Name: 金小蜂金小蜂基因组操作的胚胎显微注射和移植技术 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: 学习金小蜂胚胎显微注射与移植技术，实现可遗传基因组编辑。该方法利用CRISPR等工具直接操作Nasonia vitripennis基因组，为毒液产生和性别决定等生物学研究提供关键技术支撑。

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本工作获得了加利福尼亚大学河滨分校（UCR）提供的实验室启动基金（资助对象：O.S.A.）以及美国农业部国家食品与农业研究所（NIFA）哈奇项目（1009509，资助对象：O.S.A.）的大力支持。

1. N. Vitripennis 种群饲养
<ol>
	<li>通过将200–500只N. vitripennis成虫（雌:雄比例为3:1）放入昆虫饲养笼中，建立多个种群（约3–5个）。 
	注：除使用昆虫饲养笼外，也可将约15–20只寄生蜂/管置于多个小型玻璃试管中，管口用棉花塞住，用于扩繁寄生蜂。
	<ol>
		<li>将寄生蜂维持在25 ± 1 °C、相对湿度30%、12小时光照/12小时黑暗的条件下，每天提供少量1:10（v/v）蔗糖/水溶液液滴作为食物。 
		注：寄生蜂种群的扩繁和采集也可在室温且无湿度控制的条件下进行；但低于25 °C的温度会略微延缓胚胎的发育进程。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在注射前，让寄生蜂交配至少4天。
	<ol>
		<li>前两天，让已交配的雌蜂取食新鲜的S. bullata蛹，同时提供少量1:10（v/v）蔗糖/水溶液液滴。</li>
		<li>随后两天，移除丽蝇蛹，使雌蜂缺乏产卵场所，从而使其处于高度 gravid（饱卵）状态。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 玻璃翼果蝇（N. Vitripennis）原肠胚前阶段胚胎的收集与排列
<ol>
	<li>让雌性寄生蜂在幼龄宿主（S. bullata 蛹）体内寄生（产卵形成胚胎）。为保持宿主新鲜，获取后应立即在 4 °C 条件下保存，仅在需要时取出使用。 
	注意：幼龄宿主可通过其红褐色的蛹壳识别，而较老的宿主蛹壳颜色更深（图 1A）。
	<ol>
		<li>将单个新鲜的 S. bullata 蛹放入带有中心孔洞（大小适合蛹体）的泡沫塞中，仅暴露宿主前端约 0.2 cm（首选产卵部位），以实现寄生集中化并便于后续胚胎收集。 
		注意：宿主前端呈圆形，而后端较粗厚，并具有一“火山口样”开口（图 1B）。</li>
		<li>将宿主蛹（约每 100 只蜂使用 5 个宿主蛹）按此方式放入饲养笼中，静置约 45 分钟，使寄生蜂完成寄生过程（图 2- ii）。 
		注意：胚胎必须尽可能年轻，理想情况下应在产卵后 1 小时内，以确保其处于前囊胚阶段。过老的胚胎（&#62; 1.5 小时）不应进行显微注射。</li>
		<li>用手取出已被寄生的宿主，并轻轻刷除或吹去停留在其上的寄生蜂。每隔约 15 分钟更换一次新鲜宿主，以持续收集处于早期发育阶段的卵用于注射。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用手将刚被寄生的宿主从饲养笼中取出。在解剖显微镜下，使用镊子小心剥离宿主外层蛹壳（蛹壳）后端约 0.4 cm，以暴露 N. vitripennis 的卵（图 2- iii）。 
	注意：操作时需避免刺破蛹体表皮；若发生破损，血淋巴会润湿寄生蜂胚胎，导致其难以取出用于显微注射。</li>
	<li>使用液体胶将盖玻片粘附于洁净的载玻片上，制备用于胚胎排列的载片（图 3）。 
	注意：建议使用高性能瞬干胶以增强粘结强度并加快干燥速度，但任何能固定盖玻片、防止其在载玻片上移动的胶均可接受。</li>
	<li>用湿润的细头画笔小心地将胚胎从宿主上刷下，注意避免损伤宿主柔软的蛹体表皮。 
	注意：可使用“胚胎挑取器”（本质上是一对超细镊子的一半）替代画笔。</li>
	<li>用湿润画笔将约 20 个胚胎逐个转移至载玻片上，紧邻盖玻片一侧放置。使胚胎前端紧贴盖玻片边缘，确保所有胚胎的后端朝向一致（图 2- iv），以便在所有胚胎中实现更高精度的同一位置注射。 
	注意：该改进技术无需使用双面胶带固定胚胎（如先前文献所述21,22）。此外，注射过程中无需对胚胎进行干燥处理，也无需像先前报道的 N. vitripennis 胚胎显微注射方法那样用卤代烃油覆盖卵（22）。</li>
</ol>
3. 显微注射针头的制备
<ol>
	<li>将铝硅酸盐毛细玻璃管放入拉针仪中。 
	注意：N. vitripennis 胚胎注射的成功与否在很大程度上依赖于优质的注射针。注射针应具有尖锐且细长的尖端，以便轻松穿透卵壳。也可使用石英或硼硅酸盐毛细玻璃管（图4）。</li>
	<li>在拉针仪上将加热温度设为605，拉速设为130，延迟时间设为80，拉力设为70，气压设为500。 
	注意：石英和硼硅酸盐毛细管的其他拉针参数见表1；不同拉针仪和灯丝的参数可能有所差异。</li>
	<li>启动拉针仪以制备合适的注射针。根据需要重复操作以制备多根针。 
	注意：拉制好的注射针可存放于培养皿中，皿内放置若干条平行排列的商用雕塑黏土以固定针头。</li>
	<li>在25 °C下，将针尖轻轻接触金刚石磨板约10秒，以对针尖进行斜面打磨（图2- iii）。 
	注意：斜面打磨有助于注射针更顺利地进入胚胎，减少组织损伤，同时促进试剂在针内的流动。</li>
</ol>
4. 胚胎显微注射
<ol>
	<li>制备包含基因组修饰试剂的注射混合物（例如， 转座子 + 辅助转座酶，或CRISPR试剂 等等，并置于冰上。</li>
	<li>使用微量进样尖端将2 µL注射混合物吸入注射针中。 
	注意：本方案中展示的注射混合物由单导向RNA（sgRNA）和重组Cas9蛋白溶于H2O.</li>
	<li>将带有排列整齐胚胎的载玻片置于复式显微镜的载物台上。</li>
	<li>将针头以25–35°的垂直角度小心插入胚胎的后端。注入1–5 pL注射混合物（约为胚胎体积的2–10%），并确保在注入过程中胚胎出现轻微膨胀图2- iv). 
	注意：若向胚胎内注射过多注射液，可能导致胚胎破裂，细胞质外溢。此外，切口过大或破损的注射针头也可能导致胚胎破裂。
	<ol>
		<li>若发生堵塞，请尝试重新斜削针头。细胞质的 N. vitripennis 胚胎液异常黏稠且具有黏性，导致注射针头频繁堵塞（每25次注射中出现1次）。 
		注意：注射过程中需使用画笔定期添加去离子水，以保持胚胎湿润。画笔上的水量至关重要，适量的水可方便胚胎移动和排列。水量过多会导致胚胎漂浮，而水量过少则会使胚胎难以移动。</li>
		<li>每次注射约 20–40 枚卵（耗时约 10 分钟），然后暂停。用湿润的画笔轻轻触碰已注射的卵，将其转移并放入寄主中。随后，继续使用新产出的一批卵进行下一轮注射。&#62; 1小时大 
		注意：理想情况下，本方案的最佳操作方式为一人持续收集并排列卵子，另一人同时注射基因组修饰组分，并将已注射的胚胎移植至宿主蛹中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 将显微注射后的 G0 N. vitripennis 胚胎移植到预先被刺伤的寄主体内
<ol>
	<li>显微注射后，用湿润的画笔小心地将注射过的 G0 胚胎放置到先前已被螫刺的 S. bullata 蛹体上（图2 - vi）。 
	注意：用于收集胚胎进行显微注射的寄主蛹也可用于此目的。此外，尽管已付出大量努力，目前尚无可用的人工饲料22。
	<ol>
		<li>为避免过度拥挤和幼虫间竞争，将最多40个注射过的胚胎逐个放置于同一个预先被螫刺的寄主上。 
		注意：注射会对胚胎造成损伤；若在将注射胚胎移植至寄主蛹时操作不慎，可能导致注射物质或卵黄被挤出，从而引起胚胎死亡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将寄主蛹放入含有湿润滤纸和棉球的培养皿中，在25 °C、相对湿度约70%的条件下培养，直至注射的胚胎孵化（约1–2天）（图2 - vii）。 
	注意：重要的是，即使寄主蛹壳已被剥离，只要将其置于加湿环境（含湿润滤纸和棉球的培养皿）中以防止干燥，N. vitripennis 的卵仍可正常发育。若无法精确控制湿度，在室温下并依靠湿润棉球提供的湿度进行培养也已足够。</li>
	<li>G0 胚胎孵化后，将寄主蛹转移至新的培养皿中，继续在70%湿度和25°C条件下培养。
	<ol>
		<li>每日观察寄主蛹及注射后的 G0 幼虫。若寄主蛹出现恶臭，应将注射的幼虫转移至新的健康寄主蛹中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 基因组修饰的筛选
<ol>
	<li>移除每一个 N. vitripennis 使用细毛刷或胚胎挑针从寄主中取出蛹。注射G0 幼虫应在注射后约8天化蛹。</li>
	<li>将每只移出的蛹放入一个独立的玻璃小瓶中，瓶口用棉花塞住，静置使其羽化为成虫0 成虫，确保孵化出的雌性为处女蝇，以便于后续的遗传杂交实验。 
	注意：可通过翅长区分雌雄：雌性翅较长，侧放时翅长超过体长。所有显微注射后的雌性蛹可共同置于一个带塞的试管中，雄性蛹 likewise 处理。</li>
	<li>筛选 G0 个体羽化后，可通过PCR或肉眼观察（若破坏的是具有表型效应的基因）进行筛选。例如，若使用CRISPR在特定基因中产生缺失，且该基因的破坏会引发可见表型，则筛选并保留具有突变表型的个体图2- 八)21. 然而，如果受影响的基因编码的是非可见表型，例如必需基因的突变体，则应进行杂交方案（杂交 G0 野生型雄性与野生型雌性杂交，或杂交G0 野生型雄性个体杂交）以恢复并筛选可遗传的突变体，通过检测致死性或不育性进行鉴定。 
	注意：类似于 D. melanogaster, N. vitripennis 成虫 可通过暴露于 CO 而被固定2 便于进行直接操作。此外，未交配的雌性个体可产生100%单倍体雄性子代，因此一个突变型未交配雌性个体可产生大量突变型雄性个体，用于后续分析。 
	注意：必需基因中的突变需要通过交配存活的G0 注射后的雌性个体（推测为某突变的杂合子）与野生型雄性个体交配；在此特定情况下，G代中有一半1 雄性子代应因遗传致死突变而死亡，而一半的G1 雌性子代将成为致死基因的携带者。</li>
	<li>远交 G0 成人与屏幕检测1 若目标是转基因，则可利用转基因标记检测后代中的转基因插入。目前，转基因技术在该领域仍有待验证。 N. vitripennis.</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

近期对N. vitripennis基因组的测序工作，引发了对该物种中未知基因进行功能性表征的分子工具的重要需求23。CRISPR-Cas9系统及其他多种基因编辑工具已被证明在研究多种生物的基因功能方面具有重要价值24。然而，为了产生可遗传的突变，这些工具需要进行胚胎显微注射。因此，本文展示了一种详细的可视化技术，包含多项创新，可实现高效的N. vitripennis胚胎显微注射。
总体而言，与现有方法相比23，该详细技术在多个方面实现了重要创新，可实现对N. vitripennis胚胎的高效显微注射。例如，为便于快速收集胚胎，设计并使用了一种产卵工具（泡沫塞），使寄生蜂产卵完全局限于寄主的后端（图1），从而可在短时间内高效收集大量胚胎。此外，还改进并明确了大规模饲养寄生蜂种群以获得更多卵的技术。同时，为加快胚胎排列速度，开发了一种胚胎排列装置，可高效完成胚胎的排列与注射，无需使用双面胶带固定胚胎（图3）。
此外，研究发现，在注射过程中保持胚胎湿润（用水）并避免胚胎干燥或用油覆盖，可提高存活率。同时，测试了多种毛细玻璃管类型，并确定了制备适用于N. vitripennis显微注射的最佳针头的参数（表1，图4）。另外，在显微注射后，将注射过的卵置于预先被刺伤且处于高湿度（70%）环境中的宿主体内进行孵化，可显著提高胚胎的存活率。这些改进使得N. vitripennis的显微注射操作更加高效且成功率更高。
根据用户的偏好，可对本实验方案中的注射装置和饲养流程进行一些微小的调整。然而，要成功在N. vitripennis中产生突变体，若干关键步骤至关重要。例如，操作需迅速，以确保注射的胚胎发育时间超过&#62;1小时，并且必须保证注射针足够锋利，以尽量减少对胚胎的损伤，这两点均至关重要。尽管本方案在多数（即使不是全部）基因的突变构建中均应有效，但其主要局限性在于CRISPR/Cas9系统需要靶向PAM（NGG）序列，这将决定可靶向的序列范围。
总之，这种改进的技术可用于产生多种基因组修饰，例如利用CRISPR/Cas9技术引入突变、缺失，甚至可能实现插入操作21，或进行转基因插入以创制转基因的 N. vitripennis，这将极大加速对该生物的功能研究。

宝石蜂， N. vitripennis 是该属四个物种之一 Nasonia 以腐食性蝇类为寄主的体外寄生蜂，例如 Sarcophaga bullata1由于其世代周期短、易于在实验室中培养，以及具有一系列独特且重要的生物学特性， N. vitripennis 一直是传统模式生物中多种实验工具开发的关注焦点。例如，某些独特的生物学特征包括单双倍体繁殖系统2与微生物和遗传寄生虫的关系3,4，以及一条额外染色体（B染色体）5,6,7综上所述，这些&#160;制作 N. vitripennis 一个重要的实验系统，可用于研究这些过程的分子和细胞机制，此外还可用于包括毒液产生在内的其他研究8,9性别决定10,11以及体轴模式形成的进化与发育12,13,14此外，研究生物学的遗传工具包 N. vitripennis 在过去十年左右，随着高分辨率基因组的测序完成，其研究进展显著加快15，多项基因表达研究16,17,18，以及利用RNA干扰（RNAi）在功能上阻断基因表达的能力19,20这些改进共同提升了对该生物体进行反向遗传学研究的可操作性和能力。
尽管在该生物体中已取得许多重要的科学进展并扩展了工具包，但根据目前的认知，仅有一家研究团队成功进行了胚胎显微注射，以产生可遗传的基因组修饰21。这主要是由于操作N. vitripennis胚胎存在困难，因为这些胚胎非常脆弱且体积微小，大小约为Drosophila melanogaster胚胎的三分之二，因此通常难以操作。此外，N. vitripennis雌性会将卵产入已被其蜇刺过的丽蝇蛹内，在其中完成整个胚胎发育、幼虫及蛹期发育过程。因此，为了成功进行显微注射，必须高效地从寄主蛹中收集处于囊胚前期的胚胎，迅速完成显微注射，并立即将其移植回寄主体内继续发育。这些步骤需要极高的精确度和操作技巧，以避免损伤被注射的胚胎或蛹期寄主，使得该技术极具挑战性。尽管如此，十余年前曾发表过一个简短的实验方案，描述了N. vitripennis胚胎的显微注射方法22。然而，该方法要求对刚产下的胚胎进行干燥处理，使用粘性胶带固定卵以进行显微注射，且未提供该技术的可视化演示。因此，本文描述了一种更新和修订后的实验流程，包含可视化操作步骤，详细阐述了一种改进的、分步进行的N. vitripennis胚胎显微注射方案，可供任何基础实验室参照执行，以在这一重要的模式昆虫中实现可遗传的基因组修饰。

<table><tbody><tr><td>Bugdorm</td><td>Bugdorm</td><td>41515</td><td>昆虫饲养笼</td></tr><tr><td>玻璃试管</td><td>Fisher Scientific</td><td>982010</td><td></td></tr><tr><td>肉蝇蛹，&lt;em&gt;Sarcophaga bullata&lt;/em&gt;</td><td>Carolina Insects</td><td>144440</td><td></td></tr><tr><td>微电极斜面研磨仪</td><td>Sutter Instruments</td><td>BV10</td><td></td></tr><tr><td>金刚石研磨板（适用于0.7μm至2.0μm尖端尺寸）</td><td>Sutter Instruments</td><td>104E</td><td></td></tr><tr><td>显微操作器</td><td>World Precision Instruments</td><td>Kite R</td><td></td></tr><tr><td>Femtojet Express 可编程微量注射仪</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微电极拉制仪</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000 或 P-2000</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Olympus</td><td>SZ51</td><td></td></tr><tr><td>复合光学显微镜</td><td>Leica DM-750</td><td></td><td></td></tr><tr><td>铝硅酸盐玻璃毛细管，外径1 mm，内径0.58 mm</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF100-58-10</td><td>也可使用硼硅酸盐玻璃或石英材质</td></tr><tr><td>Identi-Plugs</td><td>JAECE</td><td>L800-B</td><td>泡沫塞</td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-A3</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>VWR</td><td>48366045</td><td></td></tr><tr><td>粘合剂</td><td>Aron Alpha</td><td>AA471</td><td>用于将盖玻片粘合至载玻片</td></tr><tr><td>细尖毛笔</td><td>ZEM</td><td>2595</td><td></td></tr><tr><td>超细尖镊子</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-121</td><td></td></tr><tr><td>Femtotips 微量移液吸头加载尖端</td><td>Fisher Scientific</td><td>E5242956003</td><td></td></tr></tbody></table>

用于nasonia vitripennis基因组操作的胚胎显微注射与移植技术

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

jewel 蜂 Nasonia vitripennis 已成为研究包括性别决定、单双倍体性别决定、毒液合成以及宿主-共生体相互作用等多种生物学过程的有效模式系统。使用该生物体的一个主要限制是缺乏有效的定向基因组改造方法。基因组改造的一个重要环节是将编辑试剂（包括 CRISPR/Cas9 分子）通过显微注射导入胚胎。尽管显微注射技术在许多模式生物中已较为成熟，但在 N. vitripennis 中实施该技术尤为困难，主要原因是其胚胎体积微小，且胚胎发育完全发生在被寄生的丽蝇蛹体内。以下实验流程克服了这些重大技术挑战，展示了一种简化且可视化的操作方法，可有效将蜂类胚胎从被寄生的宿主蛹中取出，进行显微注射，并谨慎地将其重新移植回宿主体内，以继续并完成发育过程。该方案将显著增强各研究团队在此生物体中开展高级基因组改造的能力。

本方案提供了关于群体饲养、原肠胚前胚胎收集、排列、显微注射以及注射后移植的详细操作指南，可用于高效进行基因组编辑 N. vitripennis如所示 图2，成功进行显微注射的一般操作步骤顺序为 N. vitripennis 包括：（i）让雄性和雌性成虫交配（约4天），（ii）提供新鲜的寄生蝇蛹（S. bullata) 将交配后的雌虫置于改良的泡沫塞中以使其产卵（约 45 分钟），（iii）小心剥离被寄生的宿主蛹的表皮，以暴露并收集处于前囊胚期的蜂胚胎（约 15 分钟），（iv）对收集的胚胎进行排列（约 15 分钟），（v）向胚胎中显微注射基因组修饰组分（约 15 分钟），（vi）将注射后的胚胎小心放回先前已被蜇刺的宿主中，以使其正常发育（约 15 分钟），以及（vii）通过将注射后的胚胎/宿主转移至相对湿度约为 70% 的加湿培养 chamber 中，防止其脱水（约 15 分钟）。随后，将被寄生的宿主孵育约 14 天，以完成其充分发育 N. vitripennis 胚胎。注射后，成虫从宿主中羽化（viii），分离、交配，并 individually 筛查其是否含有预期的突变。
为了有效穿刺和显微注射 N. vitripennis 胚胎注射中，测试了多种含内丝的毛细玻璃针，包括石英、铝硅酸盐和硼硅酸盐类型。研究发现，针的质量对于避免注射过程中针头断裂或堵塞，以及实现较高的胚胎存活率和转化效率至关重要。针对每种玻璃类型，均开发出有效的拉针方案，以制备出理想的类似皮下注射针的长尖端 N. vitripennis 使用不同拉针仪（P-1000 和 P-2000）进行胚胎显微注射表 1, 图4).
为了优化该实验流程，通过注射不同剂量的基因组修饰组分后测定存活率。本实验所用的基因组修饰组分包括混合的引导RNA（gRNA）和Cas9蛋白，用于CRISPR介导的基因组编辑，此前已证明该组合在N. vitripennis21中具有良好的编辑效果。与先前报道类似，本研究设计并合成了靶向cinnabar基因的单导RNA（sgRNA）。通过靶向并破坏该基因，可在生物体的眼色上观察到易于识别的表型变化19,21。配制包含不同浓度sgRNA（0、20、40、80、160和320 ng/µL）与Cas9蛋白（0、20、40、80、160和320 ng/µL）组合的注射混合液，并将其注射至野生型N. vitripennis的胚胎中。结果显示，注射后胚胎的存活率呈剂量依赖性（表2）21。sgRNA和Cas9蛋白浓度的增加会导致存活率下降（表2），这可能是由于叠加的脱靶效应所致。此外，移植至寄主后维持较高的湿度（约70%）对胚胎存活也至关重要，因为在低湿度（约10%）条件下，所有注射后的胚胎均全部死亡。
<img alt="比较老年与年轻果蝇蛹；海绵围合实验装置设置" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56990/56990fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1. 宿主蛹的制备 (S. bullata 用于 N. vitripennis 胚胎产卵 (A年轻与年老 S. bullata 蛹。较老的蛹体壁颜色较深，而较年轻的蛹体壁则呈较明显的红褐色。为最大化产卵量，宜选用较年轻的蛹。蛹的后端与前端亦可区分，后端具一类似火山口的开口，前端则呈圆钝状。B宿主（S. bullata) 蛹的制备用于 N. vitripennis 胚胎产卵. 将寄主蛹插入已挖出与蛹大小相匹配孔洞的泡沫塞中，使寄主蛹的后端朝向泡沫塞内部，前端露出约0.2 cm，以确保产卵主要集中于前端区域。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56990/56990fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="黄蜂胚胎发育实验示意图；逐步时间线、显微观察、显微注射、寄主准备" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56990/56990fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2．通过显微注射创建 N. vitripennis 突变体的时间线。N. vitripennis 胚胎采集、CRISPR/Cas9 显微注射及注射后操作的时间流程。N. vitripennis 成虫在无产卵位点的条件下交配 4 天（i）。随后，将新鲜的腐肉蝇蛹 S. bullata 置于泡沫塞内，仅暴露其后端约 0.5 cm，并提供给 gravid 雌虫 45 分钟以完成寄生行为（ii）。同时准备显微注射所需材料，包括显微注射针和 CRISPR/Cas9 组分（iii）。从寄主体内收集胚胎（iv），排列整齐（v），并注射 CRISPR/Cas9 组分（vi）。将注射后的胚胎小心转移回预先被蜇刺过的寄主体内（vii），并在其中孵化直至完全发育（14 天）（viii）。成虫羽化后，筛选目标基因中预期由 CRISPR/Cas9 诱导突变所产生的表型（ix）。整个流程通常需 19 天完成。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56990/56990fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="薄膜沉积中的光学载玻片制备；图示为处于镀膜阶段的玻璃基底。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56990/56990fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 3"> 
图 3．用于排列胚胎的改良显微镜载玻片。（A）盖玻片。（B）显微镜载玻片。（C）胚胎排列装置。可将盖玻片粘附于显微镜载玻片上，用于在注射前对胚胎进行排列。盖玻片的作用是形成边缘，便于胚胎的操控与整齐排列。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56990/56990fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="微移液管拉制质量、尖端斜面比较；显微镜图像，1 mm 至 25 μm 尺度。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56990/56990fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4．注射针制备。（A）优质与劣质铝硅酸盐玻璃针的示例。（B）无斜面、正确斜面处理及斜面处理不良的针尖。采用微移液管拉制仪拉制铝硅酸盐玻璃毛细管，所得针尖随后使用斜面仪轻柔打开并修整。良好斜面处理的针尖极为锋利，而斜面处理不良的针尖则钝拙。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56990/56990fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>毛细玻璃类型</td>
			<td>Sutter 针状拉制仪型号</td>
			<td>加热</td>
			<td>灯丝</td>
			<td>速度</td>
			<td>延迟</td>
			<td>拉力</td>
			<td>压力</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>石英</td>
			<td>P-2000</td>
			<td>750</td>
			<td>4</td>
			<td>40</td>
			<td>150</td>
			<td>165</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>铝硅酸盐</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>605</td>
			<td>-</td>
			<td>130</td>
			<td>80</td>
			<td>70</td>
			<td>500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>硼硅酸盐</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>450</td>
			<td>-</td>
			<td>130</td>
			<td>80</td>
			<td>70</td>
			<td>500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 拉针仪参数设置。 
注意：拉针仪的设置因设备而异，因此每个实验室都需要优化自身的拉针仪参数。本表已根据 Li et al.21 进行修改
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="3">sgRNA-1</td>
			<td rowspan="3">Cas9</td>
			<td rowspan="3">总胚胎数</td>
			<td>移植（10% 湿度）</td>
			<td colspan="4">移植（70% 湿度）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>存活幼虫</td>
			<td>存活幼虫</td>
			<td colspan="3">存活成虫</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总计 (%)</td>
			<td>总计 (%)</td>
			<td>♂</td>
			<td>♀</td>
			<td>总计 (%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>未注射</td>
			<td>未注射</td>
			<td>100</td>
			<td>94 (94)</td>
			<td>96 (96)</td>
			<td>66</td>
			<td>26</td>
			<td>92 (92)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>水</td>
			<td>水</td>
			<td>100</td>
			<td>0 (0)</td>
			<td>78 (78)</td>
			<td>44</td>
			<td>32</td>
			<td>76 (76)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ng/µL</td>
			<td>20 ng/µL</td>
			<td>100</td>
			<td>0 (0)</td>
			<td>74 (74)</td>
			<td>34</td>
			<td>34</td>
			<td>68 (68)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 ng/µL</td>
			<td>40 ng/µL</td>
			<td>100</td>
			<td>0 (0)</td>
			<td>67 (67)</td>
			<td>30</td>
			<td>32</td>
			<td>62 (62)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80 ng/µL</td>
			<td>80 ng/µL</td>
			<td>100</td>
			<td>0 (0)</td>
			<td>53 (53)</td>
			<td>24</td>
			<td>22</td>
			<td>46 (46)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>160 ng/µL</td>
			<td>160 ng/µL</td>
			<td>100</td>
			<td>0 (0)</td>
			<td>41 (41)</td>
			<td>16</td>
			<td>22</td>
			<td>38 (38)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>320 ng/µL</td>
			<td>320 ng/µL</td>
			<td>100</td>
			<td>0 (0)</td>
			<td>25 (25)</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>20 (20)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2. 基于不同浓度sgRNA和Cas9注射的注射与移植后存活率及基因编辑效率。 本表格经修改自 Li et al.21

对Nasonia vitripennis胚胎进行显微注射是实现可遗传基因组修饰的关键方法。本文详细描述了Nasonia vitripennis胚胎的显微注射与移植操作步骤，该方法将极大促进未来对该生物体的基因组操作研究。

用于Nasonia vitripennis基因组操作的胚胎显微注射与移植技术

jewel蜂Nasonia vitripennis已成为研究性别决定、单双倍体性别决定等过程的有效模型系统……

本实验的总体目标是成功对纳氏茧蜂（nasonia vitripennis）胚胎进行显微注射，以实现基因组操作。该方法有助于解答与纳氏茧蜂生物学相关的关键科学问题，例如毒液生成和性别决定机制。该技术的主要优势在于能够直接对蜂类基因组进行操作，并可实现多种先进的基因组修饰。本实验操作将由本实验室的博士后 Ming Li 演示。首先，通过将 200 至 500 只成虫以雌雄比例 3:1 放入昆虫饲养笼中，建立多个 N.vitripennis 种群。将寄生蜂维持在 25 ± 1 °C、相对湿度 30% 及 12 小时光照/12 小时黑暗的条件下培养。连续两天，让交配后的雌蜂取食新鲜的 S.bullata 蛹，同时提供体积比为 1:10 的蔗糖水溶液小液滴供其摄食。随后两天，移除丽蝇蛹，使雌蜂无法进行产卵，从而使其处于高度 gravid（ gravid，指充满卵的状态）。为保持 S.bullata 蛹寄主的新鲜，获取后应立即在 4 摄氏度条件下保存，仅在使用时取出。区分具有红色蛹壳的年轻寄主与具有较深色蛹壳的老龄寄主。通过将单个新鲜的 S. bullata 蛹放入中心带有蛹大小孔洞的泡沫塞中，使雌性寄生蜂能够寄生年轻寄主。为了达到最高的寄生集中度并便于胚胎收集，仅暴露寄主前端约 0.2 厘米，前端呈圆形，而末端较粗厚，并具有火山口状的开口。将寄主蛹按此排列方式放入笼中，静置约45分钟，使寄生蜂完成寄生。通过手动取出寄生后的寄主，并轻轻敲击或吹去残留的寄生蜂，以去除已被寄生的寄主。每隔约15分钟更换一次新鲜寄主，以持续收集注射过程中的早期卵阶段样本。在解剖显微镜下，使用镊子小心剥离新寄生宿主蛹壳的后端，以暴露出N.vitripennis的卵。然后，通过使用液体粘合剂将盖玻片粘附到洁净的载玻片上，制备胚胎排列载片。用蘸湿的细头画笔轻轻将胚胎从宿主上刷下，注意不要损伤宿主柔软的蛹体表皮。然后，用湿润的画笔将约20个胚胎逐个转移至载玻片上，紧邻盖玻片的一侧。使胚胎的前端紧靠盖玻片边缘，确保所有胚胎的后端朝向同一方向。这样可提高对所有胚胎进行显微注射时定位的一致性和精确度。根据文本方案拉制注射针后，将针尖在25摄氏度下轻轻接触金刚石研磨板约10秒，以形成斜面。制备包含基因组修饰试剂的注射混合液，并将其置于冰上保存。使用微量加样吸头向注射针中加入两微升（2 µL）的注射混合液。然后，将带有排列胚胎的载玻片置于复式显微镜的载物台上。以25至35度的垂直角度，小心地将针头插入胚胎的后端。接着，注入1至5皮升的注射混合物，并确保胚胎因注射而轻微膨胀。如果发生堵塞，请尝试重新修整针头。N.vitripennis 胚胎的细胞质异常黏稠且具有黏性，容易导致针头频繁堵塞。每次注射约 20 至 40 枚卵后，应暂停操作。用湿润的画笔轻轻接触已注射的卵，将其转移至宿主中。随后，使用新鲜产出的新一批卵继续进行注射。理想情况下，此步骤由两人配合完成效果最佳：一人负责收集并排列卵，另一人负责注射基因组修饰组分，并将已注射的胚胎移植到宿主蛹中。显微注射后，使用湿润的画笔将最多40枚已注射的G零代胚胎逐个小心地放置到先前被蜇刺的S.bullata蛹体内。将寄主蛹放入含有湿润滤纸和棉球的培养皿中，并在25摄氏度、相对湿度约70%的条件下培养，直至注射的胚胎在约一至两天内孵化。重要的是，寄主蛹壳可被去除，只要在加湿的培养环境中孵化以防止干燥，N.vitripennis卵仍能正常发育。G0代胚胎孵化后，将寄主蛹转移到新的培养皿中，并在25摄氏度和70%湿度条件下培养。每天观察寄主蛹及注射过的G0代幼虫。如果寄主蛹出现异味，需将注射过的幼虫转移至新的健康寄主蛹中。为了有效穿刺并进行微注射到 N.vitripennis 胚胎中，测试了多种微电极拉制仪，并结合含丝毛细玻璃针使用，包括石英、铝硅酸盐和硼硅酸盐材质，以获得理想的类似皮下注射针的长尖端，适用于 N.vitripennis 胚胎的微注射。本实验所用的基因组修饰组分是混合的向导 RNA 与 Cas9 蛋白，用于 CRISPR 介导的基因组编辑。在本实验中，靶向 cinnabar 基因的单导向 RNA（sgRNA）以不同剂量与 Cas9 蛋白共同注射入 N.vitripennis 胚胎中。本表格显示，存活率呈剂量依赖性，sgRNA 和 Cas9 蛋白浓度增加导致存活率下降。在进行该操作时，需注意避免在操作或转移过程中刺破或干燥寄生蜂胚胎，应小心使用湿润的细头画笔或胚胎挑选工具。观看本视频后，您应能够充分掌握如何高效地获取、显微注射和移植寄生蜂胚胎，从而成功实现高级基因组编辑。

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科研

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遗传学

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