Name: 大范围早期果蝇胚胎的全基因组染色质构象捕获库的生成 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-03T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: 了解高分辨率原位Hi-C文库制备方法，用于研究黑腹果蝇早期胚胎的染色质三维结构及其对基因表达和发育的影响。该技术为发育生物学研究提供重要工具。

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本研究由马克斯·普朗克学会资助。C.B.H. 获得国际马克斯·普朗克研究学院—分子生物医学项目的奖学金支持。我们感谢 Shelby Blythe 和 Eric Wieschaus 慷慨提供 eGFP-PCNA Drosophila melanogaster 果蝇品系。

1. Drosophila 胚胎收集
注意：可参照先前发表的研究15中所述方法进行等效的胚胎收集。
<ol>
	<li>将年轻的 eGFP-PCNA 果蝇（&#60;1 周龄）转移至带有酵母培养基收集板的产卵笼中16（含 1% 乙醇、1% 乙酸和 4% 琼脂）。</li>
	<li>将收集笼置于设定为 25 °C 的培养箱中。在收集卵前于培养箱中孵育 1–2 天可显著提高产卵量。每天更换收集板两次。</li>
	<li>每隔 30–60 分钟从收集室中取出含有胚胎的培养板。间隔时间越短，获得的胚胎数量越少，但胚胎发育阶段更集中。应同时从多个收集笼中收集，理想情况下每 30–60 分钟可获得 &#62;200 个卵。</li>
	<li>将培养板在 25 °C 下保存，直至胚胎发育至所需年龄。对于囊胚期胚胎（核周期 14），约需孵育 2 小时。</li>
	<li>孵育 2 小时后，用喷瓶向收集板中加入自来水，使整个板面被水覆盖。使用软毛刷轻轻搅动，使胚胎和酵母悬浮。</li>
	<li>将悬浮的胚胎从收集板倒入胚胎收集篮（市售细胞筛网，孔径 100 µm，或自制筛篮17 均适用），必要时可继续用喷瓶加入自来水。在此阶段，将所有平行收集的培养板中的胚胎合并。合并后的样品视为同一批次。</li>
	<li>用喷瓶中的自来水冲洗收集篮 30 秒，充分清洗胚胎，直至所有酵母残留物被完全去除。</li>
	<li>将收集篮浸入含 2.5% 次氯酸钠的水溶液中以去除卵壳。轻轻晃动有助于卵壳脱落。持续处理直至胚胎具有足够的疏水性，当将篮子提出并再次浸入溶液时，胚胎能漂浮于液面，此过程通常需要约 1.75–2 分钟。 
	注意：次氯酸钠具有腐蚀性，操作时应穿戴适当的个人防护装备。含 &#60;10% 次氯酸钠的溶液通常可直接排入下水道，但需确认所在机构的相关规定。</li>
	<li>将收集篮从溶液中取出，用喷瓶中的自来水彻底冲洗，直至无法察觉到漂白剂气味为止。</li>
</ol>
2. 胚胎固定
注意：最佳固定条件（主要指去垢剂、甲醛的浓度以及固定时间）需要根据胚胎发育阶段通过实验确定。对于合胞体囊胚阶段左右的胚胎，水相中终浓度为 0.5% Triton X-100 和 1.8% 甲醛的效果较好。对于胚胎第 9 阶段以后的较晚阶段，可能需要进一步优化这些参数。固定和分选过程中使用的所有溶液均应含有蛋白酶抑制剂。
<ol>
	<li>将收集篮倒置，罩在15 mL圆锥形离心管上。用巴斯德移液管吸取PBS-T（PBS，0.5% Triton X-100）将胚胎从收集篮冲洗至离心管中。</li>
	<li>让胚胎沉降至管底，用PBS-T调节总体积至2 mL。</li>
	<li>加入6 mL正庚烷和100 µL 37%的甲醛水溶液。 
	注意：正庚烷和甲醛在吸入或皮肤接触时具有毒性。操作时应穿戴适当的个人防护装备，并在通风橱中进行。含正庚烷或甲醛的废液必须根据所在机构的规定单独处理。</li>
	<li>加入甲醛后，启动15分钟计时器，并用手剧烈上下震荡离心管1分钟。水相与有机相将混合形成类似洗发水的粘稠状液体。</li>
	<li>在旋转混合器上继续振荡，直至加入甲醛后10分钟为止。</li>
	<li>在室温下以500 × g 离心1分钟，使胚胎沉降至管底。</li>
	<li>完全吸除呈洗发水状的液体并弃去，注意不要吸走胚胎。残留少量该上清液不会造成问题。</li>
	<li>加入甲醛15分钟后，将胚胎重悬于5 mL含125 mM甘氨酸的PBS-T中，以淬灭甲醛活性。上下剧烈震荡1分钟，充分混匀。</li>
	<li>在室温下以500 × g 离心1分钟，吸除上清液。</li>
	<li>用5 mL预冷的PBS-T重悬胚胎进行洗涤。待胚胎沉降后，吸除全部上清液。</li>
	<li>重复步骤2.10的洗涤操作再进行两次。</li>
	<li>将胚胎置于冰上保存直至分选。通常建议在进行分选前收集3–4批果蝇胚胎。但胚胎应在同一天内完成分选，长时间在冰上或冰箱中储存会导致胚胎形态改变。</li>
</ol>
3. 胚胎分选
注意：可在配备 GFP 滤光片且放大倍数为 60–80X 的任何荧光体视显微镜上进行分选。
<ol>
	<li>使用 1,000 µL 移液器，将约 100 个胚胎转移至一个适合分选的小型玻璃容器中，容器最好为深色，并将其置于冰上。</li>
	<li>根据细胞核密度和细胞周期状态（图 1）进行胚胎分选，使用针头或注射器尖端将目标胚胎推至单独的一堆。
	<ol>
		<li>去除所有 eGFP-PCNA 呈弥散分布、非细胞核定位的胚胎（图 1E）。部分显示非细胞核 GFP 信号的胚胎也应去除。</li>
		<li>为便于分选，可参考 图 1 中的图像，在每批胚胎中分别挑选出核周期 12、13 和 14 的参考胚胎并排成一列。利用该系列参考胚胎比对未知发育阶段的胚胎，以确定其发育阶段。</li>
		<li>为验证参考胚胎的发育阶段，可通过成像软件（提供距离信息）对胚胎进行成像，并在 2,500 µm2 面积内计数胚胎表面的细胞核数量，以测定细胞核密度。 
		注意：在核周期 12 时，2,500 µm2 面积内的预期细胞核数量为 12 至 16 个；在核周期 13 时为 20 至 30 个13。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>当所有目标发育阶段的胚胎完成分离后，对胚胎进行拍照，用于记录和质量控制。若体视显微镜本身未配备相机模块，可使用任何配备 GFP 滤光片的落射荧光显微镜。</li>
	<li>使用 1,000 µL 移液器吸取目标胚胎，转移至新的离心管中，并置于冰上。</li>
	<li>重复上述操作，直至获得足够数量的胚胎用于计划中的实验。对于发育阶段晚于 9 阶段的胚胎，通常 20 个胚胎足以进行一次 原位 Hi-C 实验。在核周期 12 时，建议起始数量为 80 个胚胎。在更早的周期中，每个周期所需的胚胎数量应大致翻倍。</li>
	<li>将分选后的胚胎汇集后分装至 1.5 mL 离心管中，每管装入足够进行一次 原位 Hi-C 实验的胚胎数量。建议使用低 DNA 结合特性的离心管，因为同一离心管将用于整个实验流程，而在低 DNA 浓度下，DNA 吸附可能导致显著损失。</li>
	<li>在室温下以 100 x g 短暂离心，去除上清液。胚胎应尽可能干燥，以便后续冷冻。</li>
	<li>通过将离心管浸入液氮中快速冷冻胚胎，并于 -80 °C 保存。</li>
</ol>
4. 原位 Hi-C
<ol>
	<li>裂解
	<ol>
		<li>将装有冷冻胚胎的离心管置于冰上。</li>
		<li>用500 µL预冷的裂解缓冲液（10 mM Tris-Cl pH 8.0，10 mM NaCl，0.2% IGEPAL CA-630，蛋白酶抑制剂；溶于水中）重悬胚胎。静置1分钟，使胚胎沉降至管底。</li>
		<li>使用金属微型研杵研磨胚胎，研杵需预先在冰上预冷，并且设计为紧密适配1.5 mL微量离心管。
		<ol>
			<li>为避免扰动胚胎，缓慢插入研杵直至接触管底，向下压紧，然后通过在两个方向各旋转两次进行研磨。</li>
			<li>将研杵略微提起，再次压至管底，重复研磨操作。</li>
			<li>重复步骤4.1.3.2共10次，或直至胚胎完全裂解。溶液应呈均一状态，无残留的大块胚胎组织。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将匀浆后的悬液在冰上孵育15分钟。在4 °C下以1,000 × g离心5分钟，弃去上清液。</li>
		<li>用500 µL预冷的裂解缓冲液重悬沉淀，通过移液器反复吹打混匀。</li>
		<li>再次按照步骤4.1.4的条件离心，弃去上清液。</li>
		<li>用100 µL 0.5%十二烷基硫酸钠（SDS）重悬洗涤后的沉淀，反复吹打混匀。将核膜通透化：在加热金属块中65 °C孵育10分钟。加入50 µL 10% Triton X-100和120 µL水以淬灭SDS，通过轻弹管壁混匀。</li>
		<li>在加热金属块中37 °C孵育15分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>限制性内切酶消化
	<ol>
		<li>加入25 µL 10×限制性内切酶缓冲液和20 U的MboI（5 U/µL），通过轻弹管壁混匀。</li>
		<li>在加热金属块中37 °C孵育90分钟，轻微振荡（750 rpm），以消化DNA。</li>
		<li>再加入20 U MboI，继续孵育90分钟。</li>
		<li>在62 °C孵育20分钟，使MboI热失活。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>突出端补平 
	注意：使用生物素标记的dATP填补突出端可实现对特定连接片段的选择性富集。在连接位点处的生物素-dATP可免受T4 DNA聚合酶（第4.6节）外切酶活性的影响，而未连接的平末端上的生物素-dATP则会被高效去除。因此，在第4.7节中使用链霉亲和素包被的磁珠进行下拉，可特异性富集连接形成的嵌合DNA片段。
	<ol>
		<li>加入18 µL 0.4 mM生物素-14-dATP、2.25 µL未标记的dCTP/dGTP/dTTP混合液（每种3.3 mM）和8 µL 5 U/µL DNA聚合酶I Klenow片段。</li>
		<li>通过轻弹管壁混匀，在加热金属块中37 °C孵育90分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>连接
	<ol>
		<li>加入657 µL水、120 µL 10× T4 DNA连接酶缓冲液、100 µL 10% Triton X-100、6 µL 20 mg/mL牛血清白蛋白（BSA），通过轻弹管壁混匀。最后加入5 µL 5 U/µL T4 DNA连接酶，再次轻弹混匀。</li>
		<li>室温下缓慢旋转（20 rpm）2小时。</li>
		<li>加入第二份5 µL 5 U/µL T4 DNA连接酶，继续旋转2小时。</li>
		<li>在2,500 × g下离心5分钟，收集核沉淀，弃去上清液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DNA提取
	<ol>
		<li>用500 µL提取缓冲液（50 mM Tris-Cl pH 8.0，50 mM NaCl，1 mM乙二胺四乙酸（EDTA），1% SDS；溶于水中）重悬沉淀，并加入20 µL 20 mg/mL蛋白酶K。通过轻弹管壁混匀。</li>
		<li>在55 °C孵育30分钟，以1,000 rpm振荡，以消化蛋白质。</li>
		<li>为解除交联，加入130 µL 5 M NaCl，在68 °C孵育过夜，以1,000 rpm振荡。</li>
		<li>将样品转移至新的2 mL离心管中，优先选择低DNA结合特性的管子。</li>
		<li>加入0.1倍体积（63 µL）的3 M乙酸钠（pH 5.2）和2 µL 15 mg/mL GlycoBlue。通过反复颠倒充分混匀。加入1.6倍体积（1,008 µL）无水乙醇，再次颠倒混匀。</li>
		<li>在-80 °C孵育15分钟。在4 °C下以20,000 × g离心至少30分钟。DNA沉淀通常非常小，几乎不可见，但可通过GlycoBlue的蓝色识别。</li>
		<li>小心移除上清液，将移液器吸头沿沉淀所在管壁的对侧插入管内。残留的小液滴通常可在本步骤及后续洗涤中通过P10吸头将其推出管外而清除，而非直接吸取。</li>
		<li>加入800 µL 70%乙醇洗涤沉淀。颠倒混匀后，在室温下以20,000 × g离心5分钟。至少重复此洗涤步骤一次。</li>
		<li>彻底去除乙醇残留，打开管盖静置最多5分钟以空气干燥。确认无液体残留后，加入50 µL 10 mM Tris-Cl pH 8.0。反复吹打溶液，使其经过管壁上沉淀所在区域，以充分溶解DNA。</li>
		<li>加入1 µL 20 mg/mL RNase A，轻弹管壁混匀，在37 °C孵育15分钟以消化RNA。样品可在此后于冰箱中过夜保存，或长期冻存于-20 °C。</li>
		<li>根据制造商说明书，使用基于荧光染料的检测方法测定DNA浓度。样品中总DNA量应至少为10 ng，否则可用于扩增的材料不足，文库复杂度可能较低。若出现此情况，可能是起始材料不足，或在裂解和沉淀过程中发生了样品损失。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>生物素去除与DNA片段化
	<ol>
		<li>将12 µL 10× T4 DNA聚合酶缓冲液、3 µL 1 mM dATP、3 µL 1 mM dGTP和46 µL水混合，轻弹管壁混匀。加入5 µL 3 U/mL T4 DNA聚合酶，再次轻弹混匀，在20 °C孵育30分钟。</li>
		<li>加入3 µL 0.5 M EDTA终止反应，并加水将样品体积调整至约120 µL。</li>
		<li>根据制造商说明书，使用超声破碎仪将DNA片段化至200–400 bp。若使用材料表中提及的超声仪，建议采用以下程序：共2个循环，每个循环50秒，占空比10%，强度5，每秒200个脉冲。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>生物素下拉
	<ol>
		<li>将30 µL 10 mg/mL链霉亲和素包被的磁珠转移至新管中，置于磁力架上分离磁珠，弃去上清液。</li>
		<li>用1× B&amp;W缓冲液（5 mM Tris-Cl pH 7.4，0.5 mM EDTA，1 M NaCl；溶于水中）加0.1% Triton X-100重悬磁珠，涡旋混匀。将管子置于磁力架上，等待1–5分钟（具体时间取决于磁珠品牌和型号），直至磁珠完全分离。</li>
		<li>沿磁珠所在管壁对侧滑动移液器吸头，吸除并弃去上清液。用120 µL 2× B&amp;W缓冲液（10 mM Tris-Cl pH 7.4，1 mM EDTA，2 M NaCl）重悬磁珠，涡旋混匀。</li>
		<li>将片段化的DNA转移至新的低DNA结合管中，加入120 µL用2× B&amp;W缓冲液重悬的磁珠悬液，涡旋混匀。将磁珠与DNA样品在20 rpm下旋转孵育15分钟。</li>
		<li>将磁珠置于磁力架上分离，弃去上清液。</li>
		<li>用600 µL 1× B&amp;W缓冲液加0.1% Triton X-100重悬磁珠，在55 °C孵育2分钟，以1,000 rpm振荡。分离后弃去上清液。重复此洗涤步骤一次。</li>
		<li>用600 µL 10 mM Tris-Cl pH 8.0洗涤磁珠一次，分离后弃去上清液。</li>
		<li>用50 µL 10 mM Tris-Cl pH 8.0重悬磁珠。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 测序文库制备
注意：所有文库构建步骤均使用商业DNA文库制备试剂盒中的组分（参见材料表）。然而，也可使用其他替代试剂盒或试剂。文库制备试剂在冷冻保存过程中容易产生沉淀，因此在使用前必须确保所有沉淀完全溶解。
<ol>
	<li>末端修复
	<ol>
		<li>将50 µL含10 mM Tris-Cl（pH 8.0）的磁珠悬浮液转移至新的PCR管中。</li>
		<li>加入3 µL末端修复酶混合液（End Prep Enzyme Mix）和7 µL末端修复反应缓冲液（End Prep Reaction Buffer），通过移液器反复吹打混匀。</li>
		<li>将PCR管放入热循环仪中，运行以下程序：20 °C孵育30分钟，65 °C孵育30分钟，然后保持在4 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>接头连接
	<ol>
		<li>向磁珠悬浮液中加入30 µL连接主混合液（Ligation Master Mix）、2.5 µL 1.5 µM测序接头（将储备液稀释至1.5 µM）和1 µL连接增强剂（Ligation Enhancer），通过移液器反复吹打混匀。</li>
		<li>在热循环仪中20 °C孵育15分钟。</li>
		<li>加入3 µL USER酶，通过移液器反复吹打混匀。</li>
		<li>在热循环仪中37 °C孵育15分钟。</li>
		<li>将PCR管置于磁力架上分离磁珠，弃去上清液。</li>
		<li>洗涤磁珠：加入100 µL 1× B&amp;W缓冲液 + 0.1% Triton X-100，涡旋振荡重悬磁珠，转移至新的微量离心管中。置于磁力架上分离磁珠，弃去上清液。</li>
		<li>使用600 µL相同缓冲液重复洗涤一次。</li>
		<li>加入600 µL 10 mM Tris-Cl（pH 8.0）重悬磁珠，涡旋振荡混匀，将磁珠转移至新管中。</li>
		<li>置于磁力架上分离磁珠，弃去上清液，再用50 µL 10 mM Tris-Cl（pH 8.0）重悬磁珠。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PCR扩增
	<ol>
		<li>准备两个PCR管，每管中加入25 µL聚合酶主混合液（Polymerase Master Mix）、1.5 µL 10 µM正向（无索引）PCR引物和1.5 µL 10 µM反向（带索引）PCR引物。 
		注：正向（无索引）PCR引物： 
		5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3´。 
		反向（带索引）PCR引物： 
		5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC*T-3´。*表示硫代磷酸键，Ns表示带索引PCR引物中的可变碱基。</li>
		<li>每管中加入22 µL磁珠悬浮液，通过移液器反复吹打混匀。</li>
		<li>使用以下程序进行PCR扩增：98 °C预变性1分钟，(98 °C变性15秒，65 °C退火延伸75秒，升温速率1.5 °C/s)重复9–12个循环，65 °C最终延伸5分钟，然后保持在4 °C。 
		注：扩增循环数需根据实验经验确定。我们发现，若扩增循环数超过12个，文库复杂度通常较低，难以获得高质量的Hi-C图谱；而扩增循环数少于12个的文库，即使扩增至12个循环，也不会对质量产生负面影响。因此，可默认采用12个循环进行扩增。</li>
		<li>将两个PCR反应产物合并至同一微量离心管中，置于磁力架上分离磁珠，将含有文库的上清液转移至新管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>片段大小选择
	<ol>
		<li>将Ampure XP磁珠悬浮液恢复至室温，充分振荡混匀。</li>
		<li>用水将合并后的PCR反应液体积精确调整至200 µL。在PCR和磁珠分离过程中通常会损失部分体积。可通过将移液器设定为200 µL吸取全部反应液来验证体积：若吸入空气，则需补充更多水；若体积超过200 µL，则需按比例调整步骤5.4.3和5.4.6中加入的磁珠体积。 
		注：括号中所示体积适用于合并后的PCR反应液总体积恰好为200 µL的情况。</li>
		<li>加入0.55倍体积（110 µL）的Ampure XP磁珠悬浮液，通过移液器反复吹打至少10次混匀。</li>
		<li>室温孵育5分钟，置于磁力架上分离磁珠5分钟。</li>
		<li>将上清液转移至新管中，弃去含有磁珠的原管。磁珠结合了长度&#62;700 bp的DNA片段，该片段过大，无法用于测序。</li>
		<li>向上清液中加入0.2倍体积（40 µL，使样品中Ampure缓冲液总体积达到0.75倍）的Ampure XP磁珠悬浮液，通过移液器反复吹打10次混匀。</li>
		<li>室温孵育5分钟，置于磁力架上分离磁珠5分钟。</li>
		<li>弃去上清液，其中含有长度&#60;200 bp的DNA片段，包括游离引物、引物二聚体以及过小而无法测序的片段。</li>
		<li>将管子保留在磁力架上，加入700 µL 80%乙醇进行洗涤，注意不要扰动磁珠沉淀，孵育30秒。</li>
		<li>弃去乙醇，将管子从磁力架上取下，用100 µL 10 mM Tris-Cl（pH 8.0）重悬磁珠，通过移液器反复吹打10次混匀，室温孵育1分钟。</li>
		<li>加入0.8倍体积（80 µL）的Ampure XP磁珠悬浮液，通过移液器反复吹打10次混匀，室温孵育5分钟。此第二轮低片段大小筛选可确保最终文库完全去除引物和引物二聚体。</li>
		<li>置于磁力架上分离磁珠5分钟，弃去上清液。</li>
		<li>在磁力架上用700 µL 80%乙醇洗涤磁珠沉淀两次，每次30秒，操作同上。</li>
		<li>保持管子在磁力架上，彻底去除残留乙醇。可使用P10移液器将管壁上的乙醇液滴推出以助去除。让残留乙醇在空气中挥发最多5分钟。</li>
		<li>将管子从磁力架上取下，用50 µL 10 mM Tris-Cl（pH 8.0）重悬磁珠，通过移液器反复吹打10次混匀。</li>
		<li>室温孵育5分钟，然后置于磁力架上分离磁珠。</li>
		<li>将上清液转移至新管中。此即为最终的Hi-C文库，可按照制造商说明进行定量，并在下一代测序平台上进行测序。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Bonev, B., Cavalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+function+of+the+3D+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Organization and function of the 3D genome.</a> Nat Rev Genet. 17 (11), 661-678 (2016).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所展示的方案在生成早期Drosophila胚胎染色质结构的高质量图谱方面非常有效。与先前的方案34相比，此处描述的方法采用了最新的in situ Hi-C技术5，从而实现了更快的处理速度、更高的分辨率以及更少的试剂消耗。in situ Hi-C方案在内的整体流程预计可适用于除Drosophila以外的多种发育阶段和实验体系。由于该方案对起始材料需求量较低，因此也可用于分离的细胞群体。在Drosophila中，若将本方案用于本文所述范围之外的胚胎阶段，某些参数（特别是材料的固定条件）可能需要调整。由于较老的胚胎会形成高度不透性的角质层，因此可能需要提高甲醛浓度并延长固定时间。对于核周期14以外阶段的胚胎收集，步骤1.4中胚胎在25 °C下的孵育时间需作如下调整：核周期12为70分钟，核周期13为90分钟，3–4 hpf为3小时30分钟。
在13次卵裂分裂期间（第1-4阶段），细胞核密度在每次分裂后大约增加一倍。细胞核可通过其明亮的GFP荧光轻松识别。在有丝分裂过程中，eGFP-PCNA不位于细胞核内，其信号在整个胚胎中弥散分布。这一特征使得识别正在进行同步卵裂分裂的胚胎成为可能。在研究染色质构象时，通常不希望使用处于有丝分裂期的胚胎，因为有丝分裂期染色质的组织结构与间期存在显著差异35。可以调整实验方案，以专门筛选处于同步有丝分裂期的胚胎。在这种情况下，应仅保留eGFP-PCNA呈弥散、非核定位分布的胚胎，其余胚胎均应弃去。由于此时无法确定细胞核密度，必须采用基于明场显微镜下胚胎形态观察的替代方法对胚胎进行分期。极细胞的存在以及胚胎边缘出现细胞核，表明胚胎至少已完成第9次核分裂周期；而边缘出现明显的细胞化现象，则表明已进入第14次核分裂周期12。
Hi-C 实验可使用多种限制性内切酶成功进行5。目前常用的方法通常采用识别 4 个碱基序列（如 MboI）或 6 个碱基识别位点（如 HindIII）的酶。相较于 6 碱基切割酶，4 碱基切割酶的优势在于，在测序深度足够的情况下，可提供更高的潜在分辨率，并在整个基因组中实现更均匀的限制性位点覆盖。在不同 4 碱基切割酶之间进行选择并无明显优势5,23,36,37。目前使用最广泛的两种酶 MboI 和 DpnII 均识别相同的 GATC 位点。DpnII 对 CpG 甲基化的敏感性较低，但在果蝇（Drosophila）中这一因素无需考虑。本文所介绍的实验方案也可使用 DpnII 作为限制性内切酶成功完成。此时，在第 4.2 节中需根据生产商的建议，调整所用的限制性内切酶及相应的缓冲液以适配 DpnII。
如果测序文库的片段大小显著偏离图2A所示范围，则测序过程中的簇生成效率可能降低，甚至完全失败。此时，应检查打断后的片段大小分布，并相应调整打断参数。DNA片段分布中出现极小（&#60;100 bp）或极大（&#62;1,000 bp）片段的峰，提示片段大小选择存在问题，例如本应弃去的磁珠或上清液发生残留。通常情况下，即使存在这些非理想大小片段的小峰（如图中所示），文库仍可成功测序，仅簇生成效率略有下降。
应避免出现高比例的PCR重复序列，因为这会显著减少可用的测序读段数量。PCR重复序列的比例与起始投入的材料量直接相关。因此，通常增加投入量可缓解PCR重复问题。
由于读段方向问题被过滤的读段数量较多 (图2B) 表明消化不充分，可能由酶用量过少、投入材料过多或胚胎未充分匀浆所致。

染色质构象捕获技术（3C）已成为研究细胞核内染色质拓扑结构的一种极为有用的方法1。3C 的一种变体 Hi-C 能够在单次实验中测量细胞核内所有染色质相互作用的接触频率2。Hi-C 技术的应用在发现和表征许多染色质组织的基本原理（如拓扑关联结构域（TADs）、区室结构和染色质环）方面发挥了重要作用3,4,5。
在发育转变和细胞分化背景下对染色质结构的研究正日益被用于揭示这些过程中基因调控的机制6,7,8,9其中一个备受关注的模式生物是 黑腹果蝇，其发育过程和基因组已被充分表征。然而，针对其染色质结构的研究仍较为有限 果蝇 外部 体外 组织培养条件已实施10,11在受精后16至18小时的胚胎中，鉴定出与哺乳动物中类似结构相似的拓扑关联结构域（TADs）和区室结构10，这引发了一个问题：它们在基因调控中发挥了何种作用 黑腹果蝇 胚胎发育。尤其是在原肠胚形成之前的发育早期阶段，此类研究在技术上具有挑战性。在原肠胚形成之前， 果蝇 胚胎经历13次同步的核分裂，每次分裂周期以极快的速度进行，为8–60分钟12,13此外，由于缺乏可用于区分不同阶段的视觉特征，难以获得足量且发育阶段高度一致的胚胎材料。
为了建立一种能够在核分裂周期分辨率下研究早期Drosophila发育过程中染色质结构的实验方案，我们结合了两种现有技术：原位 Hi-C 技术，可用于生成高分辨率的全基因组染色质相互作用图谱5，以及利用表达 eGFP-PCNA 转基因的转基因Drosophila品系进行胚胎分期13,14。该转基因在间期定位于细胞核内，在合胞体囊胚的有丝分裂期间则弥散分布。利用这一特性，可通过细胞核密度区分不同发育阶段，并通过 GFP 信号的弥散情况识别处于有丝分裂的胚胎。
这些技术共同实现了仅需20个细胞即可高分辨率地研究染色质的三维结构 果蝇 胚胎。本方案包含收获与分选胚胎的步骤说明 果蝇 胚胎以获得处于单个核分裂周期的胚胎群体。此外，还描述了如何利用所获得的胚胎进行实验操作 原位 Hi-C。最终结果是获得适用于在下一代测序仪上进行测序的核苷酸文库。所得测序读长可进一步处理为覆盖全基因组的高分辨率染色质相互作用图谱 果蝇 基因组

<table><tbody><tr><td>生物素-14-dATP</td><td>Life Technologies</td><td>19524016</td><td></td></tr><tr><td>MboI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0147L</td><td></td></tr><tr><td>DNA聚合酶I Klenow片段</td><td>New England Biolabs</td><td>M0210L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA连接酶</td><td>Thermo Fisher</td><td>EL0012</td><td>包含T4 DNA连接酶缓冲液</td></tr><tr><td>T4 DNA聚合酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203L</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶K</td><td>AppliChem</td><td>A4392</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Life Technologies</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>Complete Ultra无EDTA蛋白酶抑制剂</td><td>Roche</td><td>5892791001</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Illumina多重寡核苷酸&amp;nbsp;（Index引物集1）</td><td>New England Biolabs</td><td>E7335</td><td>文库构建部分中使用的测序接头、正向（无索引）PCR引物、反向（带索引）PCR引物以及USER酶均为该试剂盒的组分</td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II DNA文库构建试剂盒</td><td>New England Biolabs</td><td>E7645</td><td>文库构建部分中使用的末端修复酶混合物、末端修复反应缓冲液、连接增强剂、连接主混合液和聚合酶主混合液均为该试剂盒的组分</td></tr><tr><td>Covaris S2 AFA系统</td><td>Covaris</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind管，1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030108051</td><td></td></tr><tr><td>Falcon细胞滤网，100 &amp;micro;m</td><td>Corning</td><td>352360</td><td>胚胎收集篮</td></tr><tr><td>37%甲醛</td><td>VWR</td><td>437536C</td><td></td></tr><tr><td>正庚烷</td><td>AppliChem</td><td>122062.1612</td><td></td></tr><tr><td>M165 FC荧光体视显微镜</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>M165 FC DFC相机</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>金属微型研杵</td><td>Carl Roth</td><td>P985.1</td><td>用于第4.1.4步裂解胚胎</td></tr><tr><td>核糖核酸酶A</td><td>AppliChem</td><td>A3832,0050</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne链霉亲和素C1</td><td>Life Technologies</td><td>65002</td><td>包被链霉亲和素的磁珠</td></tr><tr><td>Ampure XP磁珠</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0荧光计</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Qubit检测管</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS检测试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>eGFP-PCNA果蝇</td><td>由S. Blythe和E. Wieschaus惠赠</td><td></td><td></td></tr><tr><td>13%次氯酸钠</td><td>Thermo Fisher</td><td>AC219255000</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>AppliChem</td><td>A4975</td><td></td></tr><tr><td>分子生物学用Tris缓冲液pH 8.0（1 M）</td><td>AppliChem</td><td>A4577</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>AppliChem</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8896</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL微量离心管</td><td>Greiner Bio-One</td><td>616201</td><td></td></tr><tr><td>分子生物学用SDS</td><td>AppliChem</td><td>A2263</td><td></td></tr><tr><td>10x CutSmart缓冲液</td><td>New England Biolabs</td><td>B7204S</td><td>限制性内切酶缓冲液</td></tr><tr><td>PCR核苷酸混合液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11814362001</td><td>未修饰的dCTP、dGTP、dTTP</td></tr><tr><td>BSA，分子生物学级</td><td>New England Biolabs</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>分子生物学用EDTA 0.5 M溶液</td><td>AppliChem</td><td>A4892</td><td></td></tr><tr><td>3 M pH 5.2乙酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7899</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2磁力架</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td>磁力架</td></tr><tr><td>Intelli-Mixer RM-2L</td><td>Omnilab</td><td>5729802</td><td>旋转混合仪</td></tr><tr><td>ThermoMixer F1.5</td><td>Eppendorf</td><td>5384000012</td><td>混合仪</td></tr><tr><td>小型胚胎收集笼</td><td>Flystuff.com</td><td>59-100</td><td>卵收集笼</td></tr><tr><td>Centrifuge 5424&amp;nbsp;R</td><td>Eppendorf</td><td>5404000413</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch梯度PCR仪</td><td>Bio-Rad</td><td>1851148</td><td></td></tr><tr><td>PCR管条</td><td>Greiner Bio-One</td><td>673275</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 2.1</td><td>New England Biolabs</td><td>B7202S</td><td>T4 DNA聚合酶缓冲液</td></tr></tbody></table>

从精确分期的早期drosophila胚胎中构建全基因组染色质构象捕获文库

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

研究染色质的三维结构可为基因调控机制提供宝贵的见解。本文介绍了一种染色质构象捕获技术的实验方案。 原位 分阶段 Hi-C 黑腹果蝇 胚胎群体。结果是获得一个测序文库，可在单次实验中绘制出细胞核内发生的所有染色质相互作用。胚胎分选通过荧光体视显微镜和携带核标记的转基因果蝇品系进行人工操作。利用该技术，可高度纯化地获取每个核分裂周期且细胞周期状态明确的胚胎群体。该方案也可经调整后用于分选原肠胚形成后的较晚期胚胎。分选后的胚胎作为后续实验的起始材料 原位 Hi-C。所有实验步骤，包括测序文库制备，均可在五天内完成。该方案对起始材料需求量低，仅需20个囊胚期胚胎即可稳定开展实验。最终获得适用于高通量测序的文库。测序完成后，数据可被处理为全基因组染色质相互作用图谱，利用多种现有分析工具，进一步研究拓扑关联结构域（TAD）结构、染色质环以及染色质区室在发育过程中的特征 果蝇 发育

根据本实验方案所述步骤，获得了核周期12、13和14（分别对应受精后1小时30分钟、1小时45分钟和2小时10分钟12）以及受精后3–4小时的分选胚胎群体。通过拍摄每批分选胚胎的eGFP-PCNA信号图像，可准确记录下游实验中所用每个胚胎的精确发育阶段和细胞周期状态。分选胚胎群体的示例图像见图1B-E。原位 Hi-C 实验方案的产物是可直接用于高通量测序平台测序的核苷酸文库。为满足测序要求，文库终浓度通常需达到至少2–4 nM。采用推荐的起始材料用量，可稳定达到该浓度（表1）。
经片段大小筛选后，DNA片段的预期大小分布范围为300–600 bp，在约500 bp处出现峰值(图2A)，具体分布取决于精确的打断和片段筛选参数。对于测序，我们建议采用至少75 bp长度的双端测序，以最小化基因组中无法比对的限制性片段数量。通过4亿条测序读长，可以获得分辨率为1–2 kb bin大小的高分辨率图谱。我们建议对多个生物学重复样本进行测序，每个样本测序深度约为1.5亿条读长，而不是对单个重复样本进行极高深度的测序。这种方法有助于评估生物学变异，并因PCR重复导致的废弃读长数量更少。在可视化表示时，可将重复样本的数据合并。在决定对样本进行高深度测序之前，我们建议先使用低深度测序（每个样本数百万条读长）运行样本，以确定基本的文库质量参数，如图2B所示。
Hi-C 数据的分析需要大量的计算资源和生物信息学专业知识。大致而言，成对的测序读段会独立比对到参考基因组上，随后对得到的比对结果进行质量与方向性过滤，再基于过滤后的比对结果生成特定分辨率（bin resolution）或片段水平上的接触矩阵。该接触矩阵是进一步开展下游分析（如研究拓扑关联结构域（TADs）、染色质环（loops）和区室 compartments）的基础。对于测序读段的初步分析，目前已存在多个生物信息学流程，可在无需深入掌握生物信息学知识的情况下，将原始读段处理为接触矩阵18,19,20,21,22,23。后续分析的具体方法在很大程度上取决于所研究的生物学问题，可能需要具备 R 或 Python 编程与脚本编写的丰富经验。然而，目前已有多种用于识别 TADs 的工具和算法5,24,25,26,27,28，以及可在网页浏览器中或作为独立桌面应用程序运行的 Hi-C 数据分析与可视化软件29,30,31,32。
文库处理完成后，可利用不同指标评估其质量（图2B）。首先，PCR 重复序列的比例应尽可能低，该比例是指来自同一原始分子的测序读段对的数量，以减少浪费的测序数据量。然而，即使是具有较低重复率的文库 &gt;如果对重复序列进行过滤，40%的PCR重复率仍可生成高质量的互作图谱。其次，由于读段朝向而被过滤的读段比例，如文中所述4应始终低于比对上的读段对的10%。
在果蝇（Drosophila）核周期12至14阶段的原肠胚前期发育过程中，细胞核结构发生了显著重塑33（图3）。在核周期12时，仅能检测到少量拓扑结构域（TADs），整体接触分布非常平滑，缺乏明显的特征。而在核周期13和14阶段，这一情况发生显著变化，拓扑结构域逐渐变得明显，且非特异性的长程染色质相互作用减少。
<img alt="胚胎发育阶段示意图；核周期12-14；有丝分裂期；显微镜分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57001/57001fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：分选过程中eGFP-PCNA胚胎的代表性图像。（A）收集60分钟后并在25 °C下孵育2小时的未分选胚胎群体中的eGFP-PCNA信号。（B-E）核周期12（B）、核周期13（C）、核周期14（D）以及处于同步有丝分裂阶段的胚胎（E）的分选群体示例。比例尺 = 200 µm。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57001/57001fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的高清版本。</a>
<img alt="DNA片段分析：文库1和2的荧光信号图与读段比对条形图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57001/57001fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 2"> 
图2：原位 Hi-C文库质量指标示例。（A）Bioanalyzer检测结果，显示一个成功构建的Hi-C文库（文库1，上方）与一个存在过大DNA片段峰的文库（文库2，下方）的DNA片段大小分布情况。文库2虽已成功测序，但若过大的非目标DNA片段含量更高，则可能导致测序产量下降。（B）两个Hi-C文库的过滤统计结果：图中显示因读段方向与距离（向内、向外）4 或PCR重复（重复）而被排除在后续分析之外的比对读段对数量。每个条形图中分别绘制了通过过滤（保留）和未通过过滤（被过滤）的读段数量。通过过滤的读段百分比另以文字形式标出。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57001/57001fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="染色体接触概率热图；核周期12-14；胚胎发育阶段。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57001/57001fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：来自分期胚胎的Hi-C相互作用图谱。 Hi-C相互作用图谱以10 kb分辨率分箱，并按先前所述进行平衡33。展示的是2L染色体上的一个区域。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57001/57001fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>文库</td>
			<td>时期</td>
			<td>胚胎数量</td>
			<td>打断前DNA量 (ng)</td>
			<td>PCR循环数</td>
			<td>文库终浓度 (nM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>核分裂周期12</td>
			<td>71</td>
			<td>46</td>
			<td>12</td>
			<td>28.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>核分裂周期12</td>
			<td>46</td>
			<td>40</td>
			<td>12</td>
			<td>22.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>核分裂周期12</td>
			<td>60</td>
			<td>13</td>
			<td>13</td>
			<td>12.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>核分裂周期13</td>
			<td>36</td>
			<td>39</td>
			<td>12</td>
			<td>22.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>核分裂周期13</td>
			<td>35</td>
			<td>10</td>
			<td>12</td>
			<td>5.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>核分裂周期13</td>
			<td>48</td>
			<td>18</td>
			<td>12</td>
			<td>8.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>核分裂周期14</td>
			<td>33</td>
			<td>30</td>
			<td>12</td>
			<td>39.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td>核分裂周期14</td>
			<td>24</td>
			<td>36</td>
			<td>12</td>
			<td>20.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td>核分裂周期14</td>
			<td>14</td>
			<td>8</td>
			<td>12</td>
			<td>4.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>3-4 hpf</td>
			<td>17</td>
			<td>30</td>
			<td>12</td>
			<td>24.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11</td>
			<td>3-4 hpf</td>
			<td>18</td>
			<td>42</td>
			<td>11</td>
			<td>19.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12</td>
			<td>3-4 hpf</td>
			<td>22</td>
			<td>63</td>
			<td>11</td>
			<td>48.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：代表性测序文库统计信息列表。 对于列表中的每个文库，均列出了用于文库构建的胚胎数量、通过Qubit测定的亲和捕获和片段化前的总DNA量、扩增过程中使用的PCR循环次数，以及纯化和片段大小选择后测序文库的最终浓度。

本研究描述了一种生成高分辨率图像的实验方案 原位 紧密分期的原肠胚形成前Hi-C文库 黑腹果蝇 胚胎

从精确分期的早期Drosophila胚胎中构建全基因组染色质构象捕获文库

研究染色质的三维结构可为基因调控机制提供宝贵的见解。本文中，我们描述了一种……

该方法有助于解答染色质结构领域中的关键问题，例如染色质的三维结构如何影响基因表达和发育过程。该技术的主要优势在于能够提供高分辨率的染色质结构图像以及精确分期的果蝇胚胎样本。尽管该方法可为染色质的组织方式及其在发育中的作用提供深入见解，研究者也可利用现有的转基因果蝇文库品系，检测其对染色质组织的影响。开始实验方案时，用 PBST 将先前收集的胚胎总体积调至 2 毫升。加入 6 毫升正庚烷和 100 微升 37% 的甲醛水溶液。加入甲醛后，用力上下振荡试管 1 分钟。水相和有机相将混合形成类似洗发水的质地。在旋转混合器上振荡混合物10分钟。在室温下以500 × g离心1分钟，使胚胎聚集在离心管底部。吸弃全部类似洗发液的液体，注意不要吸走任何胚胎。加入甲醛15分钟后，将胚胎重悬于5毫升含125毫摩尔甘氨酸的PBST中。剧烈上下振荡胚胎1分钟。离心后，吸除上清液。使用1,000微升移液器，将100个胚胎分批转移至适合分选的小型玻璃容器中， preferably置于深色背景下，并将其放置在冰上。使用针头或注射器尖端根据细胞核密度和细胞周期状态对胚胎进行分选。移除所有有丝分裂期的胚胎，这些胚胎可通过其弥散且非核内的EGFP-PCNA分布来识别，同时移除部分显示非核内GFP信号的胚胎。为便于分选，每批样品中应排列核周期12、13和14的参考胚胎，以便将待分选胚胎与其中一个参考胚胎进行比对匹配。使用1,000微升移液器吸取所需胚胎。将它们转移至新的离心管中，并置于冰上。继续操作直至筛选出足够用于计划实验的胚胎。在室温下以100 × g短暂离心。吸除上清液，并确保胚胎尽可能干燥以进行冷冻。将装有胚胎的离心管浸入液氮中进行速冻，随后于-80摄氏度保存。将装有冷冻胚胎的离心管置于冰上。将胚胎重悬于500微升预冷的裂解缓冲液中。静置1分钟，使胚胎沉降至管底。随后，使用预先在冰上冷却的金属微型研磨杵研磨胚胎，该研磨杵设计为与1.5毫升微量离心管紧密适配。为避免刺激胚胎，将研杵缓慢插入，直至接触管底。下压后，将研杵在两个方向各旋转两次进行研磨。然后将研杵略微提起。再次将管底沉淀物充分研磨，重复此研磨步骤10次，或直至胚胎完全裂解。溶液应呈均一状态，无任何残留的较大胚胎碎片。将匀浆后的悬液置于冰上孵育15分钟。在 4 °C 条件下以 1,000 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，通过加入 500 µL 冰冷裂解缓冲液重悬沉淀，并反复吹打混匀以洗涤沉淀。再次离心后，弃去上清液。将洗涤后的沉淀重悬于100微升0.5%十二烷基硫酸钠（SDS）中。然后将样品置于加热块中，在65摄氏度孵育10分钟，以透化细胞核。加入50微升10%Triton X-100和120微升水。轻轻弹击离心管以混匀内容物，然后将离心管置于37摄氏度的加热块中孵育15分钟。加入25微升10倍限制性酶缓冲液和20单位（5单位/微升）的MBO1。轻轻弹击离心管以混匀内容物，然后将离心管置于加热块中孵育，以消化DNA。再加入20单位的MBO1。继续孵育90分钟。第二次90分钟孵育结束后，将样品在62摄氏度下孵育20分钟，以灭活MBO1。接下来，加入 18 微升 0.4 毫摩尔的生物素 14-dATP、2.25 微升未修饰的 3.3 毫摩尔 dCTP-dGTP-dTTP 混合液，以及 8 微升每微升含 5 个单位的 DNA 聚合酶 I Klenow 片段。轻弹管壁以混匀内容物，并将样品在 37 摄氏度孵育 90 分钟。随后，加入 657 微升水、120 微升 10× T4 DNA 连接酶缓冲液、100 微升 10% Triton X-100、6 微升每毫升 20 毫克的牛血清白蛋白，最后加入 5 微升每微升含 5 个单位的 T4 DNA 连接酶。接下来，在室温下以 20 RPM 轻柔旋转离心管 2 小时。加入另外 5 微升浓度为每微升 5 个单位的 T4 DNA 连接酶。继续旋转 2 小时，然后在 2,500 ×g 下离心 5 分钟以沉淀细胞核。离心后，弃去上清液。将沉淀物重悬于500 µL提取缓冲液中，并加入20 µL浓度为20 mg/mL的蛋白酶K。轻弹离心管，混匀后孵育以消化蛋白质。加入130 µL 5 M氯化钠溶液，过夜孵育以解除交联。第二天，将样品移液至一个新的具有低DNA结合特性的2毫升离心管中。加入0.1倍体积的3摩尔醋酸钠和2微升15毫克/毫升的GlycoBlue。加入1.6倍体积的纯无水乙醇，颠倒混匀，然后将样品在-80摄氏度孵育15分钟。孵育后，离心管内溶液。通过GlycoBlue染料定位DNA沉淀。小心移除上清液，将移液枪枪头沿与DNA沉淀相对的管壁插入管内。用800微升70%乙醇洗涤沉淀。通过倒置混匀样品，并在室温下以20,000 × g离心5分钟。在此步骤及后续洗涤中，用P10吸头将残留液滴从管中推出，以去除残留液体，然后打开管盖，空气干燥最多5分钟。当无液体残留时，加入 50 µL 的 10 mM Tris 氯化物。反复吹打溶液，使其覆盖沉淀所在区域，以溶解 DNA。加入 1 µL 的 20 mg/mL RNase A。通过轻弹管壁混匀。将样品在 37 摄氏度下孵育 15 分钟以消化 RNA。最后，将样品保存在冷冻箱或冰箱中，直至进行文库制备。每批分选后胚胎的 EGFP PCNA 信号图像揭示了每个胚胎的精确发育阶段和细胞周期状态，可用于后续实验。生物分析仪图谱显示，经过片段大小筛选后，DNA片段的大小分布在300至700个碱基对之间，峰值约为450个碱基对。Hi-C相互作用图谱显示，在核周期12时，几乎检测不到拓扑关联结构域（TADs），而在核周期13和14时，TADs变得 increasingly prominent，且非特异性的长距离互作显著减少。在进行该实验操作时，需注意彻底清洗磁珠，避免不必要的长时间孵育，尤其是在高温条件下，否则可能导致Hi-C文库质量降低。这种结合了精确分期和高分辨率染色质构象作图的技术，为表观遗传学领域的研究人员探索三维染色质结构在体内发育环境中的作用铺平了道路。

generation-genome-wide-chromatin-conformation-capture-libraries-from

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

大范围早期果蝇胚胎的全基因组染色质构象捕获库的生成

我们展示了一种染色质免疫沉淀（ChIP）方法，用于鉴定小鼠胚胎组织中组织特异性基因表达启动期间或之后，组织特异性基因上的因子相互作用。该方案在正常胚胎发育过程中研究组织特异性基因激活时具有广泛的适用性。...

利用小鼠早期胚胎对组织特异性基因进行染色质免疫沉淀实验

近年来，高通量测序技术显著提高了染色质免疫沉淀（ChIP）实验的灵敏度，并推动了其在纯化细胞或显微解剖组织中的应用。本文详细阐述了一种在Drosophila组织中使用ChIP技术的方法，该方法可用于研究在一个生物学特征明确的系统中内源性染色质状态。...

使用 Drosophila 组织进行染色质免疫沉淀（ChIP）

此处我们描述一种整体荧光标记方法 原位 杂交（FISH）方案，用于确定果蝇胚胎发育期间表达的RNA的表达与定位特性， 黑腹果蝇.

完整组织 RNA 荧光 原位 杂交检测 Drosophila 胚胎

染色质调控因子和染色质状态如何影响基因组的问题 在体 对于理解发育中胚胎早期细胞命运决定机制至关重要。本文概述了在全基因组水平上研究染色质特征最常用的方法——ChIP-Seq。 非洲爪蟾...

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通过定量染色体构象捕获技术（4C）鉴定类胚体中的增强子-启动子相互作用

我们介绍一种用于分析小鼠早期胚胎中microRNA表达谱的技术。该方案克服了细胞起始量少以及小RNA富集困难的挑战。本检测方法可用于分析小鼠早期胚胎不同细胞谱系中miRNA表达随时间的变化。...

从小鼠早期胚胎中制备小RNA测序文库

光片荧光显微镜是发育生物学中最有价值的工具。在比较研究中，一个主要问题是环境变异。我们的实验方案描述了一种可同时对多个样本进行活体成像的实验框架，从而主动解决了这一问题。...

基于样品腔的光片荧光显微镜中对多个昆虫胚胎进行同步活体成像

本方案描述了染色质捕获结合高通量测序（Capture...

通过捕获式 Hi-C 解析高分辨率 3D 染色质结构 via Capture Hi-C

本文介绍一种简化的果蝇内源基因标记方法，该方法利用基于PCR的技术对成功的基因修饰进行无标记鉴定，从而促进稳定敲入品系的建立。...

一步式基于CRISPR的内源基因标记策略 黑腹果蝇

了解高分辨率原位Hi-C文库制备方法，用于研究黑腹果蝇早期胚胎的染色质三维结构及其对基因表达和发育的影响。该技术为发育生物学研究提供重要工具。

从精确分期的早期Drosophila胚胎中构建全基因组染色质构象捕获文库

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