像（图9）。总体而言，所有底物在此期间均保持稳定 体外 在较小的孤立特征阵列（20 × 20）情况下，细胞在培养环境中附着并适应了所打印的图案形态。
<img alt="弹性探针阵列用于水弯月面形成；探针与基底组装示意图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1. 聚合物笔光刻技术示意图，展示分子墨水传输过程 通过 探针尖端的水弯月面。 （A）聚合物笔阵列的侧视图和（B）顶视图表明，当探针阵列与表面基底完全对准时，所有探针同时接触表面，从而实现并行光刻。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="用于纳米加工的聚合物笔阵列、探针夹持器和5轴倾斜平台的原子力显微镜装置示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2. 原子力显微镜聚合物笔光刻装置的示意图。 （A）实验装置的展开侧视图，其中制备好的探针阵列连接至探针夹持器，并安装在原子力显微镜扫描器上。基底放置于平台之上，平台下方设有三个力传感器。（B）组装完成的仪器示意图，显示原子力显微镜扫描头相对于样品台的位置。（C）底视图，显示力传感器的位置。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="时间-位移图，10μm，0.1秒递增/递减，静态过程示意图，用于教学。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3. 表示校准过程中光谱程序的示意图。 原子力显微镜（AFM）扫描器设定为在100 ms内将探针向样品方向移动10 µm，随后在该位置保持250 ms，接着在100 ms内回缩10 µm，然后在回缩位置保持250 ms。此运动在校准过程中重复进行。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="静态平衡分析；角度位置图；交点；实测位置与拟合位置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4. 显示成功校准的图表。 成功校准条件下，z 位置随倾斜角（A）θ 和（B）φ 变化的曲线图，其中 ● 表示实际测量值，+ 表示采用最小二乘法获得的最佳拟合值。（C）φ 与 θ 拟合角度的关系图，包含达到最大 z 位置的四个点。图中标记的交点即为两个轴向上最终的最优倾斜角。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示 z 位置与角度交点分析的图表，包含 R² 值，以及测量值与拟合数据。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 5"> 
图 5. 显示未成功对准的图表。 z 位置相对于倾斜角度 (A) θ 和 (B) φ 的关系图，用于一次未成功的对准实验，其中 ● 表示实际测量值，+ 表示采用最小二乘法得到的最佳拟合结果。(C) φ 与 θ 拟合角度的关系图，包含达到最大 z 位置的四个点。未观察到明显的极值点或交点，因此无法确定最佳对准角度。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="周期性纳米图案的光学显微照片；插图为更高倍数的图像；纳米制造方法。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图6"> 
图6. 使用对准的PPL阵列在金基底上以MHA进行图案化后蚀刻所得的金基底的代表性光学显微镜和原子力显微镜图像。 （A）和（B）为蚀刻图案的逐级放大光学显微图像；（C）为单个图案网格的原子力显微镜形貌图像。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="纳米级图案的显微镜图像，显示在不同放大倍数下重复的猫形图案。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 7"> 
图7. 通过排列对齐的PPL阵列在金基底上用MHA进行图案化并随后蚀刻的代表性光学显微镜图像。 （A）和（B）为蚀刻图案的逐级放大光学显微镜图像，（C）为低倍图像，显示大面积均匀的图案。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="带有激光蚀刻网格的微结构表面示意图，5 µm 尺度，指示 z 轴延伸。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig8.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 8"> 
图 8. 经不均匀 MHA 图案化后蚀刻的金基底的代表性光学显微镜图像。 预期图案（如插图所示）为重复的网格结构，由 20 行点线组成，每两行通过将 z 轴延伸增加 1 µm（范围从 5 到 -5 µm）生成。可以看出，在某些区域未生成图案，这是由于这些位置缺少探针所致。在仅生成两行点状结构的区域，该结果表明探针存在，但其高度与其他正常工作的探针不同，因此仅在阵列延伸至最大 z 轴距离时才沉积特征结构。本图像中，对比度已被刻意调整，以便观察部分打印区域。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig8large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞显微镜、荧光成像、有丝分裂分析、多细胞阵列、20μm-50μm尺度。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig9.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图9"> 
图9. 在PPL模板化的纤连蛋白阵列上培养的人骨髓间充质干细胞（hMSCs）的落射荧光显微图像。 （A）和（B）为显示单个细胞的高倍放大图像。（C）显示了无细胞黏附的纤连蛋白阵列的一个示例图案，（D）为细胞以网格状排列培养的宽视野图像（插图中也展示了打印图案的示意图）。细胞经染色以显示纤连蛋白（红色）、F-肌动蛋白（绿色）和细胞核（蓝色）。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig9large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍了一种基于探针阵列迭代对准的广域扫描探针纳米光刻技术方案，以及利用光刻图案进行细胞表面相互作用研究的方法。

扫描探针显微技术已实现多种构建性（“增材式”）自上而下微纳加工方法的创建……

迫切需要便捷的工具来制造纳米尺度的结构和物体，尤其是在研究生物相互作用与纳米结构材料及表面的领域。本方案能够在厘米尺度范围内快速、均一地复制具有纳米级分辨率的蛋白质阵列，从而使得我们能够研究间充质干细胞在这些表面上的相互作用。这些模型表面使我们能够研究特定材料变量与间充质干细胞之间的可控相互作用，从而提供基本的材料设计标准，为未来的生物材料设计提供指导。开始实验前，将PDMS预聚物的各组分在称量皿中充分混合。然后将混合物置于真空干燥器中脱气20分钟，或直至所有气泡完全消失。然后，将PPL阵列的硅胶母模放入一个四厘米的培养皿中。将脱气后的PDMS预聚物混合液倒入母模上，直至完全覆盖。再对覆盖在母模上的PDMS进行五分钟的脱气处理。脱气过程中，将载玻片用氧气等离子体处理一分钟。脱气后，小心地将载玻片处理面朝下放置在PDMS上。轻轻按压载玻片与硅模板贴合，以去除夹带的空气，并确保在模板与载玻片之间形成一层均匀的PDMS夹层。将夹心状的PDMS阵列转移至另一个培养皿中，硅模板朝下放置。在70至80摄氏度的烘箱中固化PDMS 24至48小时。随后，从烘箱中取出固化的PPL阵列，静置冷却15分钟。使用剃刀小心地修剪载玻片背面和侧面多余的PDMS。用干燥的氮气流吹走松散的PDMS碎屑。修剪掉阵列背面和边缘多余的PDMS对于实现精确对齐至关重要。这也有助于用户在原子力显微镜（AFM）下进行光刻时更清楚地观察探针的状态。将剃刀刀片插入阵列角落，深度为一毫米，然后以单一、连续的抬升动作小心地将阵列从硅模板上撬下。随后，用剃刀刀片仔细切割并刮除阵列边缘处0.5毫米的PDMS材料。在从母版上撬取阵列时，操作人员应格外小心，以确保阵列良好分离并避免损坏探针。该操作应一次性平稳完成，防止阵列重新落回硅母版上。将PPL阵列用氧等离子体处理30秒，然后在阵列表面滴加20微升去离子水。如果水未能均匀覆盖整个阵列，则需重复等离子体处理。将经过等离子体处理的阵列彻底干燥，然后使用双面导电胶带将阵列固定在原子力显微镜探针 holder 上。将探针 holder 安装到 AFM 运动学 holder 上。为了对芯片进行染色，将20微升溶于乙醇的1毫摩尔MHA溶液滴加到芯片上，注意避免移液器吸头接触芯片表面。让MHA溶液在芯片上充分扩散，静置等待乙醇完全挥发。将带有 PPL 阵列的探针支架安装到原子力显微镜（AFM）上，然后将金基底置于 AFM 样品台的中心位置。使用胶带将基底固定。开始对准时，运行样品台控制器设置程序，将所有轴和角度重置至预校准的零点。使用原子力显微镜样品台的 X 轴和 Y 轴控制面板，将基底移动至所需的打印位置。切换样品台释放杆以释放样品台，并激活力传感器。让传感器平衡至少 15 分钟，然后使用 Z 轴控制器升高样品台，直至阵列在视觉上尽可能接近基底。确保阵列与基底之间的距离在1毫米以内。接下来，打开自动对准程序。填写角度步长、粗调步进距离和细调步进距离。设置电子表格文件路径并附加电子表格模板。然后打开原子力显微镜控制软件，进入光谱学模块。将扫描头Z轴振荡配置为在100毫秒内延伸10微米，保持250毫秒，再在100毫秒内回缩10微米，再保持250毫秒。启动扫描头振荡并运行自动对准。当软件提示对准完成后，结束对准过程。检查自动生成的对准数据线性拟合结果，以确定对准是否成功，并识别整体最优角度，然后以500纳米为步长逐步升高样品台，直至通过AFM俯视相机观察到阵列与基底之间的接触。在原子力显微镜（AFM）控制软件中点击“停止”，使探针阵列回缩10微米。要开始PPL过程，请打开AFM控制软件中的光刻部分。选择Z调制操作模式，并导航至要导入的光刻图案。填写要生成的图案尺寸。将X轴和Y轴的原点偏移均设置为25微米，然后选择调制绝对Z位置，将仪器设置为简化为两层，并将黑白值分别设置为5微米和负5微米。单击“确定”以应用设置并关闭窗口。从光刻窗口打开图层编辑器，并设置暂停时间。接着，将大气隔离室降至原子力显微镜（AFM）上，并启动其控制软件。设置相对湿度为45%、温度为25摄氏度，以及气体交换流速为500毫升。实施设置并等待达到所需的湿度水平。然后开始光刻序列。光刻完成后，将载物台回撤500微米。移除大气隔离室。锁定样品台以关闭力传感器。最后，从样品台上取下基底用于观察或进一步处理。使用PPL技术可制备大面积、均匀的精细阵列网格或复杂图像图案。通过刻蚀未被沉积的硫醇保护的金层，可在光学显微镜下观察到这些图案。若出现不规则的图案，则表明探针存在损伤或缺失。采用PPL技术在金表面打印的MHA阵列经纤维连接蛋白功能化后，与人骨髓间充质干细胞共孵育。单个细胞黏附于纤维连接蛋白功能化的阵列上，并根据需要适应图案的形态。该PPL技术可用于沉积多种蛋白质图案，适用于细胞生物学实验。熟练的操作者大约可在三小时内生成类似图示的图案。请记住，精细的阵列制备是成功的关键。PPL 技术具有较强的通用性，可用于从小分子到聚合物及生物分子等多种化合物的沉积，为化学、生物学和材料科学领域的多种研究提供了可能。

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科研

JoVE Journal

Bioengineering

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