用于Nasonia vitripennis基因组操作的胚胎显微注射与移植技术

本实验的总体目标是成功对纳氏茧蜂（nasonia vitripennis）胚胎进行显微注射，以实现基因组操作。该方法有助于解答与纳氏茧蜂生物学相关的关键科学问题，例如毒液生成和性别决定机制。该技术的主要优势在于能够直接对蜂类基因组进行操作，并可实现多种先进的基因组修饰。

本实验操作将由本实验室的博士后 Ming Li 演示。首先，通过将 200 至 500 只成虫以雌雄比例 3:1 放入昆虫饲养笼中，建立多个 N.vitripennis 种群。将寄生蜂维持在 25 ± 1 °C、相对湿度 30% 及 12 小时光照/12 小时黑暗的条件下培养。

连续两天，让交配后的雌蜂取食新鲜的 S.bullata 蛹，同时提供体积比为 1:10 的蔗糖水溶液小液滴供其摄食。随后两天，移除丽蝇蛹，使雌蜂无法进行产卵，从而使其处于高度 gravid（ gravid，指充满卵的状态）。为保持 S.bullata 蛹寄主的新鲜，获取后应立即在 4 摄氏度条件下保存，仅在使用时取出。

区分具有红色蛹壳的年轻寄主与具有较深色蛹壳的老龄寄主。通过将单个新鲜的 S. bullata 蛹放入中心带有蛹大小孔洞的泡沫塞中，使雌性寄生蜂能够寄生年轻寄主。为了达到最高的寄生集中度并便于胚胎收集，仅暴露寄主前端约 0.2 厘米，前端呈圆形，而末端较粗厚，并具有火山口状的开口。

将寄主蛹按此排列方式放入笼中，静置约45分钟，使寄生蜂完成寄生。通过手动取出寄生后的寄主，并轻轻敲击或吹去残留的寄生蜂，以去除已被寄生的寄主。每隔约15分钟更换一次新鲜寄主，以持续收集注射过程中的早期卵阶段样本。

在解剖显微镜下，使用镊子小心剥离新寄生宿主蛹壳的后端，以暴露出N.vitripennis的卵。然后，通过使用液体粘合剂将盖玻片粘附到洁净的载玻片上，制备胚胎排列载片。用蘸湿的细头画笔轻轻将胚胎从宿主上刷下，注意不要损伤宿主柔软的蛹体表皮。

然后，用湿润的画笔将约20个胚胎逐个转移至载玻片上，紧邻盖玻片的一侧。使胚胎的前端紧靠盖玻片边缘，确保所有胚胎的后端朝向同一方向。这样可提高对所有胚胎进行显微注射时定位的一致性和精确度。

根据文本方案拉制注射针后，将针尖在25摄氏度下轻轻接触金刚石研磨板约10秒，以形成斜面。制备包含基因组修饰试剂的注射混合液，并将其置于冰上保存。使用微量加样吸头向注射针中加入两微升（2 µL）的注射混合液。

然后，将带有排列胚胎的载玻片置于复式显微镜的载物台上。以25至35度的垂直角度，小心地将针头插入胚胎的后端。接着，注入1至5皮升的注射混合物，并确保胚胎因注射而轻微膨胀。

如果发生堵塞，请尝试重新修整针头。N.vitripennis 胚胎的细胞质异常黏稠且具有黏性，容易导致针头频繁堵塞。每次注射约 20 至 40 枚卵后，应暂停操作。

用湿润的画笔轻轻接触已注射的卵，将其转移至宿主中。随后，使用新鲜产出的新一批卵继续进行注射。理想情况下，此步骤由两人配合完成效果最佳：一人负责收集并排列卵，另一人负责注射基因组修饰组分，并将已注射的胚胎移植到宿主蛹中。

显微注射后，使用湿润的画笔将最多40枚已注射的G零代胚胎逐个小心地放置到先前被蜇刺的S.bullata蛹体内。将寄主蛹放入含有湿润滤纸和棉球的培养皿中，并在25摄氏度、相对湿度约70%的条件下培养，直至注射的胚胎在约一至两天内孵化。重要的是，寄主蛹壳可被去除，只要在加湿的培养环境中孵化以防止干燥，N.vitripennis卵仍能正常发育。

G0代胚胎孵化后，将寄主蛹转移到新的培养皿中，并在25摄氏度和70%湿度条件下培养。每天观察寄主蛹及注射过的G0代幼虫。如果寄主蛹出现异味，需将注射过的幼虫转移至新的健康寄主蛹中。

为了有效穿刺并进行微注射到 N.vitripennis 胚胎中，测试了多种微电极拉制仪，并结合含丝毛细玻璃针使用，包括石英、铝硅酸盐和硼硅酸盐材质，以获得理想的类似皮下注射针的长尖端，适用于 N.vitripennis 胚胎的微注射。本实验所用的基因组修饰组分是混合的向导 RNA 与 Cas9 蛋白，用于 CRISPR 介导的基因组编辑。在本实验中，靶向 cinnabar 基因的单导向 RNA（sgRNA）以不同剂量与 Cas9 蛋白共同注射入 N.vitripennis 胚胎中。

本表格显示，存活率呈剂量依赖性，sgRNA 和 Cas9 蛋白浓度增加导致存活率下降。在进行该操作时，需注意避免在操作或转移过程中刺破或干燥寄生蜂胚胎，应小心使用湿润的细头画笔或胚胎挑选工具。观看本视频后，您应能够充分掌握如何高效地获取、显微注射和移植寄生蜂胚胎，从而成功实现高级基因组编辑。