Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

该程序的总体目标是成功地对 nasonia vitripennis 胚胎进行显微注射，以促进基因组作。这种方法可以帮助回答与 nasonia vitripennis 生物学相关的关键问题，例如毒液产生和性别确定。使用这种技术的主要优点是它允许直接作 wasp 基因组，并提供各种高级基因组修饰。

演示该程序的是我们实验室的博士后 Ming Li。首先，通过在虫子宿舍笼中放置 200 到 500 只成虫，雌性与雄性比例为 3：1，建立几个 N.vitripennis 菌落。将黄蜂保持在 25 摄氏度以上或零下 1 摄氏度，相对湿度为 30%，光照/黑暗循环为 12 至 12 次。

两天，让交配的雌性以新鲜的 S.bullata 蛹以及 1 到 10 体积对体积蔗糖水溶液的小液滴为食。在接下来的两天里，去除吹蝇蛹以剥夺雌性黄蜂的产卵部位，使它们非常怀孕。为了保持 S.bullota 蛹宿主的新鲜，请在获得后立即将它们储存在 4 摄氏度，并且仅在需要时将其取出。

区分具有红色蛹的年轻宿主和具有深色蛹的老年宿主。通过将单个新鲜的 S.bullata 蛹放入泡沫塞中，并在中心切一个蛹大小的孔，让雌性黄蜂寄生在年轻的宿主体内。为了获得最大的寄生浓度和更容易的胚胎收集，仅暴露宿主前端约 0.2 厘米，与后端相比，它是圆形的，并且包含火山口状开口。

将这种布置的寄主蛹放入笼子中，等待大约 45 分钟，让黄蜂寄生它们。用手取回寄生的宿主，然后轻轻敲击或吹掉任何残留的黄蜂，以去除寄生的宿主。大约每 15 分钟用新鲜宿主替换一次，以便在注射过程中继续收集早期鸡蛋。

在解剖显微镜下，用镊子小心地剥去新鲜寄生的宿主的外部蛹的后端，以暴露 N.vitripennis 卵。然后，通过使用液体粘合剂将盖玻片粘在干净的载玻片上来准备胚胎对齐载玻片。用湿的细头画笔，小心地刷掉宿主的胚胎，确保不会损坏宿主柔软的蛹皮。

然后，用湿画笔将大约 20 个胚胎一个接一个地转移到载玻片上，紧邻盖玻片的一侧。将胚胎的前端对准盖玻片的边缘，使胚胎的后端指向同一方向。这将允许在所有胚胎中更精确地注射到同一位置。

根据文本方案拉动注射针后，将针尖在 25 摄氏度下轻轻接触金刚石研磨板约 10 秒钟，使针尖斜面。准备由基因组修饰试剂组成的注射混合物，并将其保存在冰上。使用微量进样器尖端向进样针中加入 2 微升进样混合物。

然后，将带有衬里胚胎的载玻片放在复合显微镜的载物台上。小心地将针头以 25 至 35 度的垂直角度插入胚胎的后端。然后，注射 1 至 5 皮升的注射混合物，并确保注射时 embyro 略微膨胀。

如果发生堵塞，请尝试重新对针头进行斜切。N.vitripennis 胚胎的细胞质异常粘稠，导致针头频繁堵塞。一次注射大约 20 到 40 个鸡蛋，然后停止注射。

用湿画笔轻轻触摸注射的鸡蛋，转移注射的鸡蛋，然后将它们放入主机中。然后，使用一批新鲜的、新产下的鸡蛋继续注射。理想情况下，当一个人收集和排列卵子，而另一个人正在注射基因组修饰成分并将注射的胚胎移植到宿主蛹中时，此步骤最有效。

显微注射后，使用湿画笔小心地将最多 40 个注射的 G zero 胚胎一次一个地放在先前被蜇伤的 S.bullata 蛹上。将寄主蛹放入装有湿滤纸和棉球的培养皿中，并在 25 摄氏度和大约 70% 的湿度下孵育，直到注射的胚胎在大约一到两天内孵化。重要的是，宿主可以留下剥落的蛹，只要它们在加湿室中孵化以防止干燥，N.vitripennis 卵就会正常发育。

G zero 胚胎孵化后，将宿主蛹转移到新的培养皿中，并在 25 摄氏度和 70% 湿度下孵育。监测宿主蛹并每天注射 G 零幼虫。如果寄主蛹有难闻的气味，请将注射的幼虫转移到新的健康寄主蛹上。

为了有效地针头穿透和显微注射到 N.vitripennis 胚胎中，使用几种类型的带有细丝的毛细管玻璃针头（包括石英、铝硅酸盐和硼硅酸盐）测试了不同的微量移液器拉拔器，以具有所需的皮下注射状长尖端，对 N.vitripennis 胚胎显微注射有效。这里使用的基因组修饰成分是混合向导 RNA 和 cas9 蛋白，用于更脆的介导基因组编辑。在这个实验中，以不同量的靶向朱砂基因的 sgRNA 与 cas9 蛋白一起注射到 N.vitripennis 中。

该表显示存活率是剂量依赖性的，因为 sgRNA 和 cas9 蛋白浓度的增加导致存活率降低。在尝试此程序时，重要的是要注意在作或转移过程中不要刺穿或干燥黄蜂胚胎，小心使用湿润的细头画笔或胚胎镐。观看此视频后，您应该对如何有效地取回、显微注射和移植黄蜂胚胎以成功进行高级基因组修饰有很好的了解。