同时测定含黄素线粒体脱氢酶产生的超氧阴离子/过氧化氢及NADH
2018年2月24日
线粒体含有多种依赖黄素的酶，这些酶能够产生活性氧（ROS）。由于存在不必要的副反应，监测线粒体内特定位点的活性氧释放具有挑战性。本文介绍一种简便且低成本的方法，利用纯化的黄素酶和微孔板荧光测定法直接评估活性氧释放的天然速率。
本实验的总体目标是利用微孔板荧光测定法，定量检测经纯化的含黄素线粒体脱氢酶的超氧阴离子/过氧化氢以及NADH生成速率。线粒体中可包含多达12种不同的超氧阴离子/过氧化氢生成位点，这些位点已通过使用不同底物和抑制剂组合在分离的线粒体中被鉴定出来。然而，在准确量化分离线粒体中各个生成位点的释放能力方面，仍存在一些困难。
这与产生活性氧的非预期副反应有关，同时也与抗氧化剂的存在、缺乏特异性的抑制剂的使用以及可能干扰检测的添加剂的使用有关。本文介绍了通过纯化的黄素依赖性线粒体脱氢酶同时测定超氧阴离子/过氧化氢和NADH生成的方法。该方法具有优势，因为它能够通过消除非预期的副反应及任何活性氧清除系统，实现对各个活性氧产生位点产生潜力的直接且准确的定量。
同时检测ROS和NADH的生成，还可直接比较不同酶产生超氧阴离子/过氧化氢的潜力与活性，这对于在线粒体实验前筛选抑制ROS生成的化合物具有重要价值。在本研究中，我们将以猪心来源的丙酮酸脱氢酶复合体和α-酮戊二酸脱氢酶复合体为例进行说明。这两种酶均含有黄素辅基，是已知的活性氧来源。
此外，这两种酶易于纯化。通过检测荧光变化，可同时测定超氧阴离子/过氧化氢和 NADH。NADH 具有内在的荧光特性，因此可方便地对其生成进行检测。
检测超氧阴离子/过氧化氢的变化需要使用超氧化物歧化酶、辣根过氧化物酶和Amplex UltraRed试剂。在辣根过氧化物酶和过氧化氢存在的情况下，Amplex UltraRed会从非荧光分子转化为荧光物质试卤灵。超氧化物歧化酶可确保所研究的脱氢酶产生的任何超氧阴离子均被转化为过氧化氢。
在建立检测之前，需先配制工作液。为了简化检测流程，所有试剂均以20微升的等分量加入96孔黑色板的各孔中。每孔反应体系的总体积为200微升，因此工作液的浓度为反应孔中终浓度的10倍。
接下来，设置酶标仪以运行动力学检测程序，同时测量 NADH 的自发荧光和刃天青的荧光。首先选择“程序”并将其设定为 25 摄氏度，然后点击“开始动力学检测”。
设置运行时间约为五分钟，随后选择30秒的荧光读数间隔。接下来，点击“读取”并为您的检测设置荧光测量参数。此处需将探针的位置、用于监测荧光变化的波长以及将要读取的孔位输入软件中。
荧光检测的不同通道也经过选择，其中一个通道专门用于检测NADH的自发荧光，其激发波长设定为376纳米，发射波长为450纳米。在565纳米和600纳米波长下追踪刃天青（resorufin）荧光的变化。一旦建立好检测条件，各个孔中即加入缓冲液以及检测NADH和超氧阴离子/过氧化氢同时生成所需的多种试剂。
加入不同试剂到各孔的顺序如下：首先，向孔中加入所需量的缓冲液，然后加入20微升纯化的酶溶液。随后，将酶在仪器内缓冲液中平衡数分钟。
然后，按以下顺序加入其余试剂。加入底物后，按下“开始”按钮。酶标板载体将进入读板仪，程序随即启动。
在检测过程中，可使用软件实时追踪原始相对荧光单位（RFUs）的输出结果。用户可通过井板布局上方的“数据”选项卡切换不同的荧光读数。请注意，可选择不同荧光读数对应的曲线。
此外，通过按住键盘上的 Control 键并左键单击孔位，可以生成一个复合图，用于实时比较不同反应。实验完成后，微孔板载板将退出仪器。此时，代表荧光相对单位（RFU）变化的图表结果将导出至 Excel。
首先点击代表性RFU图上的“数据”可导出原始RFU值。这将生成一张包含NADH和试卤灵荧光的原始RFU值的表格。注意，与NADH或试卤灵荧光变化相对应的原始RFU数值无法同时导出。
导出结果后，可对其进行分析。利用在开展检测前绘制的标准曲线，可计算随时间生成的NADH（以微摩尔计）以及超氧阴离子/过氧化氢（以皮摩尔计）的量。随后可进一步计算NADH以及超氧阴离子/过氧化氢的生成速率。
进行此实验步骤前，必须检测所分离的含黄素脱氢酶的纯度，方可开展后续分析。可通过简单的考马斯亮蓝蛋白染色，或在不同底物存在下测定酶活性来实现。需要注意的是，建议在分析中避免使用DTT等还原剂，因为它们可作为黄素连接脱氢酶产生超氧阴离子/过氧化氢的底物。
总体而言，该方法具有高度灵活性，既可用于筛选抑制超氧阴离子/过氧化氢生成的物质，也可实现对不同黄素连接的线粒体脱氢酶产生活性氧能力的直接比较。观看本视频后，您应能够熟练掌握如何利用纯化的脱氢酶来检测活性氧和NADH的生成。该检测方法可为后续开展更为复杂的分离线粒体实验提供基础。
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概述
本研究介绍了一种利用微孔板荧光测定法，对纯化的含黄素线粒体脱氢酶产生的超氧阴离子/过氧化氢及NADH生成速率进行定量的方法。该方法解决了测量来自线粒体各个单独位点的活性氧（ROS）释放所面临的技术难题。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物化学
- 线粒体生物学
背景
- 线粒体含有多种依赖黄素的酶，这些酶能够产生活性氧（ROS）。
- 准确量化来自各个位点的活性氧释放量具有较大难度。
- 非特异性副反应以及抗氧化物质的存在使测量过程复杂化。
- 已有研究采用不同的底物与抑制剂组合来鉴定活性氧的产生位点。
研究目的
- 建立一种同时检测超氧阴离子/过氧化氢和NADH生成的方法。
- 消除活性氧定量过程中的非特异性副反应。
- 直接评估线粒体位点产生活性氧的潜力。
使用的方法
- 使用纯化的黄素依赖性线粒体脱氢酶。
- 采用微孔板荧光法进行测量。
- 同时定量检测超氧化物/过氧化氢和NADH。
- 利用特异性抑制剂和底物评估各个产生活性氧的位点。
主要结果
- 该方法可准确量化活性氧（ROS）的生成速率。
- 有效减少了不必要的副反应。
- 成功评估了活性氧（ROS）产生的各个位点。
- 该方法有助于更清晰地理解线粒体活性氧的动态变化。
结论
- 该方法增强了研究线粒体活性氧（ROS）生成的能力。
- 它为研究线粒体功能的研究人员提供了一种可靠的工具。
- 这些发现可能有助于理解细胞中的氧化应激。
常见问题
执行层面的行业相关性
准确量化单个线粒体酶产生的活性氧（ROS）对于氧化应激相关药物发现中的靶点验证至关重要。该方法可直接比较ROS的生成与酶活性，有助于降低黄素连接脱氢酶类靶点的机制性风险。通过消除干扰性的抗氧化系统和副反应，该方法在进行复杂的线粒体或细胞实验之前，为抑制剂筛选提供了可靠的预测依据。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过定量纯化的黄素依赖性脱氢酶的内源性活性氧释放速率，实现对治疗假设的验证。
- 操作价值：通过直接测量单个酶位点产生的超氧阴离子/过氧化氢及NADH，支持生物学层面的风险评估。
- 预测价值：可在进行线粒体实验前，通过筛选抑制剂对活性氧生成的选择性和有效性，助力项目组合的优先级划分。
筛选与检测方法开发
- 检测准备就绪性：通过提供标准化的、定量的活性氧（ROS）和NADH读数，为下游工作流程准备经过验证的生物系统。
- 可重复性：采用微孔板荧光测定法，使用特定的激发/发射波长（NADH：376/450 nm；resorufin：565/600 nm）进行一致的信号检测。
- 可扩展性：可在96孔板格式中以200微升反应体积进行抑制剂的高通量筛选。
转化与临床前研究
- 转化连续性：通过建立活性氧（ROS）与酶之间的基础关系，为后续采用分离线粒体或通透化肌纤维进行更复杂的实验提供过渡基础。
- 疾病相关体系：采用猪心来源的丙酮酸脱氢酶复合体（PDHC）和α-酮戊二酸脱氢酶复合体（KGDHC）作为模型，研究与代谢性疾病及心血管疾病相关的线粒体活性氧来源。
- 机制性风险排除：明确所观察到的活性氧变化是否源于靶向酶活性，而非脱靶效应或抗氧化剂干扰所致。
流程与工作流整合
该方法适用于从早期靶点验证到先导化合物发现的整个研究流程，可在推进至复杂的表型筛选或临床前模型之前，提供定量的活性氧（ROS）和活性数据，以支持决策判断。
- 发现生物学：通过分离特定黄素连接脱氢酶产生的活性氧（ROS），在通路分析中减少机制上的模糊性，支持假设验证。
- 筛选：通过标准化地同时检测NADH自荧光和试卤灵荧光，实现即用型检测，从而可靠评估化合物。
- 分析：生成定量输出结果（以微摩尔计的NADH，以及随时间变化的以皮摩尔计的超氧阴离子和过氧化氢），可用于计算不同条件下的生成速率并进行比较分析。
- 转化研究：在完整线粒体系统测试前，先明确单个酶的内源性ROS释放速率，从而将基础发现与临床前研究衔接起来。
- 企业级复用：建立可重复使用的平台，用于跨项目筛选黄素依赖性酶靶点，减少重复的检测方法开发。
运营与企业影响
- 科学价值：通过降低活性氧来源归因中的机制模糊性，提高靶点验证的预测可信度。
- 操作价值：通过明确的试剂添加顺序、动力学参数设置和荧光通道分离，确保实验的标准化与可重复性。
- 战略价值：通过实现早期抑制剂筛选，减少因未预期的活性氧介导毒性导致的后期研发失败，提升资本使用效率。
- 项目组合影响：通过量化各个酶位点产生活性氧的潜力，支持基于风险调整的靶点优先级排序，为靶点选择与推进决策提供依据。
实施注意事项
- 需要具备酶纯化和荧光测定建立方面的专业知识，包括通过考马斯亮蓝染色或活性测定验证含黄素脱氢酶的纯度。
- 依赖于能够进行双波长动力学读数（NADH 为 376/450 nm，刃天青为 565/600 nm）且可在 25°C 下控温的酶标仪。
- 必须排除还原剂（如 DTT）的使用，因其可作为超氧阴离子/过氧化氢生成的底物，干扰实验结果。
- 由于在 96 孔板中每孔加入 20 微升等分试样，最终体积为 200 微升，因此需将工作液配制成 10 倍浓度。
- 存在实际限制，例如需使用超氧化物歧化酶将超氧阴离子转化为过氧化氢，以便通过Amplex UltraRed/辣根过氧化物酶系统进行检测。
