从精确分期的早期Drosophila胚胎中构建全基因组染色质构象捕获文库

该方法有助于解答染色质结构领域中的关键问题，例如染色质的三维结构如何影响基因表达和发育过程。该技术的主要优势在于能够提供高分辨率的染色质结构图像以及精确分期的果蝇胚胎样本。尽管该方法可为染色质的组织方式及其在发育中的作用提供深入见解，研究者也可利用现有的转基因果蝇文库品系，检测其对染色质组织的影响。

开始实验方案时，用 PBST 将先前收集的胚胎总体积调至 2 毫升。加入 6 毫升正庚烷和 100 微升 37% 的甲醛水溶液。加入甲醛后，用力上下振荡试管 1 分钟。

水相和有机相将混合形成类似洗发水的质地。在旋转混合器上振荡混合物10分钟。在室温下以500 × g离心1分钟，使胚胎聚集在离心管底部。

吸弃全部类似洗发液的液体，注意不要吸走任何胚胎。加入甲醛15分钟后，将胚胎重悬于5毫升含125毫摩尔甘氨酸的PBST中。剧烈上下振荡胚胎1分钟。

离心后，吸除上清液。使用1,000微升移液器，将100个胚胎分批转移至适合分选的小型玻璃容器中， preferably置于深色背景下，并将其放置在冰上。使用针头或注射器尖端根据细胞核密度和细胞周期状态对胚胎进行分选。

移除所有有丝分裂期的胚胎，这些胚胎可通过其弥散且非核内的EGFP-PCNA分布来识别，同时移除部分显示非核内GFP信号的胚胎。为便于分选，每批样品中应排列核周期12、13和14的参考胚胎，以便将待分选胚胎与其中一个参考胚胎进行比对匹配。使用1,000微升移液器吸取所需胚胎。

将它们转移至新的离心管中，并置于冰上。继续操作直至筛选出足够用于计划实验的胚胎。在室温下以100 × g短暂离心。

吸除上清液，并确保胚胎尽可能干燥以进行冷冻。将装有胚胎的离心管浸入液氮中进行速冻，随后于-80摄氏度保存。将装有冷冻胚胎的离心管置于冰上。

将胚胎重悬于500微升预冷的裂解缓冲液中。静置1分钟，使胚胎沉降至管底。随后，使用预先在冰上冷却的金属微型研磨杵研磨胚胎，该研磨杵设计为与1.5毫升微量离心管紧密适配。

为避免刺激胚胎，将研杵缓慢插入，直至接触管底。下压后，将研杵在两个方向各旋转两次进行研磨。然后将研杵略微提起。

再次将管底沉淀物充分研磨，重复此研磨步骤10次，或直至胚胎完全裂解。溶液应呈均一状态，无任何残留的较大胚胎碎片。将匀浆后的悬液置于冰上孵育15分钟。

在 4 °C 条件下以 1,000 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，通过加入 500 µL 冰冷裂解缓冲液重悬沉淀，并反复吹打混匀以洗涤沉淀。再次离心后，弃去上清液。

将洗涤后的沉淀重悬于100微升0.5%十二烷基硫酸钠（SDS）中。然后将样品置于加热块中，在65摄氏度孵育10分钟，以透化细胞核。加入50微升10%Triton X-100和120微升水。

轻轻弹击离心管以混匀内容物，然后将离心管置于37摄氏度的加热块中孵育15分钟。加入25微升10倍限制性酶缓冲液和20单位（5单位/微升）的MBO1。轻轻弹击离心管以混匀内容物，然后将离心管置于加热块中孵育，以消化DNA。

再加入20单位的MBO1。继续孵育90分钟。第二次90分钟孵育结束后，将样品在62摄氏度下孵育20分钟，以灭活MBO1。

接下来，加入 18 微升 0.4 毫摩尔的生物素 14-dATP、2.25 微升未修饰的 3.3 毫摩尔 dCTP-dGTP-dTTP 混合液，以及 8 微升每微升含 5 个单位的 DNA 聚合酶 I Klenow 片段。轻弹管壁以混匀内容物，并将样品在 37 摄氏度孵育 90 分钟。随后，加入 657 微升水、120 微升 10× T4 DNA 连接酶缓冲液、100 微升 10% Triton X-100、6 微升每毫升 20 毫克的牛血清白蛋白，最后加入 5 微升每微升含 5 个单位的 T4 DNA 连接酶。

接下来，在室温下以 20 RPM 轻柔旋转离心管 2 小时。加入另外 5 微升浓度为每微升 5 个单位的 T4 DNA 连接酶。继续旋转 2 小时，然后在 2,500 ×g 下离心 5 分钟以沉淀细胞核。

离心后，弃去上清液。将沉淀物重悬于500 µL提取缓冲液中，并加入20 µL浓度为20 mg/mL的蛋白酶K。轻弹离心管，混匀后孵育以消化蛋白质。加入130 µL 5 M氯化钠溶液，过夜孵育以解除交联。

第二天，将样品移液至一个新的具有低DNA结合特性的2毫升离心管中。加入0.1倍体积的3摩尔醋酸钠和2微升15毫克/毫升的GlycoBlue。加入1.6倍体积的纯无水乙醇，颠倒混匀，然后将样品在-80摄氏度孵育15分钟。

孵育后，离心管内溶液。通过GlycoBlue染料定位DNA沉淀。小心移除上清液，将移液枪枪头沿与DNA沉淀相对的管壁插入管内。

用800微升70%乙醇洗涤沉淀。通过倒置混匀样品，并在室温下以20,000 × g离心5分钟。在此步骤及后续洗涤中，用P10吸头将残留液滴从管中推出，以去除残留液体，然后打开管盖，空气干燥最多5分钟。

当无液体残留时，加入 50 µL 的 10 mM Tris 氯化物。反复吹打溶液，使其覆盖沉淀所在区域，以溶解 DNA。加入 1 µL 的 20 mg/mL RNase A。通过轻弹管壁混匀。

将样品在 37 摄氏度下孵育 15 分钟以消化 RNA。最后，将样品保存在冷冻箱或冰箱中，直至进行文库制备。每批分选后胚胎的 EGFP PCNA 信号图像揭示了每个胚胎的精确发育阶段和细胞周期状态，可用于后续实验。

生物分析仪图谱显示，经过片段大小筛选后，DNA片段的大小分布在300至700个碱基对之间，峰值约为450个碱基对。Hi-C相互作用图谱显示，在核周期12时，几乎检测不到拓扑关联结构域（TADs），而在核周期13和14时，TADs变得 increasingly prominent，且非特异性的长距离互作显著减少。在进行该实验操作时，需注意彻底清洗磁珠，避免不必要的长时间孵育，尤其是在高温条件下，否则可能导致Hi-C文库质量降低。

这种结合了精确分期和高分辨率染色质构象作图的技术，为表观遗传学领域的研究人员探索三维染色质结构在体内发育环境中的作用铺平了道路。