Name: 鼻膜 Transepithelial 电位差的标准化测量 (NPD) (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: 学习鼻膜跨上皮电位差（NPD）的标准化测量方法，用于评估CFTR和ENaC离子通道功能。该技术可评估囊性纤维化患者的离子转运能力，并适用于其他上皮钠通道功能障碍疾病的研究。

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本研究得到了囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）功能工作组（标准化委员会，囊性纤维化临床试验网络，欧洲囊性纤维化学会）以及国家资源中心工作组（治疗开发网络，囊性纤维化基金会）的支持。此外，还获得了囊性纤维化基金会（Clancy FY09 项目资助 GMS）和美国国立卫生研究院（NIH，DK072482 项目资助 SMR 和 GMS）的额外资助。

涉及人类受试者的实验方案已获得所有参与机构研究委员会的批准。每家实施该技术的中心均有责任向其所在机构的人类研究伦理委员会提交申请并获得批准。
1. 溶液配制
<ol>
	<li>在操作前预先配制1 L批次的基础溶液#1、#2和#3，并在现场储存（见表1）。 
	注意：阿米洛利对光敏感，必须避光保存（溶液成分见表1）（详细溶液配制方法参见标准操作程序11）。
	<ol>
		<li>将所有溶液用pH 7.4缓冲，并使用0.22 µm瓶顶滤器过滤。</li>
		<li>配制溶液#3时，先加入含磷酸盐的盐类，使其充分电离以防止结晶（溶液成分见表2）。 
		注意：溶液#3的混合顺序至关重要。</li>
		<li>将这些溶液储存于4 °C（可稳定保存3个月）或-20 °C（可稳定保存6个月）。</li>
		<li>在NPD测试当天加入试剂配制溶液#4和#5。异丙肾上腺素对光和氧化敏感，在室温下会失去活性（在4–8 °C条件下4小时内活性下降4%）。储存于4 °C。 
		注意：ATP对光和氧化敏感（见表3）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>化合物</td>
			<td>分子量</td>
			<td>浓度 (mM)</td>
			<td>成分 (g/L)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>58</td>
			<td>148</td>
			<td>8.58</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 2H2O</td>
			<td>147</td>
			<td>2.25</td>
			<td>0.33</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>75</td>
			<td>4.05</td>
			<td>0.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>174</td>
			<td>2.4</td>
			<td>0.42</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2 PO4</td>
			<td>136</td>
			<td>0.4</td>
			<td>0.05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 6H2O</td>
			<td>203</td>
			<td>1.2</td>
			<td>0.24</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：溶液组成。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>化合物</td>
			<td>分子量</td>
			<td>浓度 (mM)</td>
			<td>组成 (g/L) </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na Gluconate</td>
			<td>218</td>
			<td>148</td>
			<td>33.26</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca Gluconate</td>
			<td>430</td>
			<td>2.25</td>
			<td>0.97</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K Gluconate</td>
			<td>234</td>
			<td>4.05</td>
			<td>0.95</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2 HPO4</td>
			<td>174</td>
			<td>2.4</td>
			<td>0.42</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2 PO4</td>
			<td>136</td>
			<td>0.4</td>
			<td>0.05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 7H2O</td>
			<td>246</td>
			<td>1.2</td>
			<td>0.24</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：溶液组成。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>溶液</td>
			<td>溶液编号</td>
			<td>成分</td>
			<td>EDC 标记</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ringers 注射液</td>
			<td>溶液 #1/A</td>
			<td>缓冲 Ringers 注射液</td>
			<td>RINGERS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ringers + 阿米洛利</td>
			<td>溶液 #2/B</td>
			<td>缓冲 Ringers + 100 μM 阿米洛利</td>
			<td>AMIL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>无 Cl- + 阿米洛利</td>
			<td>溶液 #3/C</td>
			<td>缓冲无 Cl- 溶液 + 100 μM 阿米洛利</td>
			<td>OCL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>无 Cl- + 阿米洛利 + 异丙肾上腺素</td>
			<td>溶液 #4/D</td>
			<td>缓冲无 Cl- 溶液 + 100 μM 阿米洛利 + 10 μM 异丙肾上腺素</td>
			<td>ISO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>无 Cl- + 阿米洛利 + 异丙肾上腺素 + ATP</td>
			<td>溶液 #5/E</td>
			<td>缓冲无 Cl- 溶液 + 100 μM 阿米洛利 + 10 μM 异丙肾上腺素 + 100 μM ATP</td>
			<td>ATP</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3：溶液列表。
2. 导管
<ol>
	<li>使用专为NPD设计的PVC材质、无菌、一次性双腔导管（内径0.7 mm），末端呈圆形且光滑（外径2.5 mm）。
	<ol>
		<li>通过距导管尖端2 mm处的侧孔与黏膜接触，导管尖端的孔用于灌注（参见步骤10.1）。</li>
		<li>将导管的两个鲁尔锁接口之一连接至测量电极，另一个连接至灌注泵。使用蓝色染色的通道作为测量腔。沿导管每0.5 cm标记一次，直至10 cm处。 
		注意：死腔体积为0.3 mL。若无法采用上述导管，建议优先按上述方法准备；若不可行，则执行接下来的两个步骤。</li>
		<li>截取等长（约76 cm）的PE50和PE90导管管路。</li>
		<li>用一段1 cm长的硅胶管将两者连接固定。将一支25 G钝头针紧密插入PE90导管的另一端，将一支25 G蝶形针紧密插入PE50导管的另一端，注意插入时不得刺穿管壁。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="双腔导管示意图；导管尖端细节；医疗设备说明。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57006/57006fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4：用于鼻电位差（NPD）测量的导管。 插图框显示了带有测量孔的导管尖端。
3. 琼脂皮肤桥（蝴蝶针）和导管的制备
注意：操作熔化的琼脂时可能导致烫伤，应谨慎进行。
<ol>
	<li>通过将3 g琼脂与100 mL溶液#1混合于广口瓶中制备3%琼脂。在微波炉中加热至溶解（透明）。
	<ol>
		<li>用温热的琼脂填充10 mL注射器。</li>
		<li>随后将注射器连接至蝶形针（23 G）和导管的标记管腔。注入琼脂直至其出现在导管尖端。</li>
		<li>冷却至少10分钟。</li>
		<li>确保皮肤桥和导管完全填充，并目视确认无气泡。</li>
		<li>将备用皮肤桥储存在4 °C的溶液#1中，且超过1周后不得使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 如果使用心电图导电膏
<ol>
	<li>按1:1（v/v）比例用溶液#1（林格氏液）稀释ECG凝胶，静置至无气泡。
	<ol>
		<li>用10 mL注射器抽取稀释后的ECG凝胶。</li>
		<li>将注射器连接至导管的标记管腔，缓慢注入ECG凝胶，直至其从下方侧孔出现。</li>
		<li>确保导管完全充满且无气泡。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 数据采集系统
注意：数据采集系统的总体设置如图5所示。
<img alt="实验室中带有生物放大器、电极和数据采集系统的生物电信号记录装置" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57006/57006fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图5"> 
图5：数据采集系统的装置示意图。 展示生物放大器和前置放大器头stage与计算机接口的连接方式，以及电极与前置放大器头stage的连接11。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57006/57006fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<ol>
	<li>连接
	<ol>
		<li>使用 USB 线缆将计算机连接到数据采集系统（材料表）。</li>
		<li>要将数据采集系统连接到生物放大器，请将 BNC 线缆从前端数据采集系统上的通道 1 输入端连接到生物放大器背面的输出端。</li>
		<li>使用一根定制线缆将生物放大器连接到前置放大器：该线缆已预先连接至前置放大器的螺丝端，并插入生物放大器前端的输入部分。</li>
		<li>将前置放大器连接至电极和接地电极。使用标准的 2 mm 雌-雌连接器将前置放大器前端与电极相连。 
		注意：接口为凹陷式设计，仅允许 2 mm 线缆单向插入：红色测量电极连接至患者鼻部（通过鼻导管）；黑色参考电极连接至患者鼻梁皮肤；白色电极连接至接地于受试者皮肤的 ECG 电极。</li>
		<li>按如下方式设置生物放大器：偏移（Offset）：拉出以激活，旋转调节，调节后保持拉出状态；电压模式：直流（DC）；1 mV 校准（1 mV cal）：置于中立位置；电源（Power）：采集数据时打开，为电池充电时关闭；增益（Gain）：设为 10；带通滤波（Band pass）：低频（外旋钮，LoFreq）：DC；高频（内旋钮，HighFreq）：1 kHz；音量（Volume）：关闭。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 调整头级偏移
<ol>
	<li>按照标准操作程序（SOP）11 中指示的顺序连接笔记本电脑和放大器。先打开数据采集系统，然后打开笔记本电脑（此顺序对于软件识别用于数据采集的设备至关重要）。
	<ol>
		<li>根据标准操作程序（SOP）的步骤调整头级偏移（Head-Stage Offset）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 偏移量
注意：需测试多个偏移量，以确保电测量系统的稳定性。（见图6）
<ol>
	<li>电极偏移设置时，将参考（负极）电极和测量（正极）电极共同置于稀释的ECG导电膏或3 M KCl溶液中。确保在前置放大器上读取到的两电极间电位差接近零。
	<ol>
		<li>设置导管和/或皮肤桥偏移时，将鼻部导管的鲁尔锁端或皮肤桥的鲁尔锁端浸入含有测量（正极）电极的浴液中。将导管的另一端放入盛有ECG导电膏或3 M KCl溶液的浴槽中，该浴槽内同时含有参考（负极）电极，并确保前置放大器上显示的电位差接近零。</li>
		<li>设置闭环偏移时，更换鼻部导管至电极浴液中需确保电路闭合。检查闭环偏移读数是否接近0 mV（即“偏移”；±2.5 mV范围内）。调节前置放大器上的偏移旋钮，使偏移值调整至0 mV。 
		注意：此步骤用于确认电路中所有连接均完好无损。若无法实现，可能表明鼻部导管存在问题（如琼脂或ECG导电膏中存在气泡）。此时应更换琼脂桥或推动装置中的ECG导电膏。必须先进行电极偏移校准，再使用电极与桥接装置进行闭环系统（闭环偏移）校准（图6）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="鼻导管电极装置示意图；包含KCl或心电图导电膏浴；用于测量电信号。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57006/57006fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 6"> 
图6： （A）电极偏移、（B）导管（或桥）偏移、（C）闭环偏移的装置示意图。
8. 注射器设置
注意：以下是推荐的设置方案。
<ol>
	<li>在测量前约1小时解冻溶液#1、#2和#3。
	<ol>
		<li>将延长管连接至靠近导管的三通阀。</li>
		<li>启动所有泵，并用溶液#1冲洗导管，彻底冲洗导管直至三通阀中无气泡残留。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. 参考电极和测量电极的放置
<img alt="带有皮下桥接的电极测量装置，用于信号检测的生物医学实验。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57006/57006fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 7"> 
图7：受试者已安装测量电极和皮下桥接，准备进行测量。
<ol>
	<li>让受试者面向NPD操作者采取坐姿。为增加舒适度，可将双脚放在可选的防静电垫上，头部置于正位视诊用的下巴托上。
	<ol>
		<li>将接地导联电极连接至放置在受试者手臂上的ECG贴片（图7）。</li>
		<li>将皮下穿刺针插入前臂背侧（琼脂系统），或在前臂先前轻微磨砂处理过的区域上涂抹ECG导电膏后贴附参考电极（见下文第7至第10步）。</li>
		<li>通过测量皮肤间的电位差（手指电位差，Finger PD），并要求受试者用拇指和食指指尖夹闭导管以封堵“测量孔”，来检查与皮下空间的连接情况。</li>
		<li>如果手指电位差未达到-30 mV或更负值，需检查蝶形针的插入情况。重复进行皮肤磨砂处理（适用于ECG导电膏系统），并检查桥接情况。</li>
		<li>启动溶液#1的注射泵，流速设为80 mL/h。先从右侧鼻孔开始。</li>
		<li>测量手指电位差，应为稳定的负电压（典型范围为-40至-80 mV）。</li>
		<li>若使用ECG导电膏系统：将ECG导电膏按1:1比例稀释，并在彻底冲洗探头孔后，将导管充满该稀释液（操作方式与琼脂系统相同）。</li>
		<li>将导管连接至一个装有约半管ECG导电膏的50 mL注射器，以浸润电极，便于检查电极偏移和桥接偏移。</li>
		<li>通过轻微且最小程度地磨砂皮肤，将参考Ag/Cl电极连接至皮下空间；当达到真皮层时，皮肤会呈现“粉红且发亮”的外观。</li>
		<li>将覆盖有ECG导电膏的测量电极放置于已磨砂处理的皮肤上。参照琼脂系统的操作方法，检查手指电位差。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
10. 基础PD的测量
<ol>
	<li>使用照明鼻镜（或同等设备）观察下鼻甲，将鼻导管插入右侧鼻孔。以下鼻甲前缘为解剖标志，推进导管至下鼻甲下方的呼吸黏膜区域。若插入困难，可将探针孔紧贴鼻腔底部放置。 
	注意：该导管具有足够的刚性，可由操作者引导进入鼻孔。为便于放置，导管的一侧通道为蓝色，并带有探针侧孔，与下鼻甲接触，可防止导管旋转。导管上标有从1到10 cm的刻度标记，可提供清晰的参考点。
	<ol>
		<li>测量下鼻甲处的PD。为此，应将导管的测量孔紧贴下鼻甲黏膜，使其完全闭合（标记为右侧基底AT）。</li>
		<li>测量下鼻道下鼻甲内侧3.0、2.0、1.5、1.0和0.5 cm处的PD：标记右侧基底PD。</li>
		<li>每次测量均需在指定距离处维持约5秒，以确保读数稳定（±1 mV），并有助于准确解读基础电位差（PD）值。</li>
		<li>重复上述步骤于左侧鼻孔，使用功能键标记左侧基底PDs（3 cm，2 cm， 等等。左侧基底AT</li>
		<li>以基础PD测量值为指导，将鼻导管探头插入信号最负的部位（位于下鼻甲前缘前方最多3 cm处），并用一小块胶带（或等效物）固定于鼻尖。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
11. NPD 追踪连续灌注
<ol>
	<li>右鼻孔
	<ol>
		<li>确认溶液是否从患者鼻腔滴出。让受试者采取舒适体位，头部略向下低垂（通常可通过让受试者将头 resting 在手上，或使用 chinrest 或其他固定装置来实现）。提醒受试者尽量减少移动，避免触碰鼻部或导管，且不要说话。</li>
		<li>开启溶液#1（Ringer液）泵（5 mL/min，或300 mL/h）。记录数据直至获得稳定值（&lt;1 mV 变化/30 秒 
		注意：达到稳定状态大约需要 3 min。</li>
		<li>关闭溶液#1的灌注。</li>
		<li>使用溶液#2（Amiloride）开始灌注。记录NPD至少3分钟（如果平台电压不明确，可继续记录至多5分钟）。</li>
		<li>使用溶液#3（无氯溶液）开始灌注，记录鼻电位差（NPD）至少3分钟（如果平台期电压不稳定，可继续记录至总共5分钟）。</li>
		<li>开始用溶液#4（异丙肾上腺素）进行灌注。记录NPD至少3分钟[如果平台期电压不稳定（电压轨迹持续稳定至少30秒之前）] &lt; 1 mV 漂移），继续记录，总时长可达 5 分钟]。</li>
		<li>使用溶液#5（ATP）开始灌注，记录NPD至少1分钟，直至获得峰值超极化反应。</li>
		<li>打开灌注，使用溶液#1（Ringer液）冲洗导管，持续30秒。</li>
		<li>关闭溶液#1的灌注。</li>
		<li>对左侧鼻孔重复上述步骤。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
12. 测试结束
<ol>
	<li>重新检查并记录稳定的指尖PD（“指尖后”）5秒。
	<ol>
		<li>移除受试者皮肤上的表皮桥和穿刺部位的绷带。对于AgCl/ECG凝胶系统，从手臂上取下电极。</li>
		<li>记录“最终闭环偏移”电压，方法同初始闭环偏移的测量（见步骤7.1.3）。</li>
		<li>使用功能键标记最终偏移值。</li>
		<li>停止数据采集（按下“开始”）。 
		注意：当前标准操作程序建议使用100 µM ATP激活嘌呤能钙依赖性Cl-分泌，作为检测的阳性对照；但此为可选测试。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

体内，鼻电位差（NPD）提供了一种独特的可重复纵向测量方法，并且通过重复测量发现，在群体和个体层面上均能观察到相似的纵向结果14,15。大量证据表明，NPD在区分囊性纤维化（CF）与非CF个体方面具有优异的判别效度。25项研究一致证明，CF患者与健康对照者之间的Cl-和Na+电导存在统计学上显著差异10。尽管已有若干先前开发的指数具备这种区分能力，但鉴于近期方法学的标准化进展，我们预计有必要对这些指数进行新的更新7,8。
修改与故障排除
该检测需要多个关键步骤以确保测量结果的准确性。这包括对电极和导管进行闭环调零，以确保系统达到推荐的标准性能。患者必须保持静止，避免说话，以尽量减少伪影和导管移位。这使得该检测在不配合的患者中实施较为困难，且该技术在6岁以下儿童中的应用仅在一项研究中被报道过7。
鼻腔上皮的预检查是必要的，以确保上皮表面无结痂或黏液，因为这些因素可能影响测量结果。
非常重要的是，必须指出，导管放置位置的选择目前仍存在争议。本文所介绍的标准操作程序（SOP）采用在下鼻甲下方（IT）进行测量。在下鼻甲下方放置导管的方法已在多中心试验中实现标准化，因此推荐使用该技术。下鼻甲下方的测量使用侧孔导管进行，但在测量过程中，该导管可能难以在接触溶液的同时与鼻黏膜保持稳固接触。其他研究团队可能选择在鼻底进行电位差（PD）测量，该方法在技术上更为简便。重要的是，Vermeulen（2011）已证实，这两种方法具有可比性16。
关于溶液是否需要加温，欧洲和美国的研究中心之间仍存在争议17,18。有研究指出，将溶液温度从22 °C升至37 °C，可使观察到的总氯离子反应增加约25%，异丙肾上腺素依赖性氯离子反应增加约95%18。然而，加温会增加实验变异性，表现为总氯离子反应的标准差更大17。因此，由于加温溶液会额外引入变异性因素，除非研究设计特别要求，一般不建议对溶液进行加温。
我们此前比较了两种电极技术，发现AgCl电极和甘汞电极系统在正常受试者的基础电流和刺激后电流中表现相似13。
该技术的局限性
该检测存在显著的个体内变异。评分的变异性在图谱结果为不确定的患者中尤为常见，因此在诊断应用中应考虑这一因素19。影响变异性的因素包括急性上呼吸道感染、广泛的鼻息肉、既往鼻窦手术以及囊性纤维化相关的炎症，这些因素会降低&#160;其特异性和敏感性20,10。此外，不同阅图者对图谱的解读可能存在差异，尽管专家阅图者在囊性纤维化和非囊性纤维化图谱的定量评分及可解读性方面表现出极好的一致性，但在图谱判读信心方面仍存在显著的变异性19。
内在变异性与显著性阈值
非常重要的是，如不同研究所表明的，该测量值的生理变异性相当显著10，例如CFTR基因治疗试验中，氯离子总转运量和阿米洛利作用范围的变化表现出显著差异21,22横断面评估表明，零氯- 高于-5至-7 mV阈值的异丙肾上腺素反应是区分囊性纤维化与非囊性纤维化受试者的临界值10.
然而，我们对于在使用疾病修饰疗法的II期临床试验中，代表有效CFTR校正的这一参数变化幅度仍缺乏明确的认识。为了评估个体反应，可能需要进行多次重复检测以监测干预措施的反应，从而将显著变化与内在变异性区分开来。尤为重要的是，未来针对疾病修饰药物的长期研究需要证明CFTR功能的改善与囊性纤维化疾病的临床相关结局或替代结局（如FEV1的改善）的改善相关。事实上，最近一项关于Ivacaftor的II期研究显示，尽管氯离子分泌仅有轻微改善，但仍表现出显著的临床获益23。
此类研究将有助于确定跨上皮氯离子（Cl-）电导的改善是否可作为临床获益的替代参数。这将是指导CFTR调节治疗药物研发的重要参数。
相较于现有方法的意义：汗液检测与肠道电流测量（ICM）
对于汗液 Cl- 浓度介于 30 至 60 mM 之间的“可疑”囊性纤维化患者，鼻电位差（NPD）综合评分提供了一种高灵敏度的工具，可用于将患者诊断为“很可能为囊性纤维化”和“不太可能为囊性纤维化”10。肠道电流测量（ICM）可对直肠上皮的净 Cl- 流动进行离体（ex vivo）检测，由于 CFTR 在该上皮中高度表达，因此该方法也可高灵敏度地测定残余 CFTR 功能。
考虑到CFTR调节剂对CFTR功能的调节作用，目前尚不明确这些不同CFTR生物标志物变化之间的关系。尽管近期基于伊伐卡托（Ivacaftor）的研究确定了鼻电位差（NPD）与汗液检测之间存在相关性4，但尚未明确呼吸道内的测量值是否比汗液检测24,25或ICM的变化更能预测呼吸系统结局。此外，调节药物在不同器官中的疗效也可能存在差异。关于鼻电位差（NPD）检测，需要注意的是，基础电位差（basal PD）和氨氯吡脒（amiloride）反应的变化反映的是Na+的转运，而0 Cl-和异丙肾上腺素（isoproterenol）反应的变化则反映Cl-的转运。目前尚不清楚这两者中哪一个对疾病改善更为重要。
该技术的未来应用
该技术的应用预期不仅限于囊性纤维化（CF）领域。由于该技术特别适用于检测钠离子（Na+）和氯离子（Cl-）通道功能，因此可应用于展示包括哮喘26、慢性支气管炎27、非囊性纤维化性支气管扩张28&#160;以及复发性胰腺炎29在内的气道疾病中的离子通道功能障碍。此外，该技术的改良版本已被用于下气道（LAPD），以揭示患有慢性支气管炎的慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者中以下气道为主的CFTR功能异常30。
鼻电位差（NPD）提供了一种敏感的体内生物标志物，用于评估CFTR功能，既可用于囊性纤维化的诊断，也可用于转化医学研究中针对纠正CFTR和ENaC通道活性的概念验证研究。该方法可对跨上皮功能进行纵向评估，并有望作为一种个体化医疗策略，为每位囊性纤维化患者量身定制最有效的CFTR功能纠正方案。

该方法的总体目标是测量鼻电位差（NPD），以研究体内跨上皮离子转运in vivo1。该技术可用于测量钠离子（Na+）和氯离子（Cl-）的转运。NPD 自 20 世纪 80 年代末以来已被用作研究工具，并于 1998 年被囊性纤维化基金会（Cystic Fibrosis Foundation, CFF）共识声明2认可为诊断方法，2017 年又被纳入囊性纤维化基金会（CFF）共识诊断指南3。事实上，导致囊性纤维化（CF）的 CFTR 生物功能障碍表现为顶端膜上 Na+ 吸收增加以及 Cl- 分泌缺陷。当遗传学检测结果不明确且患者的汗液试验结果处于不确定的中间范围时，该功能检测可作为额外的诊断工具，具有重要优势3。尽管这些信息也可通过肠道电流测量活检（ICM）获得，但 ICM 目前仅在全球少数中心可用，且尚需进一步标准化。相比之下，NPD 在全球约 60 个中心已可开展，且其检测靶点为呼吸上皮，正是该疾病的主要受累部位。
鉴于其能够提供关于CFTR活性的信息，该方法也用于概念验证研究，以评估调节剂疗法对CFTR蛋白功能恢复的效果。4,5,6,7,8。事实上，来自CFTR mRNA/基因编辑、CFTR增效剂和校正剂治疗研究的数据表明，Cl⁻- 和 Na+ 治疗性转运6,9 并证实NPD可作为临床试验中具有响应性的终点指标。由于目前缺乏能够在短期内检测患者临床状况细微变化的敏感临床终点，这一临床前生物标志物可能具有重要信息价值。CFTR调节剂疗法领域正在迅速拓展，我们迫切需要相关检测方法 体内 能够在进入大规模三期试验之前快速解析出活性化合物10.
该技术的生理学原理基于测量鼻腔气道上皮与皮下隔室之间的电位差。通过测量稳定的基线最大电位差（PD）、在阻断与ENaC相关的Na+吸收后电位差的变化，以及通过不同顶膜Cl-转运体（包括CFTR）驱动Cl-分泌所引起的电位差变化，来探究离子通道的活性。CFTR功能障碍表现为：通过cAMP依赖性通路刺激Cl-分泌时，电位差变化极小；同时ENaC介导的Na+吸收增强，表现为基线电位差更负，且对阿米洛利的反应增强。CF与正常电位差的机制基础总结于图1中。
<img alt="囊性纤维化示意图；ENaC、CFTR通道活性与电位差（PD）描记；离子转运比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57006/57006fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：离子通道活性概要图。 （A）正常个体呼吸道上皮中的离子活性，显示ENaC与CFTR的活性处于平衡状态；（B）CFTR活性丧失，导致ENaC介导的钠离子转运增强，以及CFTR依赖性氯离子转运减少。ENaC：上皮钠通道，Na+：钠离子，CFTR：囊性纤维化跨膜调节因子，Cl-：氯离子，mV：毫伏，PD：电位差，min：分钟 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57006/57006fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
然而，该检测在同一位患者多次测量之间以及相同基因型患者之间均表现出一定程度的变异性。这一点对于解释调节剂治疗后的变化尤为重要。此外，目前仍缺乏经过验证的、用于区分囊性纤维化患者与健康个体的判断阈值。这一问题部分可能源于不同临床机构在设施可及性及所采用技术方面的差异。因此，目前正在进行大量国际协作，致力于该检测的标准化工作。美国囊性纤维化基金会-治疗发展网络（CFF-TDN）和欧洲囊性纤维化学会-临床试验网络（ECFS-CTN）均已制定了用于多中心研究和科研试验的鼻电位差（NPD）标准操作程序（SOP）。近期，CTN与TDN的协作工作已形成一份整合性的国际SOP，汇集了CTN与TDN双方的专业经验（2014）11。本文介绍了将NPD用于囊性纤维化诊断或研究者发起的概念验证试验的实验方案与检测技术。各中心在实施该技术时，均有责任向本机构的人体研究伦理委员会提交申请并获得批准。
<img alt="用于数据分析的鼻腔灌注装置示意图，包含注射泵和NPD电极。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57006/57006fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：推荐的完整NPD装置示意图。 注意图中显示的是推荐配置，包括串联的灌注泵以及四通旋塞阀系统。具体连接方式和组件示例见标准操作程序（SOP）。（示意图经 Solomon, G.M. Chest, 201013 许可修改） <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57006/57006fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
实验流程如图2所示，将探索电极置于上皮表面，参考电极置于皮下空间，两者均连接至电极和高阻抗电压表，测量两者之间的自然电位差（NPD）。
这一点通过两种不同的系统来保证：存在两种可接受的参比电极装置：（i）平衡的Ag/AgCl电极，以及通过轻微磨擦连接至皮下空间的充满心电图（ECG）导电膏的桥接装置；或（ii）饱和甘汞半电池，以及皮下插入的填充琼脂的22至24号针头。与鼻黏膜的接触通过双腔导管实现。其中一个腔道填充琼脂或ECG导电膏，并连接至测量电极，另一个腔道则用于将不同溶液灌注到鼻黏膜表面。
将探查导管的尖端置于下鼻甲下方的呼吸道黏膜上（图3）。
<img alt="导管放置过程、鼻腔示意图、内窥镜视图、下鼻甲识别。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57006/57006fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：探针导管在呼吸黏膜上的放置。（A）外部视图显示放置位置。（B）鼻内镜视图展示导管放置情况。（C）示意图标明导管放置的解剖位置。PD：电位差
为了研究PD对多种药物的反应，通过导管的第二管腔施加灌流溶液。NPD测量的准备和实施包含若干关键步骤，本方案将从初始准备到数据分析逐一详细说明。
在配制溶液和制备电极后，对电极和导管进行充分的质量检测，以确保测试的基本顺利进行。首先在下鼻甲处进行基础测量，以确定最佳测量位置，通常选择测得电位最负的部位。随后通过序贯灌注确定Na+ (ENaC) 和 Cl- 通过鼻上皮细胞层电压的变化来检测（CFTR依赖性）离子流。

<table><tbody><tr><td>KD Scientific 注射泵（或同等产品 &amp;ndash; 例如机构/医院提供的可编程注射泵）</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Powerlab 4/30</td><td>AD Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BMA-200 交流/直流便携式生物放大器</td><td>AD Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BMA-200 配套的 IS0-Z 隔离前置放大器</td><td>AD Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>兼容 Windows 的个人电脑 — 最低系统要求为 Windows XP 或更高版本</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AD Instruments 软件：GLP Client V6（Windows）或更高版本</td><td>AD Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>心电图电极（受试者接地用）</td><td>医院标准</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 个微型甘汞参比电极</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-620-79</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾 KCl，颗粒状 &amp;ndash; 符合美国药典（USP），分子量 76，数量：500 克</td><td>Spectrum</td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌容器（如标本收集容器或类似容器），用于 KCl 甘汞电极浴，容器盖上需开孔以固定电极（若电极制造商未提供）</td><td>医院标准</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 个电极：Ag/AgCl 8 mm TP 电极</td><td>BIOPAC Systems</td><td>UNSHLD-EL258</td><td></td></tr><tr><td>2 个 Ag/AgCl 电极，B0194，插头 4 mm</td><td>SLE Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Signacreme&amp;reg; 导电电极膏</td><td>Fisher Scientific</td><td>Parker Labs 货号 # 17-05</td><td></td></tr><tr><td>皮肤去角质装置</td><td>PROMED Feeling</td><td>Ref 374901</td><td></td></tr><tr><td>Hi Di 541 M，金刚石尖牙科磨头</td><td>Ash Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Becton Dickinson PE 50 导管</td><td>Fisher Scientific</td><td>427411</td><td></td></tr><tr><td>Becton Dickinson PE 90 导管</td><td>Fisher Scientific</td><td>427421</td><td></td></tr><tr><td>硅胶导管，内径 0.062&amp;rdquo;，外径 0.095&amp;rdquo;</td><td>Fisher Scientific</td><td>508-007</td><td></td></tr><tr><td>Micropore 外科纸胶带（25 mm × 9.1 m）</td><td>3M</td><td>1530-1</td><td></td></tr><tr><td>Marquat 双腔导管 长度：80 cm；外径：2.5 mm；通道内径：0.8 mm；侧孔距导管尖端距离：2 mm。欧盟 NPD 标签协议：I0202US</td><td>Marquat</td><td>I0202US</td><td></td></tr><tr><td>1&quot; × 10 码丝质胶带</td><td>3M Durapore</td><td>1538-1</td><td></td></tr><tr><td>静脉延长导管（30&quot;，50/盒）</td><td>International Limited</td><td>IMN30</td><td></td></tr><tr><td>三通止流阀（50/盒）</td><td>Medex</td><td>MX5311L</td><td></td></tr><tr><td>无菌注射器滤器（ANOTOP 25 无菌，50 个装；0.22-&amp;mu;m 或更小孔径滤器；或同等产品）</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-926-7</td><td></td></tr><tr><td>Becton Dickinson Intramedic Luer 接头（20 G，用于连接 PE90，适用于研究现场制备的鼻导管）</td><td>Fisher Scientific</td><td>427564</td><td></td></tr><tr><td>Becton Dickinson 23 G，0.75&amp;rdquo; Vacutainer（&amp;ldquo;蝶形&amp;rdquo;）针头（0.6 mm × 19 mm；50 支/盒）（用于连接 PE50，适用于研究现场制备的鼻导管）</td><td>Fisher Scientific</td><td>367283</td><td></td></tr><tr><td>Becton Dickinson 60 mL 无针 Luer-Lok 接头注射器（40/盒）</td><td>Fisher Scientific</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>Becton Dickinson 10 mL 无针 Luer-Lok 接头注射器（100/盒）</td><td>Fisher Scientific</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>一次性无菌擦拭巾（根据机构供应情况）</td><td>医院标准</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% 乙醇（1 品脱），Aaper Alcohol and Chemical Co. 货号 NC9274019（或同等产品）</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning 一次性无菌瓶口滤器，孔径 0.22 &amp;mu;m（容积 0.15 &amp;ndash; 1.0 L 可接受）</td><td>Fisher Scientific</td><td>430624</td><td></td></tr><tr><td>Buffer Cert pH 10.00（1 L Sn04332）&amp;ndash; 用于 pH 计校准</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buffer Cert pH 4.00（1 L Sn04327）&amp;ndash; 用于 pH 计校准</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buffer Cert pH 7.00（500 mL Sn04328）&amp;ndash; 用于 pH 计校准</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>一次性防护垫（蓝色垫；23&quot; × 36&quot;，150/盒；或按医院标准同等产品）</td><td>SureCare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>23 G，0.75&amp;rdquo; Vacutainer &amp;ldquo;蝶形&amp;rdquo;针头（0.6 mm × 19 mm；50 支/盒）</td><td>Becton Dickinson</td><td>367283</td><td></td></tr><tr><td>Difco Laboratories 琼脂（Noble 100 g 0142-15-2；或同等产品）</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Welch Allyn 鼻镜 71000-C（或同等产品）</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Welch Allyn 可转换手柄电池 72300（或同等产品）或带电池的耳镜</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>头部和下颌托架（或同等产品；可选）</td><td>Richmond Products, Inc</td><td>629R</td><td></td></tr><tr><td>防静电抗疲劳地垫&amp;nbsp;（或同等产品）</td><td>Fisher Scientific</td><td>No. 791</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;现场配制溶液所用试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯化钠，颗粒状 &amp;ndash; USP NaCl</td><td>Spectrum</td><td></td><td>分子量：58；规格：500 克</td></tr><tr><td>氯化钙 CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; &amp;bull;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O &amp;ndash; USP</td><td>Spectrum</td><td></td><td>分子量：147；规格：500 克</td></tr><tr><td>六水合氯化镁晶体，MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;bull;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O &amp;ndash; USP</td><td>Spectrum</td><td></td><td>分子量：203；规格：500 克</td></tr><tr><td>磷酸氢二钾，无水，颗粒状，KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; &amp;ndash; USP</td><td>Spectrum</td><td></td><td>分子量：174；规格：500 克</td></tr><tr><td>磷酸二氢钾晶体 &amp;ndash; 符合美国国家处方集（NF）（KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;）</td><td>Spectrum</td><td></td><td>分子量：136；规格：500 克</td></tr><tr><td>葡萄糖酸钠- USP（单钠盐）</td><td>Spectrum</td><td></td><td>分子量：218；规格：500 克</td></tr><tr><td>葡萄糖酸钙 &amp;ndash; USP（无水粉末）</td><td>Spectrum</td><td></td><td>分子量：430；规格：500 克</td></tr><tr><td>葡萄糖酸钾- USP（无水）</td><td>Spectrum</td><td></td><td>分子量：234；规格：500 克</td></tr><tr><td>七水合硫酸镁 &amp;ndash; USP MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Spectrum</td><td></td><td>分子量：246；规格：500 克</td></tr><tr><td>阿米洛利盐酸盐 &amp;ndash; USP</td><td>Spectrum</td><td></td><td>分子量：302；规格：5 克</td></tr><tr><td>腺苷 5&amp;rsquo;-三磷酸（ATP）（二钠盐）</td><td>Spectrum</td><td></td><td>分子量：551；规格：5 克</td></tr><tr><td>六水合氯化镁，晶体 &amp;ndash; USP MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;bull;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Spectrum</td><td></td><td>分子量：203；规格：500 克</td></tr><tr><td>双蒸水（ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O）</td><td>医院药房</td><td></td><td>分子量：NA；规格：1 L</td></tr><tr><td>异丙肾上腺素盐酸盐注射液 - USP 1 mg/5 mL 安瓿</td><td>医院药房</td><td></td><td>分子量：248；规格：单次使用</td></tr><tr><td>林格氏注射液，USP 或林格氏灌洗液</td><td>医院药房</td><td></td><td>分子量：NA；规格：5 L</td></tr></tbody></table>

标准化鼻黏膜跨上皮电位差（npd）测量方法

Standardized Measurement of Nasal Membrane Transepithelial Potential Difference (NPD)

我们描述了一种标准化的鼻电位差（nasal potential difference, NPD）测量方法。该技术通过向鼻腔上皮表面灌注可调节离子通道活性的溶液，监测鼻上皮电压的变化，从而评估囊性纤维化跨膜传导调节因子（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, CFTR）和上皮钠通道（epithelial sodium channel, ENaC）的功能。该方法通过测量鼻腔内皮下 compartment 与气道上皮之间的电位差实现，利用与下鼻甲接触的导管进行检测。
该检测可测量在灌注100 µM阿米洛利（一种在林格液中抑制Na+重吸收的抑制剂）后稳定的基线电压，以及随后的净电压变化；接着使用含阿米洛利的无氯溶液以诱导氯离子分泌，最后在含阿米洛利的无氯溶液中加入10 µM异丙肾上腺素，以刺激与囊性纤维化跨膜电导调节因子（CFTR）相关的环磷酸腺苷（cAMP）依赖性氯离子电导。
该技术的优势在于能够展示呼吸道上皮表面液体水合作用中两个关键组分——ENaC 和 CFTR——的电生理特性。因此，它是用于研究靶向调控 CFTR 和 ENaC 活性的药物在囊性纤维化（CF）肺病治疗中第二阶段及概念验证试验的一项有用研究工具。此外，当基因检测和汗液检测结果不明确时，该技术也是确认 CFTR 功能障碍的关键后续检测手段。与汗液氯离子检测不同，该检测相对更耗时且成本较高，同时要求操作者接受专门培训并具备相应技术专长才能有效实施。已有报道指出，该技术在受试者间和同一受试者内的重复性存在变异，尤其在年幼儿童或不配合的受试者中更为明显。为应对这一问题，近年来已通过一种经过验证的算法显著改进了结果判读的准确性。

在正常的气道上皮中，Na+吸收是主要的离子转运活动。这导致气道表面相对于间质呈负电位差。灌注ENaC通道阻滞剂阿米洛利后，电位差的负值减小。随后，用无Cl-溶液进行表面灌流，形成Cl-的化学梯度，使电位差更负，并激活所有Cl-转运体，包括CFTR。异丙肾上腺素可升高细胞内cAMP水平，通过特异性激活CFTR进一步增加Cl-分泌，从而加大电位差。
相比之下，在囊性纤维化（CF）患者中，CFTR 缺失或功能异常导致ENaC介导的Na⁺吸收增加+ 吸收12因此，基础电位差更负。应用阿米洛利后观察到的去极化程度更大，而在刺激Cl⁻分泌时，电位差的变化极小或无变化。- 通过CFTR依赖性途径的分泌。这可以在代表性轨迹图中观察到 图8，显示“健康”与“囊性纤维化（CF）”的波形图。
<img alt="跨上皮电压测量；阿米洛利作用；图表比较健康对照与F508del突变个体。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57006/57006fig8.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图8"> 
图8：健康受试者与囊性纤维化（CF）受试者的代表性记录图。 PD：电位差，ΔAmiloride：阿米洛利引起的电位差变化，0 Cl-/Iso-：低氯溶液：溶液#2灌注结束至溶液#4灌注结束期间电位差的变化，S1-S4：阶段1-4，图A和图B中的绿色线条表示鼻电位差（NPD）记录，黑色箭头表示电位差的变化

本文介绍了一种测量鼻电位差（NPD）的标准方案。通过灌注可调节离子通道活性的溶液，测定鼻黏膜上皮电压的变化，从而评估囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）和上皮钠离子通道（ENaC）的功能，获得相应的检测结果。

标准化鼻黏膜跨上皮电位差（NPD）测量方法

我们描述了一种标准化的鼻电位差（NPD）测量方法。该技术中，囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）……

该方法有助于解答囊性纤维化（CF）和离子转运领域中的关键问题，即囊性纤维化患者是否能够对CFTR功能的激活或恢复产生有意义的生理反应。该技术的主要优势在于，它能够测量气道上皮中CFTR与上皮钠离子通道的协同活动。尽管该方法可为囊性纤维化的研究提供深入见解，但也适用于其他疾病体系，例如上皮钠离子通道功能亢进的遗传性疾病。本次实验操作将由生物学家Thao Nguyen和Aur

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鼻膜 Transepithelial 电位差的标准化测量 (NPD)

外加电场会在细胞膜上诱导产生电压，称为诱导膜电压（ΔΦ）。通过使用电位敏感染料di-8-ANEPPS，可以无创地测量ΔΦ。本视频展示了使用di-8-ANEPPS测量ΔΦ的实验方案。...

使用Di-8-ANEPPS测量诱导膜电压

本文描述了鼻腔和支气管吸收技术的应用，特别是使用合成吸收基质（SAM）来采集上、下呼吸道的黏膜衬液（MLF）。这些方法相较于现有的呼吸道采样技术具有更高的标准化程度和耐受性。...

鼻腔与支气管液体的吸收：人体呼吸道黏膜的精确采样及样本实验室处理

本文介绍了一种用于测量小鼠鼻电位差的实验方案。该检测方法可定量分析跨膜离子转运蛋白（如囊性纤维化跨膜传导调节因子和上皮钠离子通道）的功能，对于评估囊性纤维化新型疗法的有效性具有重要价值。...

小鼠鼻上皮电位差测定法量化跨上皮离子转运

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利用Ussing腔室技术对原生组织中肠紧密连接屏障功能及离子通透性的功能评估

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本文介绍了在气液界面条件下原代人鼻上皮（HNE）细胞的分离、扩增与分化方法，以及一种可成功冻存并复苏扩增后HNE细胞的生物样本库保存方案。该方案可分析分化后的HNE细胞的电生理特性，以及在不同调节剂处理下CFTR相关的氯离子分泌功能的纠正情况。...

原代人鼻上皮细胞：精准医学背景下的生物样本库建设

鼻腔上皮是所有呼吸道病原体首先接触的主要屏障部位。本文概述了利用气液界面（ALI）培养的原代鼻腔上皮细胞，以在生理相关系统中表征人类冠状病毒与宿主相互作用的方法。...

在气液界面培养的原代鼻上皮细胞感染模型中表征人冠状病毒与宿主相互作用

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基于多孔基底的电穿孔结合跨上皮电阻监测

气液界面培养常用于通过分化原代正常人支气管上皮细胞来构建假复层气道上皮，以模拟肺气道的顶面结构。本文介绍一种通过监测其生物物理特性（如纤毛功能和膜完整性）来评估其质量的简便方案。...

测定假复层肺气道上皮的纤毛功能与膜不通透性

本文介绍了一种实验方案，用于组装、电刺激并分析掺有短杆菌肽A的液滴界面双层膜。通过测量膜面积、离子流和单通道电导的变化，并将这些响应与受电突触启发的膜模型中类似可塑性的离子传导变化相关联，从而量化脂质-蛋白质的结构-功能关系。...

利用液滴界面双层膜表征脂质-蛋白质膜的结构与功能

学习鼻膜跨上皮电位差（NPD）的标准化测量方法，用于评估CFTR和ENaC离子通道功能。该技术可评估囊性纤维化患者的离子转运能力，并适用于其他上皮钠通道功能障碍疾病的研究。

标准化鼻黏膜跨上皮电位差（NPD）测量方法

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