一种针对人乳样本的16S测序方法

本方法的总体目标是利用半自动化流程从人乳及其他低生物量样本中扩增16S rRNA。该方法有助于解答与人体微生物组发育及其在健康与疾病状态下扰动相关的关键科学问题。该技术的主要优势在于其半自动化特性，操作相对简便，并可适用于多种样本类型，包括分泌物、拭子和粪便样本。

根据文本方案解冻并分装全奶后，在 4°C 条件下以 5000 × g 离心 10 分钟，使细胞沉淀。使用塑料刮勺或宽口移液器吸头去除上层脂肪层。然后在不扰动沉淀的前提下，除去所有上清液，仅保留 100 µL。

用一毫升 PBS 重悬并洗涤沉淀。然后通过向一个五毫升离心管中加入一毫升无菌 PBS 来制备阴性对照。将悬液转移至一个洁净的 1.5 毫升离心管中，在室温下以 5000 ×g 离心一分钟。

然后使用1000微升无菌滤芯吸头弃去全部上清脂肪层。为破坏并均质化样品，向沉淀中加入600微升含有β-巯基乙醇的裂解缓冲液，并将悬液转移至珠管中。用裂解缓冲液和20微升细菌模拟样品制备一个阳性对照。

将所有珠管剧烈涡旋振荡15秒。然后在温度可控的涡旋仪上，于37摄氏度、700至800转/分钟条件下加热样品10分钟。将管子装入自动样品破碎仪适配器组中。

然后以30赫兹频率对样品进行1分钟的珠磨处理。拆卸适配器组件，并手动将样品板从仪器的左侧机械臂转移到右侧机械臂。再次以30赫兹频率对试管进行1分钟珠磨处理，随后在25摄氏度条件下以17,200 × g离心3分钟。

使用200微升移液器，小心移除全部上清液，注意不要吸取顶部的脂肪层或底部的磁珠残留物。将上清液加入匀浆柱中。然后在25摄氏度下以最大速度离心柱子3分钟。

将350微升洗脱液转移至一个2毫升的厂家提供的微量离心管中。根据文本方案分离DNA时，剪掉DNA和RNA专用单个离心柱的盖子，并将边缘打磨光滑。将DNA离心柱（不带收集管）插入转子适配器中。

然后弃去收集管。接下来，按照自动DNA/RNA纯化仪器制造商提供的装载图，将经过涡旋振荡的2 mL离心管插入摇床中。标记1.5 mL收集管，并将其插入转子适配器中。

然后根据自动DNA/RNA纯化仪器的装载图，将转子适配器放入离心机中。将滤芯吸头、无RNase水以及试剂插入仪器的试剂块后，关闭仪器盖子，并在仪器上运行自定义的DNA纯化程序。反应完成后，从振荡器中取出含有样本的管子；如有样本剩余，短期保存应置于-20摄氏度，长期保存则应置于-80摄氏度。

根据文本方案准备好工作区域和PCR预混液后，按照96孔板图谱，将50至100微升的DNA样本加入32孔仪器样本适配器中。每块PCR板设置两个阴性对照，方法是用移液器将30微升PCR用水加入洁净的1.5毫升收集管中。然后将所有样本放置在32孔仪器样本适配器上，管盖锁定于打开状态。

在仪器的试剂适配器上，依次取下每个带有特定条形码编号的反向引物管盖。为加载自动液体处理机器人，请将试剂适配器放置于B1位置。为避免边缘效应，小心地将适配器的一边紧贴夹持侧，再缓慢放下另一侧。确保按压适配器的所有四个角，使其完全固定。

将样本适配器放置在 C1 位置，确保按压适配器的所有四个角。然后涡旋振荡 5 毫升主混合液。打开管盖，并将其放置在仪器的主混合液与试剂块的 A 位置。

将PCR板放置在96孔仪器的适配器上，该适配器用于固定半裙边PCR板。然后启动运行，并将其保存为新文件。运行完成后，确认无任何错误发生。

然后使用12孔或8孔条盖密封反应板。充分涡旋振荡，并使用96孔板离心机离心1分钟。最后将反应板置于冰上，直至转移至扩增后操作区并放入热循环仪中。

PCR 扩增后，根据文本方案进行质量控制和文库制备。该方案的第一步质量控制在 16SV4 区域的 PCR 扩增之后进行。如图所示，对每个样本取一微升 PCR 产物，通过电泳分析以确认其片段大小在预期的 350 至 450 个碱基对范围内。

某些人乳样品产生的特定产物量较低，表明这些样品中提取的微生物DNA含量可能较低，或在提取过程中残留了PCR抑制物。对每个样品的特定产物进行定量，对于确定其在等摩尔混合测序时所需的体积至关重要。用于靶向测序的混合文库通常以某一特定PCR产物为主。

如果文库中存在大量非特异性产物，则应在实验流程中增加凝胶纯化步骤。测序结果表明，与人乳微生物组相关的分类群具有高度多样性，并且每个样本的测序读段数存在差异。相比之下，细菌模拟群落（bacterial mock）的分类群组成和读段数与之前实验流程运行中该模拟群落的结果相近，这表明人乳样本中观察到的差异是真实的实验结果，而非实验流程本身固有的变异性所致。

如果让测序仪过夜运行，此技术可在两天内完成，适用于12至24个样本，前提是所有样本均在初次PCR扩增中成功扩增。若未成功，则需要额外一个实验日。在进行该实验时，必须仅从PCR前处理区域前往PCR后处理区域，以避免污染。

频繁更换手套也至关重要，以避免任何交叉污染。切记，处理人类样本可能存在危险，应始终采取预防措施，例如使用适当的个人防护装备和生物安全柜。