单细胞指数分型与内皮细胞小生境联合培养对胚胎造血干细胞前体的克隆分析

该方法的总体目标是确定小鼠胚胎发育过程中克隆造血干细胞或 HSC 前体的表型特性和植入潜力。这种方法可以帮助回答发育造血领域关于胚胎发育过程中克隆 HSC 前体独特谱系贡献的关键问题。该技术的主要优点是可以在单细胞水平上分析造血前体。

这允许识别区分稀有 HSC 前体的独特表型特性。首先将主动脉-性腺-中肾 （AGM） 组织（后 9.5 至 11.5 天之间从胚胎中解剖的组织）加入到含有 10 毫升 PBS 的 15 毫升锥形管中，并在冰上补充 10% FBS。当组织沉降到试管底部时，吸出上清液并立即向样品中加入 1 毫升 0.25% 胶原酶。

在 37 摄氏度的水浴中 25 分钟后，用 1 毫升 PBS 加 FBS 终止反应，并使用 1 毫升移液器吸头研磨组织 20 至 30 次，直到获得单细胞悬液。然后用另外 8 毫升 PBS 加 FBS 稀释细胞，并通过离心收集细胞。将沉淀物在 500 μL 封闭缓冲液中，在冰上重悬 5 分钟。

然后加入 500 μL 的目标抗体混合物。在冰上孵育 15 至 20 分钟后，在 8 mL PBS 加 FBS 中洗涤细胞，然后在 1 mL 新鲜 PBS 加 FBS 中重悬沉淀。通过 35 微米的细胞过滤器将细胞过滤到 5 毫升的试管中，再用 3 毫升 PBS 和 FBS 洗涤过滤器，以收集所有细胞并再次离心细胞。

然后将沉淀重悬于 500 微升 PBS 加 FBS 中，并将细胞置于冰上。要在单细胞和索引分选模式下设置分选门，请将一小份细胞加载到流式细胞仪上，并将采集设置为最低流速。打开前向散射区域与侧向散射区域图，并设置一个门以包含不同大小的单元格。

打开一个前向散射区域与前向散点宽度图和一个侧向散射区域与侧向散射宽度图，并在每个图中设置一个门以排除双峰。设置前向散射区域与 DAPI 图以设门活细胞。然后创建抗血管内皮钙粘蛋白与抗内皮蛋白 C 受体图，并设控血管内皮钙粘蛋白阳性和高内皮蛋白 C 受体表达细胞。

为了对主动脉-性腺-中肾细胞进行指数分选，将一个在 AGM 无血清培养基和细胞因子中预培养有 AGM 内皮细胞的 96 孔板放入流式细胞仪的板块中，并加载实验样品。开始样品采集并确认选择了索引分选单细胞模式，以将单个细胞分选到 96 孔板的每个孔中。当一个细胞分选到板的每个孔中后，将板放入设置为 37 摄氏度和 5% CO2 的组织培养箱中长达 7 天。

在共培养期结束时，可以使用倒置显微镜以 100 倍放大倍率观察各种大小和形态的造血集落。要通过流式细胞术分析克隆，请使用多通道移液器将造血细胞与内皮层分离，而无需分离内皮细胞。然后将 100 微升细胞转移到新的 96 孔 V 形底板的各个孔中，并将包含剩余 100 微升细胞的原始 96 孔板放回组织培养箱中。

通过离心将细胞沉淀在 V 形底板中，并通过倒置和轻弹板以单次快速动作去除上清液。在 4 摄氏度下用 50 微升封闭缓冲液将沉淀重悬于每个孔中。5 分钟后，将目标抗体混合物添加到每个孔中，在 4 摄氏度下孵育 20 分钟。

孵育结束时，用 200 微升 PBS 加 FBS 洗涤每个孔，在离心结束时轻弹板以丢弃上清液。将沉淀重悬于 50 μL PBS 加 FBS 中，并根据标准流式分析方案分析细胞，以筛选含有造血干细胞电位的集落。通过流式分析选择含有造血干细胞表型细胞的孔，使用多通道移液器重悬原始共培养物中剩余的 100 微升细胞，并在 100 微升 PBS 中加入 5 乘以 10 的第四个拯救骨髓细胞加 2%FBS。

将每个克隆过继转移到单个致命照射的同源受体动物后，移植后定期从移植动物中收集外周血样本。为了鉴定长期植入的克隆，根据标准流式细胞分析方案通过流式细胞术分析样品。然后，每个克隆的表型特性可以与其植入特性相关联。

血前干细胞可以通过血管内皮钙粘蛋白阳性和高水平的内皮蛋白 C 受体表达来富集。使用其他荧光染料偶联抗体染色可对索引分选期间每个细胞的其他表型参数进行回顾性分析。在索引分选为主动脉-性腺-中肾内皮细胞共培养物后，单个克隆整合到主动脉-性腺-中肾内皮细胞层，然后克隆开始聚集并形成造血簇。

共培养 5 至 7 天后，可检测到各种大小和形态的菌落。在这里，显示了共培养后获得的四个不同的集落，其中三个集落表现出不同比例的表型造血干细胞以及其他更分化的细胞类型，第四个集落缺乏具有造血干细胞标志物表达的细胞。克隆细胞后代的过继转移可以评估供体对受体外周血髓系 B 细胞和 T 细胞区室的贡献后每个克隆的长期多系植入能力。

尽管大多数含有具有造血干细胞表型的细胞的集落实现了长期植入，但移植对于确认功能性多系植入是必要的，因为一些克隆会随着时间的推移而失去植入。然后，可以将每个克隆的功能性造血干细胞潜力与该克隆的原始索引分选参数相关联，以确定其精确的表型特征。在此程序之后，可以执行其他方法，例如在支持体外 B 细胞和 T 细胞发育的基质上进行造血后代的二次培养，以回答有关单个造血前体淋巴细胞潜力的其他问题。