Name: 单细胞指数分型与内皮细胞小生境联合培养对胚胎造血干细胞前体的克隆分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: 学习单细胞指数分型与内皮细胞联合培养技术，用于分析小鼠胚胎造血干细胞前体的表型特征与植入潜能。该方法为发育血液学研究提供单细胞水平的克隆分析框架。

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我们感谢Fred Hutchinson流式细胞术核心实验室的Andrew Berger、Stacey Dozono和Brian Raden在FACS方面的协助。本研究工作得到了美国国立卫生研究院心肺血液研究所（NHLBI）UO1资助项目#HL100395、辅助协作资助项目#HL099997以及糖尿病消化肾脏疾病研究所（NIDDK）资助项目#RC2DK114777的支持。Brandon Hadland获得了Alex's Lemonade Stand基金会和Hyundai Hope on Wheels基金会的资助。

本文所述所有方法均已获得弗雷德·哈钦森癌症研究中心机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准。
1. 共培养用 AGM-EC 单层细胞的制备
<ol>
	<li>在进行AGM解剖和分选前24小时，制备&#160; AGM-EC 培养基过滤除菌。</li>
	<li>向96孔板的每个孔中加入0.1%的水溶液明胶（100 µL/孔），室温孵育15分钟。吸除明胶溶液，将板置于组织培养超净台中，移除盖子，晾干孔内液体至干燥。</li>
	<li>消化AGM-EC单层细胞并接种至96孔板中。 
	注意：维持此前所述方法制备的AGM-EC16，在AGM-EC培养基中。为保持一致性，应在获得足够数量的细胞后立即冻存AGM-EC细胞系（通常为第1至第3代），并在共培养实验中使用特定代次的细胞（通常为第5至第12代）。AGM-EC细胞系来源于C57BL/6J（CD45.2）AGM。参见 材料表 所有培养基成分。
	<ol>
		<li>吸去75 cm²培养瓶中AGM-EC培养物的培养基2 烧瓶中加入5 mL PBS。吸除PBS，加入3 mL胰蛋白酶溶液（参见 材料表).</li>
		<li>37 °C 孵育 2-4 分钟，直至大多数细胞从培养板上脱落。加入 7 mL AGM-EC 培养基，使用 10 mL 移液器吹打 8-10 次以制备单细胞悬液，转移至 15 mL 离心管中。</li>
		<li>300 × g 离心 5 分钟，弃上清，用 10 mL AGM-EC 培养基重悬细胞，并用血细胞计数板估算细胞数量。将细胞稀释至浓度为 1 × 105 细胞/mL，在AGM-EC培养基中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>加入100 µL AGM-EC细胞悬液（1 × 10⁶ cells/mL）4 细胞）加入至经明胶处理的96孔板的每个孔中。置于37 °C、5% CO₂培养箱中2 在组织培养孵育箱中过夜培养，以使主动脉-性腺-中肾内皮细胞（AGM-EC）贴壁并形成融合的单层。 
	注意：均匀分布AGM-EC基质细胞，以避免过度生长或细胞聚集成团，从而获得最佳共培养效果。</li>
	<li>制备AGM-EC单层用于AGM共培养。
	<ol>
		<li>次日早晨，配制AGM无血清培养基。</li>
		<li>使用12通道多通道移液器，从AGM-EC中移除AGM-EC培养基，并加入200 µL/孔不含细胞因子的AGM无血清培养基，以洗去残留的含血清培养基。</li>
		<li>吸除培养基，每孔加入 200 µL 含细胞因子的 AGM 无血清培养基。更换培养基时操作需迅速，以避免损伤内皮层； 例如，逐行移除并重新添加培养基。将96孔板置于37 °C细胞培养孵箱中，直至胚胎细胞准备就绪用于分选。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 小鼠胚胎组织单细胞悬液的制备
<ol>
	<li>从定时交配的小鼠中解剖分离AGM组织。
	<ol>
		<li>设置定时交配以获取所需发育阶段的胚胎组织。</li>
		<li>根据待分析的前体造血干细胞（pre-HSC）所处的发育阶段，于交配后9.5至11.5天（dpc）从怀孕雌鼠中收获胚胎。 
		注：胚胎组织来源于C57BL/6J（CD45.2）小鼠，具体胚胎分期依据体节计数进行，方法如前所述16。我们重点关注基于体节分期的E9.5至E11.5期间胚胎AGM区域及其前体P-Sp中的细胞群体分析。</li>
		<li>从胚胎中解剖分离AGM组织20。 
		注：已有其他研究者发表关于从小鼠胚胎中解剖AGM组织的详细实验方案20。此外，也可采用本方法分析卵黄囊或其他被认为具有pre-HSC活性的组织。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将解剖所得的胚胎组织进行解离。
	<ol>
		<li>将解剖后的组织收集至一个15 mL锥形管中，管内预先加入10 mL含10% FBS的PBS，并置于冰上。待组织自然沉降后，吸除PBS/FBS溶液，立即加入1 mL 0.25%胶原酶，随后将管子置于37 °C水浴中消化25分钟。</li>
		<li>加入1 mL PBS/10% FBS，使用1 mL移液枪头反复吹打20–30次，以获得单细胞悬液。再加入8 mL PBS/10% FBS，于300 × g离心5分钟，弃去上清液。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 小鼠胚胎细胞的抗体染色
<ol>
	<li>准备抗体染色用封闭缓冲液。
	<ol>
		<li>在1 mL含10% FBS的PBS中加入10 µg/mL抗小鼠CD16/CD32（Fc受体（FcR）封闭剂）和1 µg/mL DAPI（1 mg/mL储存液，溶于H2O）。</li>
		<li>用3 mL注射器吸取上述溶液，并通过0.22 µm注射器滤器过滤以灭菌。将来自解离的小鼠胚胎组织的细胞沉淀（来自步骤2.2.2）重悬于500 µL封闭缓冲液中，冰上孵育5分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制抗体混合液17。
	<ol>
		<li>在1 mL含10% FBS的PBS中加入10 µg/mL FcR封闭剂，以及各10 µL的荧光素偶联抗-VE-Cadherin抗体（CD144，参见材料表）和荧光素偶联抗-EPCR抗体（CD201，参见材料表）。除非制造商另有说明或根据滴定结果调整，否则抗体终稀释度为1:100。 
		注：该抗体组合用于定义分选门控，如下所述（步骤4.2）。基于VE-Cadherin与EPCR共表达进行分选，可显著富集来自AGM组织、具有造血干细胞前体活性的细胞群，如先前报道17。</li>
		<li>可根据需要添加其他荧光素偶联抗体，用于对单个索引分选前体细胞进行进一步表型分析。 
		注：这些抗体不一定用于定义分选门控。在本示例方案中，我们加入了PE偶联抗-CD41抗体和FITC偶联抗-CD45抗体，以分析这些造血标志物的相对表达水平，这些标志物在前体造血干细胞从生血内皮中出现过程中发生动态变化4,5,16,17。可根据需要加入其他感兴趣的标志物。使用荧光素偶联同型对照抗体染色的样本用于确定分析中的阴性和阳性门控。</li>
		<li>用3 mL注射器吸取抗体混合液，并通过0.22 µm注射器滤器过滤以灭菌。将500 µL抗体混合液加入封闭缓冲液中的细胞悬液，用移液器吹打混匀，冰上孵育至少15–20分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>洗涤染色后的细胞。
	<ol>
		<li>加入8 mL PBS/10% FBS。以300 x g离心5分钟，吸除上清，将细胞沉淀重悬于1 mL PBS/10% FBS中。</li>
		<li>将细胞悬液通过装有35 μm细胞筛网帽的5 mL离心管，以去除细胞团块。用额外3 mL PBS/10% FBS冲洗筛网。以300 x g离心5分钟，吸除上清，将细胞重悬于500 µL PBS/10% FBS中，置于冰上直至进行FACS分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 将单个生血前体细胞与AGM-EC基质细胞共培养并分选至96孔板
<ol>
	<li>根据制造商的说明，准备流式细胞分选仪（FACS）进入孔板模式，并对齐以将细胞分选至96孔板。在软件中选择单细胞模式和索引分选模式，以实现最大纯度的掩膜设置，并获取每个分选细胞的索引参数。</li>
	<li>从抗体染色的样本中获取细胞样本，以设定分选门控。
	<ol>
		<li>将染色后的细胞样本上机至FACS仪器，并以最低流速采集细胞。绘制FSC-A对SSC-A的散点图，并选择包含不同大小细胞的门控（图1B）（该操作基于在AGM组织中不同大小细胞群体中均能检测到前体造血干细胞（pre-HSC）活性的观察结果17）。绘制FSC-A对FSC-W以及SSC-A对SSC-W的散点图，并设置门控以排除双联体。然后绘制FSC-A对DAPI的散点图，以圈选活细胞（DAPI阴性）（图1B）。</li>
		<li>绘制PECy7（或用于VE-Cadherin染色的相应荧光染料）对PerCP（或用于EPCR染色的相应荧光染料）的散点图。圈选VE-Cadherin阳性（包含AGM来源的内皮细胞、造血祖细胞及pre-HSC的混合群体）且EPCR高表达（可富集来自P-Sp/AGM的pre-HSC17）的细胞群体。此即为第4.3步中用于索引分选单细胞的最终门控（图1B）。</li>
		<li>绘制用于染色的其他荧光染料的散点图。 
		注：根据待分析的亚群，可基于其他标记物的检测结果设置额外门控。然而，索引分选可记录每个分选细胞的荧光参数，以便后续回溯分析。因此，目前无需设置额外门控。在所有FACS设置中，应使用单抗体染色样本进行补偿调节，以校正重叠荧光染料发射光谱的溢出效应；同时使用同型对照抗体样本，以评估背景染色并确定阴性/阳性门控。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对AGM细胞进行索引分选。
	<ol>
		<li>将预先接种了AGM-EC基质并在含细胞因子的AGM无血清培养基中培养的96孔板（来自步骤1.5.3）放入FACS分选仪的板位中。加载样本并开始采集。选择索引分选/单细胞模式，并开始将单个细胞分选至各个96孔板中。使用最低流速以尽量减少对胚胎细胞的剪切应力。</li>
		<li>确保在索引分选过程中记录所有事件。这将有助于统计分选门控中分析的细胞总数与实际分选至各孔的细胞数量之间的关系，因为并非所有记录的事件都会被成功分选至孔中。</li>
		<li>当细胞被分选至整块96孔板后，将该板置于37 °C、5% CO2的组织培养孵箱中。根据实验需要重复此步骤以完成更多板的分选。</li>
		<li>将分选后的单个细胞与含有AGM-EC的96孔板（来自步骤4.3）共培养最多7天（来自E11-11.5胚胎的细胞培养5天，E10-10.5胚胎的细胞培养6天，E9-9.5胚胎的细胞培养7天）。共培养结束后，在100倍放大倍数下使用倒置显微镜观察不同大小和形态的造血集落（图2B）。 
		注：共培养期间无需更换培养基。分选的造血前体细胞最初可能以类似内皮细胞的形态整合入AGM-EC层中，因此难以与AGM-EC基质细胞区分（图2A）。但在共培养24–48小时后，可观察到小而圆的造血细胞或细胞簇。在共培养结束时（5–7天），可在部分接收到具有克隆性造血潜能细胞的96孔中观察到独立的造血细胞集落。若目视检查发现某孔中存在多个明显不同的集落，则该样本应排除于后续分析之外，以避免因单孔中分选入多个细胞而导致的污染。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 共培养后克隆性造血后代的分析
<ol>
	<li>从每个96孔板中收获克隆用于FACS分析。
	<ol>
		<li>使用带200 µL吸头的多通道移液器剧烈吹打，使造血细胞从内皮层解离。尽量避免解离内皮层。取出100 µL（约样本的50%）用于通过FACS对造血子代进行表型分析。</li>
		<li>转移至96孔V型底板，以300 × g离心2分钟以沉淀细胞。将板倒置，通过一次快速弹击动作将培养基从板中甩出（弹击板）以去除上清液。</li>
		<li>将剩余的100 µL细胞保留在原始96孔板中，并置于37 °C培养箱中，用于后续的移植实验（步骤6）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用适当的抗体孵育细胞以进行造血分析。
	<ol>
		<li>在96孔V型底板的每孔中，用含10 µg/mL FcR阻断剂和1 µg/mL DAPI的50 µL PBS/2% FBS重悬细胞沉淀。将板在4 °C孵育5分钟。</li>
		<li>加入50 µL含10 µg/mL FcR阻断剂及用于HSC分析的抗体混合物的PBS/2% FBS，抗体混合物包括PE-Cyanine7标记的抗VE-Cadherin抗体、PerCP标记的抗CD45抗体、PE标记的抗EPCR抗体、APC标记的抗Sca1抗体以及FITC标记的抗Gr1和抗F4/80抗体（各抗体终稀释度为1:100，除非根据制造商建议或滴定结果另有说明）。将板在4 °C孵育至少20分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过连续洗涤去除未结合的抗体并分析细胞。
	<ol>
		<li>每孔加入200 µL PBS/2% FBS，以300 × g离心2分钟以沉淀细胞。然后弹击板以弃去上清液，每孔再加入200 µL PBS/2% FBS重悬细胞沉淀，再次以300 × g离心2分钟以沉淀细胞。</li>
		<li>弹击板以弃去上清液，每孔加入50 µL PBS/2% FBS用于分析。随后使用配备板式进样器的流式细胞仪进行FACS分析。 
		注：采集固定体积的细胞（例如，重悬所用50 µL总体积中的35 µL），以计数造血子代的不同亚群。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分析含有造血子代的每个孔的FACS数据，以筛选具有HSC潜能的克隆（图3）。
	<ol>
		<li>首先设门圈选CD45阳性而髓系标志物Gr1和F480阴性的细胞群体。不要排除仍表达低水平VE-Cadherin的细胞。在收获造血克隆过程中从AGM-EC层脱落的细胞为VE-Cadherin阳性且CD45阴性。</li>
		<li>进一步对CD45+VE-Cad-/lowGr1-F4/80-细胞群体中高表达EPCR和Sca1的亚群设门（图3A - C）。 
		注：在先前的研究中，缺乏CD45+VE-Cad-/lowGr1-F4/80-Sca1hiEPCRhi表型的克隆（图3D）在照射受体小鼠中始终无法检测到多谱系外周血移植重建效果17（数据未显示）；因此，这些克隆无需纳入步骤6的后续移植分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 单个克隆植入特性的分析及其与索引分选揭示的表型特性的相关性
<ol>
	<li>在第5步表型分析当天（如有可能）或次日早晨，使用200 µL移液枪头通过剧烈吹打，重新悬浮每个96孔板中经共培养后（来自步骤5.1）含有造血集落的剩余100 µL细胞。</li>
	<li>准备并添加来自同源品系B6.SJL-PtprcaPepcb/BoyJ（B6 CD45.1）成年小鼠的全骨髓挽救细胞16,17。
	<ol>
		<li>在血细胞计数板下用Turks溶液对有核骨髓细胞进行计数。用含2% FBS的PBS稀释至浓度为5 × 105个有核细胞/mL。</li>
		<li>向每个含有造血子代细胞的孔中加入100 µL挽救用骨髓细胞（5 × 104个），并通过移液混匀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将单个克隆的子代细胞移植到一只经致死剂量照射的同源品系B6.SJL-PtprcaPepcb/BoyJ（B6 CD45.1）成年小鼠体内。
	<ol>
		<li>使用铯源以1,000 cGy剂量对与待注射克隆数量相同的B6 CD45.1小鼠进行致死性照射，每只小鼠单独注射一个克隆的子代细胞。</li>
		<li>用½ mL胰岛素注射器（配29G ½英寸针头）吸取200 µL总细胞悬液（包括克隆来源细胞及5 × 104个B6 CD45.1挽救骨髓细胞）。</li>
		<li>在注射前2–24小时内对B6 CD45.1成年受体小鼠进行致死性照射。</li>
		<li>使用允许尾部操作的塑料小鼠固定器，通过尾静脉注射200 µL细胞悬液，其中包含每个克隆的细胞以及5 × 104个B6 CD45.1成年骨髓挽救细胞，以促进受体存活。</li>
		<li>对受体小鼠进行耳标编号并称重，并定期检查其体重和健康状况（例如，照射/移植后每周3–4次，或根据各机构标准操作规程），以确保其健康状态良好。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在移植后定期（例如，2周、16周、24周）进行外周血嵌合情况分析。
	<ol>
		<li>通过眼眶后静脉丛采血或其他符合伦理规范的放血方法采集50–100 µL血液。</li>
		<li>向血液中加入3 mL裂解缓冲液（16.6 g NH4Cl、2 g NaHCO3 和74.4 mg EDTA溶于2 L H2O），室温孵育5分钟。以300 × g离心5分钟。吸除上清，用2 mL PBS/2% FBS重悬沉淀，再次以300 × g离心5分钟。</li>
		<li>用含10 µg/mL FcR阻断剂和1 µg/mL DAPI的150 µL PBS/2% FBS重悬细胞沉淀，并将总体积均分为三份：一份加入含50 µL同型对照抗体（用于供体和谱系标记）的孔中，一份加入含50 µL供体抗体及谱系同型对照的孔中，第三份加入含50 µL可同时检测供体和谱系标记物的抗体的孔中。 
		注：用于检测多谱系嵌合的抗体包括：APCeFluor780标记的抗CD45.2抗体、Pe-Cyanine7标记的抗CD45.1抗体、FITC标记的抗CD3抗体、PE标记的抗F4/80抗体、PerCP标记的抗Gr1抗体、APC标记的抗CD19抗体，或相应的同型对照抗体。</li>
		<li>通过流式细胞术随时间评估CD45.2（供体）来源的髓系（Gr1和/或F4/80阳性）、B细胞（CD19阳性）和T细胞（CD3阳性）在外周血中的贡献，从而鉴定具有长期嵌合能力的克隆（图4A-B）。 
		注：也可通过分析从骨髓、脾脏、胸腺和腹腔组织中分离的造血细胞群中CD45.2（供体）来源细胞的比例来评估造血嵌合情况，或通过将骨髓细胞二次移植至B6 CD45.1小鼠体内以评估其连续嵌合能力17。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将每个克隆的表型特征（由初始单细胞索引分选确定）与其嵌合特性相关联。使用流式分析软件上传每个索引分选细胞的分选参数（与分选至的96孔板孔位相对应），并将功能数据映射到流式图上，以评估单细胞表型特征与其功能输出（例如长期、多谱系嵌合能力）之间的关系（图4C）。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在胚胎发育过程中研究造血干细胞（HSC）的生成，需要能够检测尚不具备在移植成年受体中实现长期多系造血重建能力的造血前体细胞中HSC潜能的方法。本实验方案介绍了一种通过在主动脉-性腺-中肾区（AGM）来源的血管生态位内皮细胞（ECs）上进行基质共培养，对胚胎造血前体细胞进行克隆水平检测的方法，该体系可支持前体细胞向HSC的成熟，并可通过后续的移植功能实验进行分析。结合索引分选技术，可对实验中所包含的表面标志物定义的前体造血干细胞（pre-HSC）特性进行表型参数的回溯性分析。因此，该方法相较于依赖前体细胞群体批量分选并结合再聚集型HSC检测的其他方法4,5,10具有优势，能够在高效筛选pre-HSC潜在标志物的同时，提供每个单细胞表面标志物相对表达水平的信息。例如，利用该方法，我们此前报道过，除了使用EPCR富集不同发育阶段的pre-HSC群体外，Notch配体Dll4的中等水平表达进一步界定出具有HSC潜能的克隆性VE-Cadherin+</...

克隆研究表明，成体造血干细胞（HSC）在长期植入特性方面存在异质性，这为HSC亚型及其在衰老过程中行为变化提供了新的认识1。然而，对胚胎期HSC及其前体细胞的类似研究则更具挑战性。在早期胚胎发育过程中，HSC由一群称为生血性内皮的前体细胞通过一个短暂的过程产生，该过程被称为内皮向造血转变2。在小鼠胚胎中，直到胚胎第10.5天（E10.5）之后，才能检测到具有强大、长期多系植入能力的首个HSC，且其频率极低3。在发育过程中，由生血性内皮产生的HSC前体（pre-HSC）必须经历成熟阶段，才能获得成体HSC的特性，从而在移植实验中实现有效植入4,5,6。由于在HSC从前体细胞出现之前，已可检测到大量具有红系、髓系和淋巴系潜能的造血祖细胞，这使得对稀有HSC起源的研究变得复杂7,8。因此，要区分pre-HSC与其他造血祖细胞，需要采用克隆分离细胞的方法，并提供足以促使其成熟为HSC的信号，以便在移植实验中检测其植入特性。
已描述了多种方法，可通过以下方式实现对前体造血干细胞（pre-HSC）的检测 离体 或 体内 成熟为造血干细胞（HSC）。 离体 方法依赖于胚胎组织（如AGM区）的培养，该区域在发育过程中首次检测到HSC9在这些方法的基础上，通过结合AGM组织的解离、分选和再聚集的实验方案，使得研究人员能够在胚胎发育E9.5至E11.5阶段，对源自腹主动脉旁脏壁中胚层（P-Sp）/AGM区域中含有造血干细胞前体的分选细胞群进行表征。4,5,10；然而，这些方法无法满足克隆分析所需的单细胞水平前体细胞的高通量分析要求。类似地， 体内 通过移植至新生小鼠体内实现成熟，由于新生小鼠的微环境被认为更有利于支持造血干细胞前体的早期阶段，该方法也使得对具有前体造血干细胞特征的卵黄囊和AGM/P-Sp（P-Sp为AGM的前体区域）分选细胞群的研究成为可能，但这些方法同样无法为单细胞分析提供可靠的平台11,12.
Rafii 的研究 等 证明活化的Akt内皮细胞（EC）基质可为成体造血干细胞（HSC）的自我更新提供微环境基质支持 体外13,14,15我们最近发现，来自主动脉-性腺-中肾区域（AGM-EC）的Akt激活型内皮细胞提供了一种适宜的 体外 支持造血前体细胞（早在胚胎发育第9天即可分离）向能够植入成年个体的造血干细胞（HSC）的成熟，以及所生成HSC的后续自我更新的微环境16由于该系统采用简单的二维共培养方式，因此可轻松适用于对单个分离的生血前体细胞进行HSC潜能的克隆分析。
我们近期报道了一种联合方法，通过从小鼠胚胎中对单个造血前体细胞进行索引分选，并结合AGM-EC共培养及后续的移植功能分析，来检测克隆性造血前体细胞的造血干细胞（HSC）潜能17。索引分选是一种荧光激活细胞分选（FACS）模式，可记录（即“索引”）每个单独分选细胞的所有表型参数（即，前向散射（FSC-A）、侧向散射（SSC-A）和荧光参数），从而在分选后将这些特征与后续功能分析进行回溯性关联。FACS软件同时记录每个细胞的表型信息及其被分选至96孔板中的具体位置/孔号。该技术此前已被巧妙地用于鉴定成体HSC的异质性，确定可进一步富集长期植入性HSC亚群的表型参数，并在单细胞水平上将HSC的表型参数与其转录特性相关联18,19。本文中，我们提供了该方法的详细操作流程，可用于识别前体造血干细胞（pre-HSC）在胚胎发育早期阶段的独特表型参数及其谱系贡献。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;AGM-EC 培养基&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;内皮细胞培养材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12605-028</td><td>用于解离 AGM-EC 单层细胞</td></tr><tr><td>0.1% 水溶液明胶</td><td>StemCell Technologies</td><td>7903</td><td>用于使 AGM-EC 单层细胞黏附于塑料表面</td></tr><tr><td>96 孔组织培养板</td><td>Corning</td><td>3599</td><td>用于共培养 AGM-EC 单层细胞与索引分选克隆</td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液 (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>用于解剖及 FACS 染色</td></tr><tr><td>500 ml 滤瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>9741202</td><td>用于无菌过滤内皮细胞培养基</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;AGM-EC 培养基 (500 ml)&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>伊氏改良杜氏培养基 (IMDM)</td><td>Gibco</td><td>12440-053</td><td>400 ml</td></tr><tr><td>Hyclone 胎牛血清</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30088.03</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>肝素</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td>50 mg 溶于 10 ml 培养基中</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺 (200 mM)</td><td>StemCell Technologies</td><td>7100</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>内皮细胞有丝分裂原 (ECGS)</td><td>Alfa Aesar</td><td>J64516 (BT-203)</td><td>加入 10 ml 培养基溶解后添加</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;AGM 索引分选材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>胶原酶 (0.25%)</td><td>StemCell Technologies</td><td>7902</td><td>用于胚胎组织解离</td></tr><tr><td>3 ml 注射器</td><td>BD Biosciences</td><td>309657</td><td>用于无菌过滤 FACS 抗体溶液</td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m 注射器驱动滤器</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td>用于无菌过滤 FACS 抗体溶液</td></tr><tr><td>带细胞滤帽的 5 ml 聚苯乙烯管</td><td>Corning</td><td>352235</td><td>用于 FACS 前去除细胞团块</td></tr><tr><td>DAPI（以 H2O 配制为 1 mg/ml 储存液）</td><td>Millipore</td><td>268298</td><td>用于在分选时排除死细胞</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD16/CD32（FcR 阻断剂）</td><td>BD Biosciences</td><td>553141</td><td>用于阻断 Fc 受体的非特异性染色</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;AGM 索引分选抗体&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 CD144 PE-Cyanine7</td><td>eBioscience</td><td>25-1441-82</td><td>染色</td></tr><tr><td>大鼠 IgG1 κ 同型对照，PE-Cyanine7</td><td>eBioscience</td><td>25-4301-81</td><td>CD144 PE-Cyanine7 的同型对照</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD201 (EPCR) PerCP-eFluor710</td><td>eBioscience</td><td>46-2012-80</td><td>染色</td></tr><tr><td>大鼠 IgG2b κ 同型对照，PerCP-eFlour710</td><td>eBioscience</td><td>46-4031-80</td><td>CD201 PerCP-eFluor710 的同型对照</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD41 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>558040</td><td>染色</td></tr><tr><td>大鼠 IgG1 κ 同型对照，PE</td><td>BD Biosciences</td><td>553925</td><td>CD41 PE 的同型对照</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD45 FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0451-85</td><td>染色</td></tr><tr><td>大鼠 IgG2b κ 同型对照，FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-4031-81</td><td>CD45 FITC 的同型对照</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;AGM 无血清培养基 (10 ml)&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>X-Vivo 20</td><td>Lonza</td><td>04-448Q</td><td>10 ml</td></tr><tr><td>重组小鼠干细胞因子 (SCF)</td><td>Peprotech</td><td>250-03</td><td>10 µl（100 mg/ml 储存液），终浓度 100 ng/ml</td></tr><tr><td>重组人 FLT3 配体 (FLT3L)</td><td>Peprotech</td><td>300-19</td><td>10 µl（100 mg/ml 储存液），终浓度 100 ng/ml</td></tr><tr><td>重组人血小板生成素 (TPO)</td><td>Peprotech</td><td>300-18</td><td>2 µl（100 mg/ml 储存液），终浓度 20 ng/ml</td></tr><tr><td>重组小鼠白细胞介素-3 (IL3)</td><td>Peprotech</td><td>213-13</td><td>2 µl（100 mg/ml 储存液），终浓度 20 ng/ml</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;共培养细胞染色材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 孔 V 型底板</td><td>Corning</td><td>3894</td><td>用于 FACS 分析</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;与内皮细胞共培养的索引分选克隆分析抗体&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 CD45 PerCP-Cyanine5.5</td><td>eBioscience</td><td>45-0451-82</td><td>染色</td></tr><tr><td>大鼠 IgG2b κ 同型对照，PE-Cyanine5.5</td><td>eBioscience</td><td>35-4031-80</td><td>CD45 PerCP-Cyanine5.5 的同型对照</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD201 (EPCR) PE</td><td>eBioscience</td><td>12-2012-82</td><td>染色</td></tr><tr><td>大鼠 IgG2b κ 同型对照，PE</td><td>eBioscience</td><td>12-4031-81</td><td>CD201 PE 的同型对照</td></tr><tr><td>抗小鼠 Ly-6A/E (Sca-1) APC</td><td>eBioscience</td><td>17-5981-83</td><td>染色</td></tr><tr><td>大鼠 IgG2a κ 同型对照，APC</td><td>eBioscience</td><td>17-4321-81</td><td>Ly-6A/E APC 的同型对照</td></tr><tr><td>抗小鼠 F4/80 FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-4801-81</td><td>染色</td></tr><tr><td>大鼠 IgG2a κ 同型对照，FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-4321-41</td><td>F4/80 FITC 的同型对照</td></tr><tr><td>抗小鼠 Ly-6G/C (Gr1) FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>553127</td><td>染色</td></tr><tr><td>大鼠 IgG2b κ 同型对照，FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>556923</td><td>Ly-6G/C 和 CD3 FITC 的同型对照</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;尾静脉移植注射材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1/2 ml 胰岛素注射器，配 29G 1/2&quot; 针头</td><td>BD Biosciences</td><td>309306</td><td>用于尾静脉移植注射</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;移植后外周血分析抗体&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 Ly-6G/C (Gr1) PerCP</td><td>Biolegend</td><td>108426</td><td>染色</td></tr><tr><td>大鼠 IgG2b κ 同型对照，PerCP</td><td>Biolegend</td><td>400629</td><td>Ly-6G/C PerCP 的同型对照</td></tr><tr><td>抗小鼠 F4/80 PE</td><td>eBioscience</td><td>12-4801-82</td><td>染色</td></tr><tr><td>大鼠 IgG2a κ 同型对照，PE</td><td>eBioscience</td><td>12-4321-80</td><td>F4/80 PE 的同型对照</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD3 FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>555274</td><td>染色</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD19 APC</td><td>BD Biosciences</td><td>550992</td><td>染色</td></tr><tr><td>大鼠 IgG2a κ 同型对照，APC</td><td>BD Biosciences</td><td>553932</td><td>CD19 APC 的同型对照</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD45.1 (A20) PE-Cyanine7</td><td>eBioscience</td><td>25-0453-82</td><td>染色</td></tr><tr><td>大鼠 IgG2a κ 同型对照，PE-Cyanine7</td><td>eBioscience</td><td>25-4321-81</td><td>CD45.1 PE-Cyanine7 的同型对照</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD45.2 (104) APC-eFluor780</td><td>eBioscience</td><td>47-0454-82</td><td>染色</td></tr><tr><td>大鼠 IgG2a κ 同型对照，APC-eFluor780</td><td>eBioscience</td><td>47-4321-80</td><td>CD45.2 APC-eFluor780 的同型对照</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria II 配 DIVA 软件</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCanto II 配微孔板读取器</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Fisher Scientific</td><td>S17040</td><td>用于细胞计数</td></tr><tr><td>多通道移液器</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-559-417</td><td>用于加样细胞</td></tr><tr><td>FACS 分析软件</td><td>FlowJo/BD Biosciences</td><td></td><td>https://www.flowjo.com/solutions/flowjo</td></tr></tbody></table>

利用单细胞索引分选联合内皮细胞微环境共培养技术对胚胎造血干细胞前体进行克隆分析

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

在胚胎发育过程中研究造血干细胞（HSC）的生成能力，一直受到早期胚胎中HSC前体细胞极为稀少以及缺乏能够功能性鉴定单个潜在HSC前体细胞长期多系移植潜能的检测方法的限制。本文描述了一种可在单细胞水平上分离和鉴定功能验证的HSC前体细胞的方法。首先，我们采用索引分选技术，对每一个单独分选的细胞，利用一组表型标志物组合记录其精确的表型参数，以富集HSC前体细胞，并附加其他标志物用于实验分析。其次，将每个经索引分选的细胞与来自主动脉-性腺-中肾（AGM）区域的血管微环境基质细胞共培养，该微环境可支持无移植能力的HSC前体细胞成熟为具有多系、长期移植潜能的功能性HSC，这一点可通过移植实验加以验证。该方法能够将克隆性造血前体细胞的表型特征与其功能移植潜能或其他特性（如转录谱）相关联，从而实现对HSC前体细胞在单细胞水平上的发育过程进行深入分析。

图1A展示了实验设计的示意图。在分离、合并并用胶原酶消化P-Sp/AGM组织后，使用VE-Cadherin和EPCR抗体对细胞进行染色，用于索引分选。前体造血干细胞（Pre-HSC）富集于VE-Cadherin+EPCRhigh分选的细胞中（图1B）。也可加入其他荧光染料偶联抗体，以回溯分析额外的表型参数，这些参数在索引分选过程中对每个细胞进行记录。在此来自E11期AGM组织的代表性实验中，细胞还使用了FITC偶联的抗CD45抗体和PE偶联的抗CD41抗体进行染色。在VE-Cadherin+EPCRhigh细胞群体中，可观察到这些造血特异性标志物存在异质性（图1C），这与该发育阶段已知的造血过程不同步性一致5。
<p class="jove_conten...

本文介绍了在小鼠胚胎发育过程中对造血干细胞前体进行克隆分析的方法。我们将来自胚胎主动脉-性腺-中肾区域的单个细胞进行索引分选，结合内皮细胞共培养和移植实验，以表征单个造血前体细胞的表型特征及其植入潜能。

研究造血干细胞（HSC）在胚胎发育过程中生成的能力，一直受限于早期胚胎中HSC前体细胞的稀有性……

本方法的总体目标是在小鼠胚胎发育过程中，鉴定克隆性造血干细胞（HSC）或HSC前体细胞的表型特征及其移植潜能。该方法有助于解答发育性造血领域中的关键问题，即克隆性HSC前体细胞在胚胎发育过程中独特的谱系贡献。该技术的主要优势在于，可在单细胞水平上分析生血性前体细胞。这有助于鉴定出区分稀有造血干细胞前体的独特表型特征。首先，将交配后9.5至11.5天胚胎中分离的主动脉-性腺-中肾区（Aorta-Gonad-Mesonephros, AGM）组织加入预冷的含10毫升PBS（补充10% FBS）的15毫升锥形管中，置于冰上。待组织沉降至管底后，吸除上清液，并立即向样品中加入1毫升0.25%胶原酶。在37摄氏度水浴中孵育25分钟后，加入1毫升含FBS的PBS终止反应，使用1毫升移液枪头将组织吹打20至30次，直至获得单细胞悬液。随后用额外8毫升含FBS的PBS稀释细胞，并通过离心收集细胞。将细胞沉淀重悬于500微升封闭缓冲液中，冰上孵育5分钟。然后加入500微升目标抗体混合液。在冰上孵育15至20分钟后，用8毫升含FBS的PBS洗涤细胞，并将细胞沉淀重悬于1毫升新鲜的含FBS的PBS中。通过35微米细胞筛网将细胞过滤至5毫升离心管中，并用额外的3毫升含FBS的PBS冲洗筛网，以收集全部细胞，随后再次离心细胞。然后将沉淀重悬于500 µL PBS加FBS中，并将细胞置于冰上。为在单细胞和索引分选模式下设置分选门，取少量细胞上样至流式细胞仪，并将采集流速设为最低。打开前向散射面积对侧向散射面积图，设置一个门以包含不同大小的细胞。打开前向散射面积对前向散射宽度图以及侧向散射面积对侧向散射宽度图，并在每个图中设置门控以排除双联体。设置前向散射面积对DAPI图以圈选活细胞。然后创建抗血管内皮钙黏蛋白对抗内皮蛋白C受体图，并圈选血管内皮钙黏蛋白阳性且高表达内皮蛋白C受体的细胞。为了对主动脉-性腺-中肾细胞进行索引分选，将预先在AGM无血清培养基（含细胞因子）中培养了AGM内皮细胞的96孔板放入流式细胞仪的板架中，并加载实验样品。开始采集样品时，确认已选择索引分选单细胞模式，以便将单个细胞分选至96孔板的每个孔中。当每个孔均已分选入一个细胞后，将该板置于设定为37摄氏度和5%CO2的组织培养孵育箱中，培养最多七天。共培养期结束后，可在100倍放大倍数下使用倒置显微镜观察到不同大小和形态的造血克隆。为通过流式细胞术分析克隆，使用多通道移液器将造血细胞从内皮层上解离，注意不要使内皮细胞脱落。随后，将100微升细胞转移至新的96孔V型底板的各个孔中，并将含有剩余100微升细胞的原始96孔板放回组织培养孵育箱中继续培养。通过离心在V型底板中沉淀细胞，并通过快速倒置并轻弹平板的方式移除上清液。在每个孔中加入50 µL封闭缓冲液，在4 °C下重悬沉淀。5分钟后，向每孔加入目标抗体混合物，在4 °C下孵育20分钟。孵育结束后，每孔加入200微升含FBS的PBS洗涤，离心结束后轻弹培养板以弃去上清。将沉淀重悬于50微升含FBS的PBS中，并根据标准流式分析方案分析细胞，以筛选含有具有造血干细胞潜能的克隆。通过流式分析选择含有具有造血干细胞表型细胞的孔，使用多通道移液器将原始共培养体系中剩余的100微升细胞重悬，并向每孔中加入100微升含2% FBS的PBS中含5 × 10⁴个挽救型骨髓细胞。在将每个克隆分别过继转移至致死剂量照射的同源受体动物后，定期采集移植后受体动物的外周血样本。为鉴定具有长期植入能力的克隆，应按照标准流式分析方案对样本进行流式细胞术分析。随后可将每个克隆的表型特征与其植入特性进行关联分析。通过血管内皮钙黏蛋白阳性及内皮蛋白C受体高表达，可富集前体造血干细胞。使用其他荧光染料偶联抗体进行染色，可对分选过程中记录的每个细胞的额外表型参数进行回溯性分析。将细胞经索引分选后接种至主动脉-性腺-中肾区血管内皮细胞共培养体系，单个克隆首先整合入主动脉-性腺-中肾区血管内皮细胞层，随后克隆细胞变圆并形成造血细胞簇。经过五到七天的共培养后，可观察到大小和形态各异的克隆集落。此处展示了共培养后获得的四种不同集落，其中三个集落显示出不同比例的表型造血干细胞以及更多分化细胞类型，而第四个集落则缺乏表达造血干细胞标志物的细胞。通过将克隆细胞的子代进行过继移植，可评估各克隆在长期多谱系植入能力方面的表现，即随时间推移，供体细胞对受体外周血中髓系、B细胞和T细胞区室的贡献情况。尽管大多数含有具有造血干细胞表型细胞的克隆能够实现长期植入，但仍需通过移植来确认其是否具有功能性多谱系植入能力，因为部分克隆会随着时间推移而失去植入能力。随后可将每个克隆的功能性造血干细胞潜能与其原始的索引分选参数进行关联，以确定其精确的表型特征。在此基础上，还可进一步采用其他方法，例如在支持B细胞和T细胞体外发育的基质上对造血子代进行二次培养，以探究单个造血前体细胞的淋巴细胞分化潜能。

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无饲养层和无异种成分的确定性条件下人多能干细胞向造血内皮细胞的分化

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小鼠骨髓造血干细胞与祖细胞及基质微环境细胞的流式细胞术分析

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从人脱落乳牙中分选免疫表型鉴定的间充质干细胞的单细胞分离技术

学习单细胞指数分型与内皮细胞联合培养技术，用于分析小鼠胚胎造血干细胞前体的表型特征与植入潜能。该方法为发育血液学研究提供单细胞水平的克隆分析框架。

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