大范围早期果蝇胚胎的全基因组染色质构象捕获库的生成

该方法有助于回答染色质体系结构领域中的关键问题，如染色质的三维结构如何影响基因表达和发育。该技术的主要优点是，它提供了染色质架构和精确舞台飞胚的高分辨率视图。虽然这种方法可以提供对染色质组织和开发的洞察，但也可以使用转基因飞库的现有线来测试其在染色质组织中的效果。

要开始使用该协议，请使用 PBST 将以前收集的胚胎的总体积调整为两毫升。在水中加入6毫升的何氨和100微升的37%甲醛。加入甲醛后，大力上下摇动管一分钟。

水性和有机相将结合形成洗发水般的一致性。在旋转搅拌器上搅拌混合物 10 分钟。在室温下以500倍g离心管，以收集管子底部的胚胎。

吸气整个洗发水样液体，并丢弃它，注意不要吸气任何胚胎。添加甲醛15分钟后，用125毫摩尔甘氨酸将胚胎重新在PBST的5毫升中。大力上下摇动胚胎一分钟。

离心后，吸上一道。使用1000微升移液器，将一批100个胚胎转移到适合分拣的小玻璃容器中，最好放在深色背景上，放在冰上。使用针头或注射器尖端按核密度和细胞周期状态对胚胎进行排序。

去除所有通过分散的、无核分布的EGFP PCNA和部分显示非核GFP信号的胚胎来识别的所有线粒体胚胎。为了帮助分选，在每批12、13和14个核周期中对参考胚胎进行排队，以匹配胚胎与其中一个参考胚胎。使用1000微升移液器将所需的胚胎移位。

将它们转移到一个新鲜的管子，并把它们放在冰上。继续，直到为计划的实验排序足够的胚胎。在室温下以100倍g的短暂旋转管。

取出上一液，确保胚胎尽可能干燥，进行冷冻。将管子淹没在液氮中，并在零下80摄氏度储存，使胚胎闪冻。将带冷冻胚胎的管子放在冰上。

将胚胎重新在500微升的冰冷解液缓冲液中。等待一分钟，让胚胎在管底安顿下来。接下来，用在冰上预冷的金属微虫研磨胚胎，该冰块设计为紧密安装1.5毫升微离心管。

为了避免搅动胚胎，缓慢插入害虫，直到它触及管子的底部。向下推，然后通过两个方向旋转两次害虫进行研磨。稍微抬起害虫。

再次推入管底，重复研磨过程 10 次，或直到胚胎完全磨合。溶液应该是同质的，不应该残留的大胚胎。在冰上孵育均质悬浮液15分钟。

在摄氏四度下旋转1000倍，5分钟。丢弃上清液，在500微升冰冷解液缓冲液中重新分解颗粒，上下移液。再旋转一次后，丢弃上经剂。

将洗涤颗粒重新注入 100 微升 0.5% 硫酸钠或 SDS 中。然后在加热块中孵育样品10分钟，使核渗透。加入 50 微升 10%Triton X100 和 120 微升水。

轻拂管子，混合内装物，在37摄氏度下在热块中孵育管子15分钟。添加 25 微升 10 倍限制性酶缓冲液和 20 个单位的 5 单位每微升 MBO1。轻拂管子混合内容物，并在热块中孵化管子以消化DNA。

再添加 20 个单位的 MBO1。继续孵育90分钟。第二次90分钟孵育后，在62摄氏度下孵育样品20分钟，使MBO1处于非活动状态。

接下来，加入18微升0.4毫摩尔生物素14-dATP，2.25微升未经改性3.3毫摩尔dCTP-dGTP-dTTP混合物，以及8微升5单位每微升DNA聚合酶 I Klenow 片段。轻拂管子混合内容物，在37摄氏度下孵育样品90分钟。接下来，加入657微升水，120微升10X T4 DNA利加糖缓冲液，100微升10%Triton X100，每毫升牛血清白蛋白6微升20毫克，最后5微升，每微升T4 DNA利塞5个单位。

接下来，在室温下以 20 RPM 轻轻旋转管，持续两个小时。再添加五微升，每微升 T4 DNA 连接五个单位。继续旋转两个小时，然后以2，500次g旋转核，持续5分钟。

离心后，丢弃上经剂。将颗粒重新吸收在500微升的提取缓冲液中，并加入20微升，每毫升蛋白质酶K.Flick管，并孵育管子以消化蛋白质。加入130微升的五摩尔氯化钠，并孵育过夜去交联。

第二天，移液将样品放入具有低DNA结合特性的新的两毫升管中。加入 0.1X 体积的三摩尔醋酸钠和两个微升每毫升 15 毫克的甘油蓝。加入1.6卷纯绝对乙醇并反转含量，然后在零下80摄氏度下孵育样品15分钟。

孵育后，将内装物离心。找到只能由糖蓝发现的DNA颗粒。小心地取出上流液，将移液器尖端沿对面的壁从 DNA 颗粒中移入管中。

用 800 微升 70% 乙醇清洗颗粒。通过倒置将样品倒置，并在室温下以2万倍g离心5分钟。在此步骤中，通过用 P10 尖端将其从管子中推出，然后打开盖子以风干长达五分钟，清除剩余的液滴。

一旦没有液体，加入50微升10毫摩尔三氯化物。反复移液溶液在颗粒位于的区域，以溶解DNA。通过轻拂管子，每毫升 RNase A.Mix 添加 20 毫克的微升。

在37摄氏度下孵育样品15分钟以消化RNA。最后，将样品存放在冰柜或冰箱中，直到库准备。每个分类胚胎批次的EGFP PCNA信号图像揭示了下游实验每个胚胎的精确阶段和细胞周期状态。

生物分析器痕迹显示，在大小选择后，DNA片段的大小分布在300到700个碱基对之间，最大分布在约450个碱基对。Hi-C相互作用图显示，在核周期12中，很少检测到拓扑相关域或TAD，当TAD日益突出且非特异性远程接触耗尽时，在核周期13和14时，这些域或TAD会发生显著变化。在尝试此过程时，重要的是要记住彻底清洗珠子，不要不必要地延长孵育时间，尤其是在高温下，因为这可能导致低质量的高 C 库。

这种结合精确分期和高分辨率染色质确认映射的技术为表观遗传学领域的研究人员探索三维染色质组织在体内发育环境中的作用铺平了道路。