Name: 含黄素线粒体脱氢酶同时测定超氧化物/过氧化氢和 NADH 生产 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: 学习使用微孔板荧光法同时测定纯化含黄素线粒体脱氢酶产生的超氧化物/过氧化氢和NADH生成速率。该方法可消除副反应干扰，准确评估线粒体活性氧产生位点的潜力，为研究氧化应激和线粒体功能提供可靠工具。

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本工作由加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）资助。视频制作由纽芬兰纪念大学教学创新中心（CITL）协作完成。

1. 化学品与纯化酶
<ol>
	<li>准备以下材料：猪心脏来源的丙酮酸脱氢酶复合物（PDHC）和α-酮戊二酸脱氢酶复合物（KGDHC）（或其他纯化的线粒体黄素酶）；H2O2（30% 溶液）、丙酮酸、α-酮戊二酸、NAD+、NADH、CoASH、硫胺素焦磷酸（TPP）、甘露醇、HEPES、蔗糖、EGTA、3-甲基-2-氧代戊酸（KMV）、超氧化物歧化酶（SOD）、辣根过氧化物酶（HRP）、10-乙酰基-3,7-二羟基吩噁嗪试剂（AUR）以及 CPI-613。</li>
</ol>
2. 实验设计与试剂准备
<ol>
	<li>按照表1在96孔板中建立检测体系。 
	注意：每个反应的总体积为200 µL。调整储备液浓度，使每孔加入20 µL试剂。这可确保在启动检测前快速向每个反应孔中加入辅因子和底物。</li>
	<li>配制含有220 mM甘露醇、70 mM蔗糖、1 mM EGTA和20 mM HEPES（用HCl调节pH至7.4）的反应缓冲液。 
	注意：根据不同的纯化酶的物理性质，此缓冲液成分可能需要调整。</li>
	<li>通过酶活性检测14,16,17，或通过免疫印迹或考马斯亮蓝染色5，检查纯化的KGDHC或PDHC是否存在污染。</li>
	<li>根据表1中的工作液浓度，用反应缓冲液配制所有试剂。</li>
	<li>将所有试剂以1 mL分装于-20 °C保存。将丙酮酸和α-酮戊二酸以100 µL分装于-80 °C保存，以防止因自氧化和反复冻融导致的自发降解。</li>
	<li>将AUR试剂母液溶于1 mL DMSO中，然后用反应缓冲液稀释至100 µM。避光保存。 
	注意：此处的100 µM工作液每2至3周新鲜配制一次，并始终避光保存。</li>
</ol>
3. 建立检测模板
<ol>
	<li>在具有双波长测量功能的单色微孔板读数仪上建立检测程序。</li>
	<li>通过选择定义读取程序 &#34;实验方案&#34;然后点击 &#34;实验步骤&#34;.</li>
	<li>设置 &#34;温度&#34; 至 25 °C（图1A).</li>
	<li>点击 &#34;起始动力学&#34; 设置读取条件（图1A设置读取时间间隔/实验的次数和时间。</li>
	<li>点击 &#34;阅读&#34; (图1B). 
	注意：样品从顶部位置读取，增益为50。时间：5分钟，每30秒读取一次。通道1：Resorufin荧光——激发/发射波长 = 565 nm:600 nm，波长带宽为13.5 nm。通道2：NADH自发荧光——激发/发射波长 = 376 nm:450 nm，波长带宽为20 nm。</li>
	<li>下 &#34;阅读&#34;，选择需要监测的孔例如，A1-A4 和 B1-B4）。</li>
	<li>选择 &#34;终末动力学&#34;.</li>
</ol>
4. 标准曲线
<ol>
	<li>将试剂解冻并置于冰上保存，直至使用。</li>
	<li>NADH 标准曲线（图 2A）
	<ol>
		<li>用反应缓冲液配制浓度范围为 0.5–10 mM 的 NADH 工作液。</li>
		<li>从每种 NADH 工作液中取 20 µL 加入含 180 µL 反应缓冲液的孔中。每孔中 NADH 的终浓度为 0.05–1 mM。</li>
		<li>点击 &#34;READ&#34;，设置激发/发射波长 = 376 nm:450 nm，带宽为 20 nm。 
		注意：仅进行终点读数，无需动力学参数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>AUR 标准曲线（图 2B）
	<ol>
		<li>用反应缓冲液配制过氧化氢工作液，其浓度范围为 200–4,000 nM。</li>
		<li>向每个孔中加入 120 µL 反应缓冲液。</li>
		<li>向每个含反应缓冲液的孔中加入 20 µL HRP（工作液浓度 = 30 U/mL，孔中终浓度 = 3 U/mL）、20 µL SOD（工作液浓度 = 250 U/mL，孔中终浓度 = 25 U/mL）和 20 µL AUR（工作液浓度 = 100 µM，孔中终浓度 = 10 µM）。</li>
		<li>向每个含有缓冲液和检测试剂的孔中加入 20 µL 不同浓度的 H2O2 工作液。最终反应体积为 200 µL，每孔中 H2O2 的终浓度为 20–400 nM。</li>
		<li>将酶标板在酶标仪中 25 °C 下孵育 1 分钟。</li>
		<li>点击 &#34;READ&#34;，设置激发/发射波长 = 565 nm/600 nm，带宽为 13.5 nm。注意：仅进行终点读数，无需动力学参数。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 测定KGDHC和PDHC释放的O2 ●-/H2O2及NADH的生成
<ol>
	<li>不同试剂的添加顺序、各工作液的浓度以及每孔添加的体积详见表1。</li>
	<li>向每孔中加入40 µL反应缓冲液。对于使用KMV或CPI-613的实验，每孔加入20 µL缓冲液。</li>
	<li>向每孔中加入20 µL PDHC或KGDHC（工作储备液浓度为1 U/mL，每孔终浓度 = 0.1 U/mL）。</li>
	<li>在25 °C下孵育PDHC和KGDHC 2分钟。</li>
	<li>向每孔加入20 µL KMV（工作储备液浓度 = 100 mM，终浓度 = 10 mM）或20 µL CPI-613（工作储备液浓度 = 1.5 mM，终浓度 = 150 µM）（表2）。 
	注意：若实验中不使用抑制剂，可省略此步骤。</li>
	<li>在25 °C下孵育1分钟。 
	注意：若实验中不使用抑制剂，可省略此步骤。</li>
	<li>向每孔中加入20 µL HRP（工作储备液浓度 = 30 单位/mL，孔内终浓度 = 3 单位/mL）和20 µL SOD（工作储备液浓度 = 250 单位/mL，孔内终浓度 = 25 单位/mL）。</li>
	<li>向每孔中加入20 µL辅酶A（工作储备液浓度 = 1 mM，终浓度 = 0.1 mM）、20 µL TPP（工作储备液浓度 = 3 mM，终浓度 = 0.3 mM）和20 µL NAD+（工作储备液浓度 = 10 mM，终浓度 = 1 mM）。</li>
	<li>将AUR试剂从避光铝箔中取出，向每孔加入20 µL。</li>
	<li>向含有PDHC的孔中加入20 µL丙酮酸（工作储备液浓度范围为1–100 mM，实验终浓度 = 0.1–10 mM），向含有KGDHC的孔中加入20 µL α-酮戊二酸（工作储备液浓度范围为1–100 mM，实验终浓度 = 0.1–10 mM）。</li>
	<li>点击 &#34;READ&#34; 开始动力学测定。</li>
</ol>
6. 数据分析
<ol>
	<li>按住键盘上的“CTRL”键，然后点击孔位，生成包含通道1所有动力学测量数据的图表（图3A）。</li>
	<li>在右上角视图图标中点击&#34;数据&#34;，以查看在不同时间点测得的相对荧光单位（RFU）原始值（图3B）。</li>
	<li>导出数据用于分析（表3）。</li>
	<li>点击右上角的&#34;图表&#34;下拉菜单（图3B），查看与荧光通道2相关的RFU值。</li>
	<li>对通道2重复步骤6.1至6.3。</li>
</ol>

<ol><li>Mailloux, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teaching+the+fundamentals+of+electron+transfer+reactions+in+mitochondria+and+the+production+and+detection+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Teaching the fundamentals of electron transfer reactions in mitochondria and the production and detection of reactive oxygen species.</a> Redox Biol. 4, 381-398 (2015).</li>
<li>Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forty+years+of+Mitchell%27s+proton+circuit%3A+From+little+grey+books+to+little+grey+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Forty years of Mitchell's proton circuit: From little grey books to little grey cells.</a> Biochim Biophys Acta. 1777 (7-8), 550-556 (2008).</li>
<li>Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+generation+of+superoxide+and+hydrogen+peroxide+as+the+source+of+mitochondrial+redox+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial generation of superoxide and hydrogen peroxide as the source of mitochondrial redox signaling.</a> Free Radic Biol Med. 100, 14-31 (2016).</li>
<li>Massey, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+molecular+oxygen+by+flavins+and+flavoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Activation of molecular oxygen by flavins and flavoproteins.</a> J Biol Chem. 269 (36), 22459-22462 (1994).</li>
<li>Mailloux, R. J., Gardiner, D., O'Brien, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2-Oxoglutarate+dehydrogenase+is+a+more+significant+source+of+O2%28.-%29%2FH2O2+than+pyruvate+dehydrogenase+in+cardiac+and+liver+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">2-Oxoglutarate dehydrogenase is a more significant source of O2(.-)/H2O2 than pyruvate dehydrogenase in cardiac and liver tissue.</a> Free Radic Biol Med. 97, 501-512 (2016).</li>
<li>Sies, H., Berndt, C., Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Oxidative Stress.</a> Annu Rev Biochem. 86, 715-748 (2017).</li>
<li>Kuksal, N., Chalker, J., Mailloux, R. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28675747">Review. Progress in understanding the molecular oxygen paradox - function of mitochondrial reactive oxygen species in cell signaling.</a> Biol Chem. , (2017).</li>
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<li>Tretter, L., Adam-Vizi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+reactive+oxygen+species+in+the+reaction+catalyzed+by+alpha-ketoglutarate+dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Generation of reactive oxygen species in the reaction catalyzed by alpha-ketoglutarate dehydrogenase.</a> J Neurosci. 24 (36), 7771-7778 (2004).</li>
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<li>O'Brien, M., Chalker, J., Slade, L., Gardiner, D., Mailloux, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+S-glutathionylation+alters+superoxide%2Fhydrogen+peroxide+emission+from+pyruvate+dehydrogenase+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Protein S-glutathionylation alters superoxide/hydrogen peroxide emission from pyruvate dehydrogenase complex.</a> Free Radic Biol Med. 106, 302-314 (2017).</li>
<li>Quinlan, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+2-oxoacid+dehydrogenase+complexes+in+mitochondria+can+produce+superoxide%2Fhydrogen+peroxide+at+much+higher+rates+than+complex+I%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The 2-oxoacid dehydrogenase complexes in mitochondria can produce superoxide/hydrogen peroxide at much higher rates than complex I.</a> J Biol Chem. 289 (12), 8312-8325 (2014).</li>
<li>Mailloux, R. J., Craig Ayre, D., Christian, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+mitochondrial+reactive+oxygen+species+production+by+GSH+mediated+S-glutathionylation+of+2-oxoglutarate+dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Induction of mitochondrial reactive oxygen species production by GSH mediated S-glutathionylation of 2-oxoglutarate dehydrogenase.</a> Redox Biol. 8, 285-297 (2016).</li>
<li>Mailloux, R. J., Gardiner, D., O'Brien, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2-Oxoglutarate+dehydrogenase+is+a+more+significant+source+of+O2%28.-%29%2FH2O2+than+pyruvate+dehydrogenase+in+cardiac+and+liver+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">2-Oxoglutarate dehydrogenase is a more significant source of O2(.-)/H2O2 than pyruvate dehydrogenase in cardiac and liver tissue.</a> Free Radic Biol Med. 97, 501-512 (2016).</li>
<li>Ambrus, A., Adam-Vizi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+dihydrolipoamide+dehydrogenase+%28E3%29+deficiency%3A+Novel+insights+into+the+structural+basis+and+molecular+pathomechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Int%22%5BJournal%5D)">Human dihydrolipoamide dehydrogenase (E3) deficiency: Novel insights into the structural basis and molecular pathomechanism.</a> Neurochem Int. , (2017).</li>
<li>Young, A., Gardiner, D., Brosnan, M. E., Brosnan, J. T., Mailloux, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+levels+of+formate+activate+mitochondrial+superoxide%2Fhydrogen+peroxide+release+from+mouse+liver+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Physiological levels of formate activate mitochondrial superoxide/hydrogen peroxide release from mouse liver mitochondria.</a> FEBS Lett. 591 (16), 2426-2438 (2017).</li>
<li>Fisher-Wellman, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+glutathione+depletion+reveals+a+novel+role+for+the+pyruvate+dehydrogenase+complex+as+a+key+H2O2-emitting+source+under+conditions+of+nutrient+overload%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial glutathione depletion reveals a novel role for the pyruvate dehydrogenase complex as a key H2O2-emitting source under conditions of nutrient overload.</a> Free Radic Biol Med. 65, 1201-1208 (2013).</li>
<li>Kussmaul, L., Hirst, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+superoxide+production+by+NADH%3Aubiquinone+oxidoreductase+%28complex+I%29+from+bovine+heart+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The mechanism of superoxide production by NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) from bovine heart mitochondria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (20), 7607-7612 (2006).</li>
<li>Huang, L. S., Borders, T. M., Shen, J. T., Wang, C. J., Berry, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+of+mitochondrial+respiratory+complex+II+from+chicken+heart%3A+a+membrane-protein+complex+diffracting+to+2.0%5BTitle%5D)+AND+%22A.+Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Crystallization of mitochondrial respiratory complex II from chicken heart: a membrane-protein complex diffracting to 2.0.</a> A. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (Pt 4), 380-387 (2005).</li>
<li>Yeh, J. I., Chinte, U., Du, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+glycerol-3-phosphate+dehydrogenase%2C+an+essential+monotopic+membrane+enzyme+involved+in+respiration+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Structure of glycerol-3-phosphate dehydrogenase, an essential monotopic membrane enzyme involved in respiration and metabolism.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3280-3285 (2008).</li>
</ol>

无任何利益冲突需要披露。

该方案具有以下优势：1）消除了可能干扰H的任何竞争性反应2O2 检测例如，抗氧化系统或其他活性氧来源），2）可直接评估含黄素的线粒体脱氢酶在天然状态下的活性氧释放速率，3）允许比较两种或多种纯化的基于黄素的脱氢酶在天然状态下的活性氧释放速率，4）可实现活性氧释放速率与酶活性的直接比较，5）可用于筛选对活性氧释放具有选择性竞争性抑制作用的抑制剂。本课题组及其他研究团队已在先前发表的研究中使用该方法，在开展线粒体或透化肌肉实验之前，探究别构调节和氧化还原信号通路对活性氧生成的调控作用14,16,17,19,20.
修改与故障排除：
<p class="jove_...

营养代谢的最终目标是生成三磷酸腺苷（ATP）。在哺乳动物细胞中，这一过程发生于线粒体——一种具有双层膜结构的细胞器，可将碳中储存的能量转化为ATP。ATP的生成始于线粒体对碳的氧化，产生两种电子载体：NADH和黄素腺嘌呤二核苷酸（FADH₂）。2)1NADH 和 FADH2 随后分别被多亚基呼吸复合物I和II氧化，释放出的电子被传递至最终电子受体分子氧（O₂）。2复合体 IV1热力学上有利的 &#34;下坡&#34; 电子向O的转移2 在电子传递链末端，复合物I、III和IV将质子泵入膜间隙，从而建立跨膜的质子电化学梯度（质子驱动力），这是一种暂时储存的吉布斯自由能，可被复合物V利用以合成ATP。2线粒体中的电子传递反应与ATP生成并非完全偶联。在三羧酸循环和呼吸链的多个位点，电子可能提前与O₂发生相互作用2 形成活性氧（ROS）3. 线粒体产生的最具生物学意义的活性氧是O2●- 和 H2O2尽管 O2●- 通常被认为是由线粒体产生的初级活性氧（ROS），目前的研究表明其生成位点会产生混合的O₂·⁻2●- 和 H2O2，这与黄素辅基的自由基化学相关4,5高水平时，活性氧可能具有危险性，会损伤细胞功能所必需的生物组分，导致氧化应激6然而，在低浓度时，线粒体活性氧具有重要的信号传导功能。例如，H2O2 线粒体释放已被认为在调控T细胞活化和应激信号传导中起重要作用（例如，Nrf2 信号通路的激活、细胞增殖与分化的诱导、胰岛素信号传导与释放，以及摄食行为7在理解活性氧（ROS）的信号功能方面已取得显著进展。然而，关于线粒体中哪些酶是最重要来源以及其产生如何被调控等问题，仍尚待明确。
活性氧（ROS）在产生位点的释放取决于多个因素：1）电子供体位点的浓度，2）电子供体位点的氧化还原状态，3）对氧气的可及性，以及4）氧化底物的浓度和类型3,8,9。在线粒体中，其他因素如NADH浓度和膜电位强度也会影响ROS的生成8,10。例如，纯化的丙酮酸脱氢酶复合体（PDHC）或α-酮戊二酸脱氢酶复合体（KGDHC）产生O2●-/H2O2的速率随着NADH可用性的增加而升高5,11。在此情况下，电子从NADH逆向流向PDHC或KGDHC的E3亚基中的FAD中心，该位点即为O2●-/H2O2的产生位点12。类似地，提供NAD+则具有相反效果，可降低KGDHC释放ROS12。因此，调控电子进入或离开ROS产生位点的过程，能够改变所形成的O2●-/H2O2的量。例如，使用脂酸类似物CPI-613阻断PDHC或KGDHC的E2亚基，可使O2●-/H2O2的生成减少近90%13。使用化学性S-谷胱甘肽化催化剂——二酰胺（diamide）和二硫仑（disulfiram），通过将谷胱甘肽共价连接至E2亚基，几乎完全抑制PDHC或KGDHC的O2●-/H2O2生成，也可获得类似结果14。阻断PDHC和KGDHC中E2亚基的电子传递的代价是NADH生成减少，从而削弱电子传递链（例如，复合体III）介导的ROS形成。这还可能导致电子传递链的ATP输出下降。总体而言，阻断电子进入ROS产生位点是控制O2●-/H2O2生成的一种极为有效的方法。
线粒体可能含有最多12个潜在的O2●-/H2O2来源6。其中大多数位点是含黄素的酶，可产生O2●-和H2O2的混合物。通过使用不同的底物和抑制剂组合，已能够鉴定出在不同组织中哪些呼吸复合物和线粒体脱氢酶是高产能的O2●-/H2O2生成位点3。已有研究表明，丙酮酸脱氢酶复合体（PDHC）和α-酮戊二酸脱氢酶复合体（KGDHC）在肌肉和肝脏线粒体中是高产能的O2●-/H2O2释放位点13,15。然而，在研究线粒体内各个位点产生O2●-/H2O2的潜力，以及不同底物和抑制剂组合对酶活性影响方面，仍存在一些困难。这主要是由于存在非特异性副反应（例如，除目标酶以外的其他位点产生O2●-/H2O2）、内源性营养物质（例如，脂肪酸）或细胞器（例如，过氧化物酶体，其也能生成O2●-/H2O2）的污染，以及所用抑制剂缺乏选择性，和/或所用化合物无法完全抑制活性氧（ROS）的生成。某些抑制剂还可能改变线粒体的生物能量状态和电子传递方向，从而改变其他产生活性氧位点的释放水平，干扰实验结果。此外，由于线粒体基质和膜间隙中含有高浓度的O2●-和H2O2清除酶，因此难以准确定量各个位点释放O2●-/H2O2的绝对速率。因此，在鉴定高产能O2●-/H2O2生成位点时，消除可能干扰O2●-/H2O2释放测定的任何竞争性反应将具有重要意义。
本文介绍一种简单的方法，可用于同时检测经纯化的黄素依赖性脱氢酶产生的 O2●-/H2O2 以及 NADH 的生成情况。通过使用纯化的酶，可消除非特异性活性氧（ROS）生成的副反应及降解 ROS 的酶类干扰，从而更准确地测定单个黄素酶固有的 O2●-/H2O2 生成速率。该方法可用于直接比较不同纯化脱氢酶在生成 O2●-/H2O2 方面的能力，或用于筛选针对 O2●-/H2O2 释放的潜在特异性抑制剂。最后，通过同时测定 O2●-/H2O2 和 NADH 的生成，可实时评估酶活性与活性氧释放能力之间的关系。

<table><tbody><tr><td>丙酮酸脱氢酶复合体</td><td>SIGMA</td><td>P7032-10UN</td><td>纯化的黄素酶</td></tr><tr><td>α-酮戊二酸脱氢酶复合体</td><td>SIGMA</td><td>K1502-20UN</td><td>纯化的黄素酶</td></tr><tr><td>30% 过氧化氢溶液</td><td>SIGMA</td><td>HX0640-5</td><td>试剂，用于标准曲线</td></tr><tr><td>NAD+</td><td>SIGMA</td><td>N0632-1G</td><td>试剂，用于活性/ROS释放检测</td></tr><tr><td>NADH</td><td>SIGMA</td><td>N4505-100MG</td><td>试剂，用于标准曲线</td></tr><tr><td>丙酮酸</td><td>SIGMA</td><td>P2256-5G</td><td>试剂，用于活性/ROS释放检测</td></tr><tr><td>α-酮戊二酸</td><td>SIGMA</td><td>75892-25G</td><td>试剂，用于活性/ROS释放检测</td></tr><tr><td>CoASH</td><td>SIGMA</td><td>C3019-25MG</td><td>试剂，用于活性/ROS释放检测</td></tr><tr><td>硫胺素焦磷酸</td><td>SIGMA</td><td>C8754-1G</td><td>试剂，用于活性/ROS释放检测</td></tr><tr><td>甘露醇</td><td>SIGMA</td><td>M4125-100G</td><td>缓冲液组分</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>SIGMA</td><td>H3375-25G</td><td>缓冲液组分</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>SIGMA</td><td>S7903-250G</td><td>缓冲液组分</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>SIGMA</td><td>E3889-10G</td><td>缓冲液组分</td></tr><tr><td>KMV</td><td>SIGMA</td><td>198978-5G</td><td>试剂，ROS释放抑制剂</td></tr><tr><td>CPI-613</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-482709</td><td>试剂，ROS释放抑制剂</td></tr><tr><td>SOD</td><td>SIGMA</td><td>S9697-15KU</td><td>试剂，ROS释放检测</td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶</td><td>SIGMA</td><td>P8375-1KU</td><td>试剂，ROS释放检测</td></tr><tr><td>Amplex Ultra Red</td><td>Thermofisher</td><td>A36006</td><td>试剂，ROS释放检测</td></tr><tr><td>Biotech Synergy 2 微孔板读板仪</td><td>BioTek Instruments</td><td></td><td>用于检测的微孔板读板仪</td></tr><tr><td>Gen5 软件</td><td>BioTek Instruments</td><td></td><td>软件，用于原始RFU数据采集</td></tr><tr><td>Graphpad Prism</td><td>Graphpad software</td><td></td><td>软件，数据分析</td></tr><tr><td>Microsoft EXCEL</td><td>Microsoft</td><td></td><td>软件，数据分析</td></tr></tbody></table>

同时测定含黄素线粒体脱氢酶产生的超氧阴离子/过氧化氢及nadh

Simultaneous Measurement of Superoxide/Hydrogen Peroxide and NADH Production by Flavin-containing Mitochondrial Dehydrogenases

据报道，线粒体中可能含有多达12种产生活性氧（ROS）的酶来源。其中大多数位点包括依赖黄素的呼吸复合物和脱氢酶，它们可产生超氧阴离子（O2●-）和过氧化氢（H2O2）的混合物。由于抗氧化防御系统&#160;以及同样可生成O2●-/H2O2的副反应的存在，准确量化分离线粒体中各个位点的ROS生成潜力具有挑战性。使用可能破坏线粒体生物能量学的非特异性抑制剂也可能通过改变其他产生位点的ROS释放而影响测量结果&#160;&#160;。本文介绍了一种简便的方法，可用于同时测定经纯化的黄素连接脱氢酶释放H2O2和生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的能力。在本研究中，我们以猪心来源的纯化丙酮酸脱氢酶复合物（PDHC）和α-酮戊二酸脱氢酶复合物（KGDHC）为例进行说明。该方法可通过消除其他潜在的ROS来源及抗氧化系统，准确测定各个产生位点固有的H2O2释放速率。此外，该方法还可直接比较H2O2释放与酶活性之间的关系，并可用于筛选抑制剂在抑制ROS生成方面的有效性与选择性。总体而言，该方法可在开展更复杂的分离线粒体或透化肌纤维实验之前，对单个酶固有的ROS释放速率进行深入评估。

图3A 展示了通过纯化的KGDHC同时检测H2O2和NADH生成时所获得的RFU代表性曲线。图3B 显示了每个时间间隔的原始RFU数据。随后将原始RFU数据导出用于分析。通过外推图2中所示的标准曲线，可确定在5分钟期间内每个测量时间点生成的NADH和H2O2的绝对量。表3 提供了该计算方法的一个示例。一旦确定了KGDHC或PDHC在不同时间点生成的NADH和H2O2的量，即可将这些数值复制并输入图形/统计分析软件进行进一步分析。采用XY图类型分析，可将KGDHC或PDHC生成的NADH（µmol）和H2O2（pmol）随时间的变化绘制成图（图4A<...

线粒体含有多种依赖黄素的酶，这些酶能够产生活性氧（ROS）。由于存在不必要的副反应，监测线粒体内特定位点的活性氧释放具有挑战性。本文介绍一种简便且低成本的方法，利用纯化的黄素酶和微孔板荧光测定法直接评估活性氧释放的天然速率。

同时测定含黄素线粒体脱氢酶产生的超氧阴离子/过氧化氢及NADH

据报道，线粒体可能含有多达12种活性氧（ROS）的酶来源。其中大多数位点包括……

本实验的总体目标是利用微孔板荧光测定法，定量检测经纯化的含黄素线粒体脱氢酶的超氧阴离子/过氧化氢以及NADH生成速率。线粒体中可包含多达12种不同的超氧阴离子/过氧化氢生成位点，这些位点已通过使用不同底物和抑制剂组合在分离的线粒体中被鉴定出来。然而，在准确量化分离线粒体中各个生成位点的释放能力方面，仍存在一些困难。这与产生活性氧的非预期副反应有关，同时也与抗氧化剂的存在、缺乏特异性的抑制剂的使用以及可能干扰检测的添加剂的使用有关。本文介绍了通过纯化的黄素依赖性线粒体脱氢酶同时测定超氧阴离子/过氧化氢和NADH生成的方法。该方法具有优势，因为它能够通过消除非预期的副反应及任何活性氧清除系统，实现对各个活性氧产生位点产生潜力的直接且准确的定量。同时检测ROS和NADH的生成，还可直接比较不同酶产生超氧阴离子/过氧化氢的潜力与活性，这对于在线粒体实验前筛选抑制ROS生成的化合物具有重要价值。在本研究中，我们将以猪心来源的丙酮酸脱氢酶复合体和α-酮戊二酸脱氢酶复合体为例进行说明。这两种酶均含有黄素辅基，是已知的活性氧来源。此外，这两种酶易于纯化。通过检测荧光变化，可同时测定超氧阴离子/过氧化氢和 NADH。NADH 具有内在的荧光特性，因此可方便地对其生成进行检测。检测超氧阴离子/过氧化氢的变化需要使用超氧化物歧化酶、辣根过氧化物酶和Amplex UltraRed试剂。在辣根过氧化物酶和过氧化氢存在的情况下，Amplex UltraRed会从非荧光分子转化为荧光物质试卤灵。超氧化物歧化酶可确保所研究的脱氢酶产生的任何超氧阴离子均被转化为过氧化氢。在建立检测之前，需先配制工作液。为了简化检测流程，所有试剂均以20微升的等分量加入96孔黑色板的各孔中。每孔反应体系的总体积为200微升，因此工作液的浓度为反应孔中终浓度的10倍。接下来，设置酶标仪以运行动力学检测程序，同时测量 NADH 的自发荧光和刃天青的荧光。首先选择“程序”并将其设定为 25 摄氏度，然后点击“开始动力学检测”。设置运行时间约为五分钟，随后选择30秒的荧光读数间隔。接下来，点击“读取”并为您的检测设置荧光测量参数。此处需将探针的位置、用于监测荧光变化的波长以及将要读取的孔位输入软件中。荧光检测的不同通道也经过选择，其中一个通道专门用于检测NADH的自发荧光，其激发波长设定为376纳米，发射波长为450纳米。在565纳米和600纳米波长下追踪刃天青（resorufin）荧光的变化。一旦建立好检测条件，各个孔中即加入缓冲液以及检测NADH和超氧阴离子/过氧化氢同时生成所需的多种试剂。加入不同试剂到各孔的顺序如下：首先，向孔中加入所需量的缓冲液，然后加入20微升纯化的酶溶液。随后，将酶在仪器内缓冲液中平衡数分钟。然后，按以下顺序加入其余试剂。加入底物后，按下“开始”按钮。酶标板载体将进入读板仪，程序随即启动。在检测过程中，可使用软件实时追踪原始相对荧光单位（RFUs）的输出结果。用户可通过井板布局上方的“数据”选项卡切换不同的荧光读数。请注意，可选择不同荧光读数对应的曲线。此外，通过按住键盘上的 Control 键并左键单击孔位，可以生成一个复合图，用于实时比较不同反应。实验完成后，微孔板载板将退出仪器。此时，代表荧光相对单位（RFU）变化的图表结果将导出至 Excel。首先点击代表性RFU图上的“数据”可导出原始RFU值。这将生成一张包含NADH和试卤灵荧光的原始RFU值的表格。注意，与NADH或试卤灵荧光变化相对应的原始RFU数值无法同时导出。导出结果后，可对其进行分析。利用在开展检测前绘制的标准曲线，可计算随时间生成的NADH（以微摩尔计）以及超氧阴离子/过氧化氢（以皮摩尔计）的量。随后可进一步计算NADH以及超氧阴离子/过氧化氢的生成速率。进行此实验步骤前，必须检测所分离的含黄素脱氢酶的纯度，方可开展后续分析。可通过简单的考马斯亮蓝蛋白染色，或在不同底物存在下测定酶活性来实现。需要注意的是，建议在分析中避免使用DTT等还原剂，因为它们可作为黄素连接脱氢酶产生超氧阴离子/过氧化氢的底物。总体而言，该方法具有高度灵活性，既可用于筛选抑制超氧阴离子/过氧化氢生成的物质，也可实现对不同黄素连接的线粒体脱氢酶产生活性氧能力的直接比较。观看本视频后，您应能够熟练掌握如何利用纯化的脱氢酶来检测活性氧和NADH的生成。该检测方法可为后续开展更为复杂的分离线粒体实验提供基础。

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