Name: 流式细胞仪估测原发性急性髓系白血病和患者源性移植中白血病干细胞的诊断和随访 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: 了解如何使用流式细胞术检测和定量急性髓系白血病中的白血病干细胞，该方法适用于大多数血液学实验室，可用于诊断和治疗随访中的患者源性异种移植模型分析。

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本工作部分得到了法国Laurette Fugain协会、法国抗癌联盟（北部中心）、法国基金会（白血病委员会）、SIRIC Oncolille以及法国国家癌症研究所的支持。

我们遵循欧洲关于将动物用于科学目的的标准。本研究已获得当地伦理委员会的批准（#3097-2015120414583482v3）。
1. 样品制备
<ol>
	<li>从骨髓中采集（2 mL） 从头合成 含抗凝剂乙二胺四乙酸的试管中的急性髓系白血病样本&#160;（EDTA）浓度为每毫升骨髓1.8 mg。</li>
	<li>进行Ficoll分离，即密度梯度分离，以从红细胞和粒细胞中分离单个核细胞，步骤如下：将骨髓用3体积的&#160;磷酸盐缓冲液（PBS：NaCl 137 mM，KCl 2.7 mM，Na2HPO4 10 mM，KH2PO4 1.8 mM)。将1体积的Ficoll与1体积稀释后的骨髓液小心叠加。在300 × g下离心30分钟，不启用刹车。将单个核细胞的白色中间层（buffy coat）转移至新的无菌离心管中。</li>
	<li>用10 mL PBS洗涤细胞两次，300 × g离心5分钟，以去除污染的血清成分。</li>
</ol>
2. 红细胞（RBC）裂解
<ol>
	<li>向细胞沉淀中加入 2 mL 裂解缓冲液（0.8% 氯化铵），轻轻涡旋混匀，室温孵育 5 分钟。在 300 × g 离心 5 分钟。 
	注意：如有必要，可重复此步骤。</li>
	<li>按照前述方法（1.3 节）用 PBS 洗涤细胞。</li>
</ol>
3. 患者来源的异种移植模型。
<ol>
	<li>通过Ficoll分离后，采用免疫磁珠阴性筛选法（CD3去除T淋巴细胞，CD20去除B淋巴细胞）从骨髓中获取原始细胞。具体操作请遵循试剂盒说明书。</li>
	<li>注射 5 x 106 将AML原始细胞通过尾静脉注射至未经预处理的NSG小鼠体内。使用固定装置以辅助尾静脉注射。小鼠应始终在常规条件下饲养，尤其需维持无特定病原体（SPF）条件，使用独立通风笼具，并在层流罩内进行所有操作。每两周采用下颌下采血法，用毛细管采集60 µL血液。将毛细管插入5 mL圆底试管中。用无菌纱布轻压止血。用洁净注射器推出血液。&#160;</li>
	<li>加入1 ml裂解缓冲液，孵育5分钟。然后以300 × g离心5分钟。用PBS洗涤，并以300 × g离心5分钟。弃去上清液，加入含10%牛血清白蛋白（BSA）的100 µL PBS，再加入3 µL抗人CD45-FITC和1 µL抗小鼠CD45-APC，4°C避光孵育30分钟。</li>
	<li>用含10% BSA的PBS（2 mL）洗涤细胞沉淀两次，300 × g离心5分钟。</li>
	<li>分装至最多 1 × 106 每100 µL PBS中加入细胞至流式细胞术管中。</li>
	<li>每两周通过CD45表达的嵌合体分析来监测移植情况（人 与 小鼠）通过流式细胞术图2A 和 B).</li>
	<li>在处死时（外周血原始细胞计数超过70%或出现严重临床病征），按照先前所述方法，用PBS冲洗胫骨和股骨，从破碎的脾脏及骨髓中收集单个核原始细胞13按照国际指南，通过颈椎脱位法处死小鼠。&#160; &#160;</li>
	<li>如果细胞沉淀中含有红细胞，使用裂解缓冲液裂解红细胞（步骤 2.1）。</li>
	<li>用含10% BSA的PBS（2 mL）重悬细胞沉淀，洗涤两次，每次在300 × g离心5分钟。</li>
	<li>收集细胞并分装，每份不超过 1 x 106 每100 µL PBS中加入细胞至流式细胞术管中。</li>
</ol>
4. 染色
<ol>
	<li>加入偶联抗体（参见步骤4.2），涡旋混匀。将细胞在室温避光条件下孵育15分钟。</li>
	<li>对于人原代细胞或PDX样本，使用以下抗体组合：10 µL anti-CD36-FITC、5 µL anti-CD19-ECD、5 µL anti-CD33-PC5.5、5 µL anti-CD90-APC、5 µL anti-CD34-AA700、5 µL anti-CD45RA-APC-H7、5 µL anti-CD38-Pacific Blue、5 µL anti-CD123-PC7 和 2.5 µL anti-CD45-KO。</li>
	<li>用2 mL PBS通过300 × g离心5分钟，洗涤细胞以去除未结合的抗体。</li>
	<li>将细胞重悬于450 µL PBS中，用于最终的流式细胞术分析。</li>
</ol>
5. 流式细胞术分析的设门策略
<ol>
	<li>使用配备红色、蓝色和紫色激光的流式细胞仪进行数据采集（至少 500,000 个细胞）。每天验证细胞仪设置：1）光学校准，2）流体系统，3）光学灵敏度，以及 4）使用荧光微球进行标准化。</li>
	<li>按照顺序设门策略定义 CD38 表达（图 1）。
	<ol>
		<li>使用正常骨髓样本中的细胞定义造血母细胞或浆细胞，作为 CD38 表达的阳性对照 &#160;。 
		注意：此设门尤为关键，因为后续推定的白血病干细胞（LSC）群体依赖于该门的定义。</li>
		<li>根据 CD45dim/SSC（侧向散射）低信号群体标准定义生理性前体细胞（正常原始细胞）（图 1A）。在此原始细胞群体中，定义显示 CD38++CD19+ 表型的造血母细胞（图 1B）；最后，利用 CD36 和 CD33 表达区分原粒细胞、原单核细胞和原红细胞（图 1C）。如（图 1E）所示，检测造血母细胞上的 CD34 表达。分析在原始细胞中定义的 P6-P10 多个前体细胞亚群（图 1D）。根据预设的 CD38 设门，将原始细胞中的 CD34 阳性群体分为 P6、P7 和 P8 三个前体亚群。确保 P8 群体包含与造血母细胞具有相同 CD38 荧光强度的原始细胞，P6 群体包含基于 CD38 荧光减一（FMO）对照确定的 CD38 阴性细胞，而 P7 群体在 CD38 表达水平上介于上述两个极端之间（图 1D）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从 CD34+38-（P6）设门的细胞中，通过 CD90 和 CD45RA 表达将造血干细胞（HSC）与推定的白血病干细胞（LSC）区分开（图 1F）。 
	注意：HSC 表型为 CD34+CD38-CD90+CD45RA-，多能前体细胞（MPP）定义为 CD34+CD38-CD90-CD45RA-。推定的 LSC 表型为 CD34+CD38-CD90dimCD45RA+，而更早期的下游群体为淋巴系倾向前体细胞（LMPP），定义为 CD34+CD38-CD90-CD45RA+。</li>
</ol>
6. 通过RT-PCR进行MRD监测
<ol>
	<li>按照先前所述方法，通过RT-PCR监测MRD水平14。</li>
</ol>

<ol><li>Shlush, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+the+origins+of+relapse+in+acute+myeloid+leukaemia+to+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tracing the origins of relapse in acute myeloid leukaemia to stem cells.</a> Nature. , (2017).</li>
<li>Terwijn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemic+stem+cell+frequency%3A+a+strong+biomarker+for+clinical+outcome+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Leukemic stem cell frequency: a strong biomarker for clinical outcome in acute myeloid leukemia.</a> PLoS One. 9 (9), e107587(2014).</li>
<li>Jordan, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interleukin-3+receptor+alpha+chain+is+a+unique+marker+for+human+acute+myelogenous+leukemia+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">The interleukin-3 receptor alpha chain is a unique marker for human acute myelogenous leukemia stem cells.</a> Leukemia. 14 (10), 1777-1784 (2000).</li>
<li>van Rhenen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+novel+AML+stem+cell+associated+antigen+CLL-1+aids+in+discrimination+between+normal+and+leukemic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The novel AML stem cell associated antigen CLL-1 aids in discrimination between normal and leukemic stem cells.</a> Blood. 110 (7), 2659-2666 (2007).</li>
<li>Bonardi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proteomics+and+transcriptomics+approach+to+identify+leukemic+stem+cell+%28LSC%29+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A proteomics and transcriptomics approach to identify leukemic stem cell (LSC) markers.</a> Mol Cell Proteomics. 12 (3), 626-637 (2013).</li>
<li>Kikushige, Y., Miyamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+TIM-3+as+a+Leukemic+Stem+Cell+Surface+Molecule+in+Primary+Acute+Myeloid+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology%22%5BJournal%5D)">Identification of TIM-3 as a Leukemic Stem Cell Surface Molecule in Primary Acute Myeloid Leukemia.</a> Oncology. 89, Suppl 1. 28-32 (2015).</li>
<li>Bonnet, D., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+acute+myeloid+leukemia+is+organized+as+a+hierarchy+that+originates+from+a+primitive+hematopoietic+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell.</a> Nat Med. 3 (7), 730-737 (1997).</li>
<li>Kersten, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD45RA%2C+a+specific+marker+for+leukaemia+stem+cell+sub-populations+in+acute+myeloid+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Brit+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">CD45RA, a specific marker for leukaemia stem cell sub-populations in acute myeloid leukaemia.</a> Brit J Haematol. 173 (2), 219-235 (2016).</li>
<li>Goardon, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coexistence+of+LMPP-like+and+GMP-like+leukemia+stem+cells+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Coexistence of LMPP-like and GMP-like leukemia stem cells in acute myeloid leukemia.</a> Cancer Cell. 19 (1), 138-152 (2011).</li>
<li>Ng, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+17-gene+stemness+score+for+rapid+determination+of+risk+in+acute+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A 17-gene stemness score for rapid determination of risk in acute leukaemia.</a> Nature. 540 (7633), 433-437 (2016).</li>
<li>Shultz, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+lymphoid+and+myeloid+cell+development+in+NOD%2FLtSz-scid+IL2R+gamma+null+mice+engrafted+with+mobilized+human+hemopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells.</a> J. Immunol. 174 (10), 6477-6489 (2005).</li>
<li>Roloff, G. W., Lai, C., Hourigan, C. S., Dillon, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+Advances+in+the+Measurement+of+Residual+Disease+in+Acute+Myeloid+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Med%22%5BJournal%5D)">Technical Advances in the Measurement of Residual Disease in Acute Myeloid Leukemia.</a> J Clin Med. 6 (9), (2017).</li>
<li>Swamydas, S., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+Purification+and+Labeling+of+Mouse+Bone+Marrow+Neutrophils+for+Functional+Studies+and+Adoptive+Transfer+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments.</a> J Vis Exp. (77), e50586(2013).</li>
<li>Gabert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+and+quality+control+studies+of+%27real-time%27+quantitative+reverse+transcriptase+polymerase+chain+reaction+of+fusion+gene+transcripts+for+residual+disease+detection+in+leukemia+-+a+Europe+Against+Cancer+program%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Standardization and quality control studies of 'real-time' quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia - a Europe Against Cancer program.</a> Leukemia. 17 (12), 2318-2357 (2003).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

准确且可重复地通过流式细胞术评估膜或胞质标志物，需要每天验证仪器设置，以确保光学对准以及流体系统的正常运行，&#160; 光学敏感性，以及使用校准微球进行标准化。
利用CD90和CD45RA通过多参数流式细胞术检测急性髓系白血病（AML）中的原始细胞群体是一种相对简单且可靠的方法。该分析中的关键步骤是准确评估原始细胞上CD38的表达水平，以正确圈定CD34+CD38-细胞群。CD38的表达强度通过正常骨髓中的造血祖细胞和/或浆细胞（CD38+）来确定。其他标记物的强度则通过同型对照来确定。
通过加入CD45RA和CD90可用于区分造血干细胞（HSC）与假定的白血病干细胞（LSC）。后者而非HSC可能是疾病复发的原因，因此该方案对于利用流式细胞术检测面板进行微小残留病监测具有重要意义。在治疗过程中对急性髓系白血病（AML）进行监测，对于改善风险分层和指导AML治疗至关重要。然而，并非所有患者都有合适的分子标志物。因此，通过流式细胞术进行MRD监测可能适用于所有AML病例。尽管该方法可能并不全面，因其主要针对具有CD34+CD38...

急性髓系白血病（AML）是导致白血病相关死亡的最常见原因。最初，AML 是一种造血干细胞（HSC）的克隆性疾病，其特征是分化受阻、原始细胞继而积聚，以及功能性造血成分的生成减少。近年来，主要通过采用下一代测序（NGS）策略，证实了原始细胞群体存在克隆异质性，并揭示了肿瘤细胞存在亚克隆演化的现象1。
异质性体现在白血病干细胞（LSC）的存在上。人们推测，这一动态的细胞区室在白血病进展和治疗过程中会不断演化，以应对各种施加的选择压力。因此，LSC被认为对当前的化疗方案具有耐药性，并介导疾病的复发，具有重要的临床意义2。已有多种标志物被用于表征LSC，例如CD1233、CLL-14、CD975和TIM-36。原始细胞中的CD34+CD38-细胞区室被认为富含LSC7，但也包含正常的造血干细胞（HSC）。将CD90和CD45RA的表达情况应用于CD34+CD38-（P6）区室（图1），可进一步区分出多个阶段的正常与恶性造血前体细胞8。具体而言，在大多数急性髓系白血病（AML）病例中，可识别出正常的CD34+CD38-CD90+CD45RA-造血干细胞（HSC）、多能前体细胞（MPP），如CD34+CD38-CD90dimCD45RA-细胞，以及CD34+CD38-CD90-CD45RA+淋巴系倾向的多能前体细胞（LMPP）8,9。在CD34+细胞区室中，CD38的平均荧光强度（MFI）尤其需要关注。因为CD38的表达强度可进一步定义三个新的细胞区室：CD38阴性（P6）、CD38弱表达（P7）和CD38强表达（P8）（图1）。CD38的MFI可通过造血母细胞和/或浆细胞作为内部阳性对照来确定，因为这些细胞强烈表达CD38。
免疫缺陷型 NOD/SCID/IL2Rγcnull（NSG）小鼠模型被广泛用于移植正常及恶性人类造血细胞10,11。连续异种移植实验可用于验证白血病干细胞（LSC）或造血干细胞（HSC）的功能。这些研究已通过大规模测序方法进行了深入分析。然而，与原发性急性髓系白血病（AML）相比，关于移植至NSG小鼠体内的AML原始细胞群体中LSC和HSC免疫表型的研究仍较为有限（图2）。
LSC 的数量本身较少，因此鉴定和定量 LSC 具有挑战性，而本文所述方法可作为在诊断时及临床随访期间评估化疗反应的流式细胞术检测手段（因为残留的 LSC 可能导致 AML 复发）。LSC 的存在可能提示微小残留病（MRD）呈阳性。迄今为止，&#160;AML 中的 MRD 监测主要依赖于分子学方法（即，RT-PCR、NGS）10,12。然而，在本方案中，我们通过多参数流式细胞术同时检测人类 AML 原始母细胞上多种 HSC/LSC 标志物（CD34、CD38、CD45RA、CD90）的蛋白表达2,8,9。该抗体组合可应用于任何标准的流式细胞术实验室，且当无法通过实时聚合酶链反应（RT-PCR）进行 MRD 检测时，这种流式 MRD 检测尤其有价值，例如在初诊 AML 样本中无法检测到白血病特异性分子标志物的情况下&#160;。此外，本方案可作为更敏感的分子 MRD 技术的补充，因其旨在检测和定量异常的造血祖细胞，反映了一种功能性细胞特征（图 3）。
我们展示了如何利用大多数临床实验室常见的抗体，通过流式细胞术对三种造血祖细胞群体以及具有不同成熟程度的潜在白血病干细胞（LSC）区室进行定量分析。此外，我们还证实了这些细胞区室存在于相应患者来源的异种移植模型（PDX）中，并在治疗随访期间持续存在。

<table><tbody><tr><td>潘科尔</td><td>PAN-Biotech</td><td>P04-60500</td><td></td></tr><tr><td>红细胞裂解缓冲液 (10x)</td><td>Ozyme</td><td>BLE420301</td><td>红细胞裂解液 A：8.29 g NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl + 0.037 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;EDTA 溶于 100 mL 无菌 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O；红细胞裂解液 B：1 g KHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; 溶于 100 mL 无菌 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>NOD/SCID/IL2R&amp;gamma;cnull&amp;nbsp; (NSG)&amp;nbsp; 小鼠</td><td>JACKSON LABORATORY</td><td>货号：005557</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco by life technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>AutoMACS 运行缓冲液 &amp;ndash; MACS 分离缓冲液</td><td>MACS Buffer Miltenybiotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD36-FITC（克隆 FA6-152，Iotest）</td><td>Beckman Coulter</td><td>PN IM0766U</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD33-PC5.5（克隆 D3HL60.251，Iotest）</td><td>Beckman Coulter</td><td>B36289</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD90-APC（克隆 5E10）</td><td>Biolegend</td><td>328114</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD19-ECD（克隆 J3-119，Iotest）</td><td>Beckman Coulter</td><td>A07770</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD34-AA700（克隆 581，Iotest）</td><td>Beckman Coulter</td><td>B92417</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD45RA-APC-H7（克隆 HI100）&amp;nbsp;</td><td>Beckton Dickinson</td><td>560674</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD38-Pacific Blue（克隆 LSI98-4-3，Iotest）</td><td>Beckman Coulter</td><td>B92396</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD45-KO（克隆 J.33，Iotest）</td><td>Beckman Coulter</td><td>B36294</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD3-PE</td><td>Beckman Coulter</td><td>IM1451</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD20-PE</td><td>Beckman Coulter</td><td>A07747</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD123-PC7</td><td>Beckman Coulter</td><td>B13647</td><td></td></tr><tr><td>Flow-Set</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63492</td><td></td></tr><tr><td>Flow-Check</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63493</td><td></td></tr><tr><td>Navios</td><td>Beckman Coulter</td><td>DS-14644A</td><td></td></tr><tr><td>LSR Fortessa X20</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CST BD</td><td>BD Biosciences</td><td>655051</td><td></td></tr><tr><td>FacsFlow&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>336911</td><td></td></tr><tr><td>抗 hCD45-FITC</td><td>Biolegend</td><td>BLE304006</td><td></td></tr><tr><td>抗 mCD45-APC</td><td>Biolegend</td><td>BLE103112</td><td></td></tr><tr><td>EasySep 人 PE 选择试剂盒</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>EasySep&amp;nbsp; 磁力架&amp;nbsp;</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>18551</td><td></td></tr></tbody></table>

通过流式细胞术在初诊及随访时评估原发性急性髓系白血病和患者来源异种移植模型中的白血病干细胞

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

急性髓系白血病（AML）是一种具有异质性且未经治疗可致死的疾病，是成人白血病相关死亡的最常见原因。AML最初起源于造血干细胞（HSC），其特征是分化受阻、白血病原始细胞随之积聚，以及功能性造血成分生成减少。这种异质性还体现在白血病干细胞（LSC）的存在上，这一动态细胞群体在白血病进展和治疗过程中不断演化，以应对各种选择压力。为进一步界定LSC群体，联合使用CD90和CD45RA标志物可实现对CD34+CD38-细胞区室中正常HSC和多能祖细胞的区分。本文介绍了一种通过多参数流式细胞术检测人AML原代原始细胞上多个潜在LSC标志物（CD34、CD38、CD45RA、CD90）同时表达的实验方案。此外，我们展示了如何定量三种祖细胞群体及一种具有不同程度成熟特征的潜在LSC群体。我们已在相应的患者来源异种移植模型中验证了这些细胞群体的存在。该对潜在LSC进行检测与定量的方法可用于化疗反应的临床随访（即，微小残留病），因为残留的LSC可能导致AML复发。

在此，我们介绍一种用于确定正常和恶性人类骨髓样本中前体细胞群体的方法。我们从一个成功的PDX模型中采集了骨髓和脾脏组织，并按照上述方法进行多参数流式细胞术分析。我们比较了诊断时患者样本与其相应PDX模型中多个原始细胞亚群，特别是CD34+CD38-前体细胞区室，该区室被认为富含潜在的白血病干细胞（LSC）。我们发现，PDX模型中的CD34+CD38-原始细胞比例较诊断时患者样本更高（3.48% vs. 0.53%） 图 2C, D）。有趣的是，我们发现PDX中具有CD34+CD38-CD90-CD45RA+表型的疑似LSC比例高于原始患者样本（2.76% vs. 0.48%） 图 2E, F)，提示在此小鼠模型的造血组织中可能存在恶性前体细胞的富集。PDX模型与患者样本中正常前体细胞组分的频率无显著差异。 
此外，我们根据CD34、CD38、CD90和CD45A的表达情况（如本方案所述），分析了两个不同患者样本在诊断时及治疗随访期间的原始细胞祖细...

我们概述了一种通过流式细胞术检测原代急性髓系白血病细胞上白血病干细胞标志物共表达的实验方案。我们展示了如何定量分析三种具有不同程度成熟特征的前体细胞群以及一个假定的白血病干细胞（LSC）群体。我们已在相应的患者来源异种移植模型中证实了这些细胞群的存在。

急性髓系白血病（AML）是一种异质性且未经治疗可致死的疾病。它是白血病相关死亡的最常见原因……

本实验的总体目标是通过流式细胞术在诊断时及治疗随访期间，对急性髓系白血病患者及其来源的异种移植模型中的白血病干细胞进行定量估算。该方法可解答血液学/肿瘤学领域的一些关键问题，例如通过流式细胞术对急性髓系白血病中白血病干细胞进行定量评估的临床意义。该技术的主要优势在于，其适用于大多数血液学/肿瘤学实验室，并可使用常规抗体完成。本实验步骤将由本实验室的博士后 Thomas、研究生 Fanny 以及工程师 Adeline 演示。首先，从初发急性髓系白血病（AML）患者中采集 2 毫升骨髓样本，置于含有 1.8 毫克/毫升抗凝剂 EDTA 的试管中。通过将骨髓用三倍体积的 PBS 稀释，分离单个核细胞与红细胞及粒细胞。然后，小心地将一份体积的Ficol与一份体积的稀释骨髓液重叠。以300g离心30分钟，期间不刹车。随后，将单个核细胞的白色絮状层转移至新的无菌管中。为去除污染血清成分的上清液，加入10毫升磷酸盐缓冲液，以300×g离心5分钟，然后重复洗涤一次。向细胞沉淀中加入2毫升裂解缓冲液，轻轻涡旋以裂解红细胞。随后，将细胞在室温下孵育5分钟。将细胞在300g离心5分钟，去除上清液。然后用PBS洗涤细胞。根据文本方案从骨髓中分离出原始细胞后，在超净台内，将未处理的NSG小鼠放入固定装置中，并向尾静脉注射5 × 10⁶个AML原始细胞。将小鼠放回独立的通风笼具中，维持常规且无特定病原体的环境。每两周使用血细胞比容毛细管通过下颌下采集法采集60 µL血液。将毛细管转移至5 mL离心管中，然后用无菌纱布轻轻按压采血部位以止血。向离心管中加入1毫升裂解缓冲液，轻轻涡旋混匀。然后将细胞在室温下孵育5分钟。以300×g离心5分钟。然后，去除上清液后，加入含有10% BSA的100微升PBS和3微升抗人CD45 FITC抗体，孵育30分钟。接着，用含有10% BSA的2毫升PBS将细胞沉淀洗涤两次，每次以300 ×g离心5分钟。每两周使用流式细胞术通过人源与鼠源CD45表达的嵌合分析来检测移植情况。当有核细胞中原始细胞比例超过 70%，或观察到严重临床病症时，处死动物，并通过 PBS 冲洗胫骨和股骨的方式，从碾碎的脾脏及骨髓中收集单个核原始细胞。进行多色流式染色时，将偶联抗体与人源样本或患者来源的异种移植（PDX）样本混合，涡旋混匀各离心管，随后将细胞于室温避光孵育 15 至 30 分钟。使用两毫升 PBS 洗涤细胞，以去除未结合的抗体。将细胞重悬于 450 微升 PBS 中，随后进行流式细胞术分析和微小残留病（MRD）监测。为了通过流式细胞术准确且可重复地评估膜表面及胞质标志物，需验证光学对准。每天使用 stomazine 校准进行 3D 系统的适当调谐、光学灵敏度和门控化。使用正常骨髓样本设定 CD38 的门控参数。至少需要采集 500,000 个事件，并验证每次流式运行结果均规则且均一。此外，排除双联体、死细胞及细胞碎片。未成熟的造血细胞定义为 CD45 中等表达、SSC 低表达。CD38 阳性对照或造血母细胞为 CD19/CD38 双阳性。然后定义P8或CD38阳性、P7或CD38中等表达以及P6或CD38阴性细胞。P6细胞可进一步细分为HSC、MPP和LSC。由于是正常骨髓，因此LSC为阴性。通过多参数流式细胞术发现，与诊断时的患者样本相比，PDX模型中CD34阳性、CD38阴性的原始细胞比例更高。有趣的是，与原始患者样本相比，PDX模型中假定的白血病干细胞（LSC）比例也更高，提示在此小鼠模型的造血组织中可能存在恶性前体细胞的富集。在比较两个不同患者样本的原始细胞前体群体时，第一位患者在诊断时CD34阳性、CD38阴性细胞比例为0.06%，而在首次治疗随访时该比例上升至3.33%。相比之下，第二位患者在诊断时CD34阳性、CD38阴性细胞比例为7.8%，在首次治疗随访时下降至2.27%。相应地，第一位患者的疑似白血病干细胞（LSC）比例从诊断时的0%上升至首次治疗随访时的0.65%，而第二位患者则从诊断时的6.57%下降至随访时的1.44%。通过使用患者一的NPM1突变和患者二的CBF-beta-MYH11基因融合作为分子标志物进行微小残留病（MRD）监测，结果显示，在首次治疗随访时间点，第一位患者的分子MRD下降程度小于第二位患者。一旦掌握，若操作得当，该技术可在两小时内完成。在进行此操作时，验证流式细胞术的设置和CD38的检测至关重要。在此步骤完成后，可进一步开展其他方法，例如流式细胞术细胞分选，以回答更多问题，如功能性白血病干细胞评估。观看本视频后，您应能够充分理解如何在患者来源的异种移植模型中检测并定量患者样本中的白血病干细胞。请务必注意，处理患者样本可能存在生物安全风险，因此在进行本实验操作时，应始终遵守良好操作规范（GOP）指南及所在机构的安全规程。

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流式细胞仪估测原发性急性髓系白血病和患者源性移植中白血病干细胞的诊断和随访

检测微小残留病（MRD）是急性髓系白血病（AML）中用于优化风险评估和预测复发的重要预后生物标志物。这些关于MRD一致且准确识别与检测的最佳实践指南和建议，可有助于制定有效的AML治疗决策。...

全面采样与处理骨髓以检测急性髓系白血病中可测量残存病灶及白血病干细胞的实验方案

在缺乏形态学标准或细胞遗传学信息不明确的情况下，骨髓增生异常综合征（MDS）的诊断较为困难。多参数流式细胞术（MFC）可能有助于优化MDS的诊断流程。为了在临床实践中具有应用价值，MFC分析必须基于具备足够特异性和敏感性的参数，且不同操作者之间的数据应具有可重复性。...

基于数据库指导的流式细胞术评估骨髓髓系细胞成熟度

我们描述了一种利用多参数流式细胞术检测小鼠健康造血干细胞和祖细胞（HSPCs）以及由MLL-AF9驱动的急性髓系白血病（AML）小鼠模型中白血病细胞线粒体活性氧（ROS）的方法。...

小鼠造血干细胞与祖细胞及MLL-AF9驱动型白血病中线粒体活性氧的流式细胞术分析

我们介绍了两种用于检测人原代急性髓系白血病（AML）样本中NKG2D配体（NKG2DL）的不同染色方案。第一种方法基于一种融合蛋白，能够识别所有已知以及可能尚未发现的配体；而第二种方案则依赖于联合使用多种抗NKG2DL抗体。...

两种用于检测急性髓系白血病中NKG2D配体表面表达的流式细胞术方法以区分干细胞与主体亚群

本文提供了一种详细的实验方案，用于从小鼠模型中分离和表征骨髓增生异常综合征及急性髓系白血病的骨髓微环境细胞群体。该技术可识别疾病进展过程中非造血性骨髓微环境（包括内皮细胞和间充质基质细胞）的变化。...

识别骨髓增生异常综合征和急性髓系白血病中的骨髓微环境细胞群

我们采用细胞增殖染色法来鉴定斑马鱼T细胞急性淋巴母细胞白血病模型中的静息细胞。该染料在不分裂的细胞中得以保留，而在细胞增殖过程中信号减弱，从而能够筛选出处于静止状态的细胞以进行后续分析。本方案提供了一种功能性工具，用于在细胞静息背景下研究自我更新能力。...

利用细胞增殖染色鉴定斑马鱼T细胞急性淋巴细胞白血病模型中的静息细胞

本文描述了一种基于磷酸化流式细胞术的方法，用于分析移植到小鼠体内并从骨髓穿刺液中获取的人急性髓系白血病细胞中 mTORC1、JAK/STAT5 和 MAPK 信号通路下游的信号传导。利用新一代光谱流式细胞仪，可同时高灵敏度地检测 p-STAT5、p-4EBP1、p-RPS6 和 p-ERK1/2...

急性髓系白血病患者来源异种移植模型的细胞内磷酸流式细胞术

本方案描述了患者来源的B细胞和T细胞急性淋巴细胞白血病（ALL）细胞的在卵内 异种移植，该过程发生在注射后4天。...

体内 异种移植患者来源的急性淋巴细胞白血病（ALL）细胞（PDX-ALL）

该方案旨在描述一种基于诱导化疗反应动力学的小鼠急性淋巴细胞白血病复发模型。...

急性淋巴细胞白血病诱导化疗后白血病复发的小鼠模型

本方案描述了使用离心淘析法将原代急性淋巴细胞白血病细胞按不同细胞周期时相进行分离的方法。...

通过离心淘析法分离处于不同细胞周期阶段的原代急性淋巴细胞白血病细胞

了解如何使用流式细胞术检测和定量急性髓系白血病中的白血病干细胞，该方法适用于大多数血液学实验室，可用于诊断和治疗随访中的患者源性异种移植模型分析。

通过流式细胞术在初诊及随访时评估原发性急性髓系白血病和患者来源异种移植模型中的白血病干细胞

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